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Developmental Biology

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Abstract

Le ciglia primarie (PC) sono organelli dinamici non mobili a base di microtubuli che sporgono dalla superficie della maggior parte delle cellule di mammifero. Emergono dal centriolo più vecchio durante la fase G1/G0 del ciclo cellulare, mentre si disassemblano quando le cellule rientrano nel ciclo cellulare al limite di fase G2/M. Funzionano come hub di segnale, rilevando e trasducendo segnali extracellulari cruciali per molti processi cellulari. Simile alla maggior parte dei tipi di cellule, tutte le cellule staminali neurali neocorticali e progenitrici (NSPC) hanno dimostrato di ospitare un PC che consente loro di percepire e trasdurre segnali specifici necessari per il normale sviluppo corticale cerebrale. Qui, forniamo protocolli dettagliati per generare e caratterizzare modelli cellulari bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D) da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) per sezionare ulteriormente il coinvolgimento del PC durante lo sviluppo neocorticale. In particolare, presentiamo protocolli per studiare la biogenesi e la funzione del PC in NSPC derivati da rosette neurali 2D, inclusa la trasduzione del percorso Sonic Hedgehog (SHH). Per sfruttare l'organizzazione tridimensionale (3D) degli organoidi cerebrali, descriviamo un metodo semplice per l'imaging 3D di organoidi cerebrali immunocolorati in toto . Dopo la compensazione ottica, la rapida acquisizione di interi organoidi consente il rilevamento sia di centrosomi che di PC su progenitori neocorticali e neuroni dell'intero organoide. Infine, descriviamo in dettaglio la procedura per l'immunocolorazione e la pulizia di spesse sezioni organoidi fluttuanti che preservano un grado significativo di informazioni spaziali 3D e consentendo l'acquisizione ad alta risoluzione necessaria per l'analisi qualitativa e quantitativa dettagliata della biogenesi e della funzione del PC.

Introduction

Le ciglia primarie (PC) sono organelli a base di microtubuli che percepiscono e trasducono una pletora di segnali chimici e meccanici dall'ambiente extracellulare. In particolare, il PC è l'organello centrale per la trasduzione della via di segnalazione hedgehog nei vertebrati1,2. Mentre la maggior parte delle cellule neurali ha dimostrato a lungo di ospitare un PC, il contributo di questo organello nel modellare il sistema nervoso centrale è stato a lungo sottovalutato. Gli studi sullo sviluppo neocorticale hanno portato alla scoperta di cellule staminali neurali multiple e progenitrici (NSPC), tutte dotate di PC, la cui posizione è stata proposta come cruciale per la determinazione del destino progenitore3,4,5,6,7. Il PC si è dimostrato cruciale per i meccanismi cellulari necessari per il normale sviluppo corticale cerebrale, tra cui l'espansione e l'impegno NSPC8,9,10,11,12 e la polarità apicobasale dello scaffold gliale radiale che supporta la migrazione neuronale13. Inoltre, i PC sono necessari durante la migrazione tangenziale degli interneuroni alla piastra corticale14,15. Infine, è stato proposto un ruolo per il PC nella creazione di connessioni sinaptiche dei neuroni nella corteccia cerebrale16,17. Complessivamente, questi risultati sostengono un ruolo cruciale della PC nelle fasi principali dello sviluppo corticale cerebrale18,19 e sollevano la necessità di indagare il loro coinvolgimento nei meccanismi patologici alla base delle anomalie dello sviluppo corticale cerebrale.

Studi recenti hanno ampiamente migliorato la nostra comprensione di importanti differenze cellulari e molecolari tra lo sviluppo corticale in modelli umani e animali, sottolineando la necessità di sviluppare sistemi modello umani. In questa prospettiva, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hIPSC) rappresentano un approccio promettente per studiare la patogenesi della malattia in un contesto genetico e cellulare rilevante. I modelli cellulari bidimensionali aderenti (2D) o rosette neurali contengono NSPC simili a quelli osservati nella corteccia cerebrale in via di sviluppo, che si organizzano in strutture a forma di rosetta che mostrano una corretta polarità apicobasale20,21,22. Inoltre, il sistema di coltura tridimensionale (3D) consente la generazione di organoidi del proencefalo dorsale che ricapitolano molte caratteristiche dello sviluppo corticale cerebrale umano23,24,25,26. Questi due approcci complementari di modellazione basati su cellule offrono prospettive entusiasmanti per sezionare il coinvolgimento del PC durante lo sviluppo normale e patologico della corteccia cerebrale.

Qui forniamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di rosette neurali e NSPC derivati, nonché organoidi del proencefalo dorsale. Forniamo inoltre protocolli dettagliati per analizzare la biogenesi e la funzione dei PC presenti sulle NSPC testando la trasduzione del percorso Sonic Hedgehog e analizzando la dinamica delle molecole cruciali coinvolte in questo percorso. Per sfruttare l'organizzazione 3D degli organoidi cerebrali, abbiamo anche impostato un metodo semplice ed economico per l'imaging 3D di organoidi cerebrali immunocolorati in toto che consente una rapida acquisizione, grazie ad un microscopio a foglio luminoso, dell'intero organoide, con alta risoluzione che consente di visualizzare il PC su tutti i tipi di progenitori neocorticali e neuroni dell'intero organoide. Infine, abbiamo adattato l'immunoistochimica su sezioni fluttuanti da 150 μm con successiva pulizia e acquisizione utilizzando il microscopio confocale a scansione risonante che consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione, necessaria per l'analisi dettagliata della biogenesi e della funzione del PC. In particolare, il software di imaging 3D consente la ricostruzione 3D del PC con successiva analisi dei parametri morfologici tra cui lunghezza, numero e orientamento del PC, nonché la misurazione dell'intensità del segnale dei componenti ciliari lungo l'axoneme.

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Protocol

1. Generazione di modelli cellulari 2D hIPS di sviluppo neocorticale

  1. Formazione di rosette neurali
    1. Inizia con le colture hIPSC che ospitano grandi colonie regolari, mostrando meno del 10% di differenziazione e non più dell'80% di confluenza.
    2. Risciacquare le hIPSC con 2 ml di PBS.
    3. Aggiungere 2 mL di mezzo di induzione NSPC integrato con l'inibitore Rock (NIM + 10 μM di Y-27632).
    4. Sezionare manualmente ogni colonia hIPSC da un piatto da 35 mm usando un ago per tagliare ogni colonia con precisione in direzioni orizzontali e verticali per creare un modello a scacchiera che divide ogni colonia in gruppi uguali.
    5. Staccare la colonia usando un raschietto cellulare e trasferirli su un piatto da 35 mm ad attacco ultra-basso.
    6. Lasciateli galleggiare durante la notte (ON) in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2, in modo che possano formare corpi embrioidi (EB).
      NOTA: i corpi embrioidi (EB) sono definiti come cluster sferoidi fluttuanti o aggregati di hIPSC.
    7. Trasferire gli EB in piatti da 35 mm rivestiti con poli-L-ornitina/laminina (PO/lam) in 2 mL NIM + 10 μM di Y-27632.
    8. Aggiornamento giornaliero del mezzo di induzione NSPC (NIM senza Y-27632) fino alla formazione di rosette neurali che richiede circa 12-14 giorni. Controllare al microscopio.
      NOTA: Dopo questa fase le rosette neurali possono essere espanse, differenziate ed elaborate per l'analisi immunocolorante o dissociate per ottenere cellule staminali neurali isolate e progenitrici (NSPC).
  2. Espansione della rosetta neurale e differenziazione precoce
    1. Taglia le rosette neurali in uno schema a griglia con un ago e sposta i grappoli usando un raschietto cellulare.
    2. Trasferire le rosette in una piastra a 4 pozzetti contenente un coperchio di vetro rivestito con PO/lam (4-5 rosette/pozzetto) in 0,5 mL di mezzo di manutenzione NSPC (NMM).
    3. Incubare la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
    4. Aggiorna NMM a giorni alterni fino al giorno 20.
    5. Dal giorno 20, le rosette neurali di coltura in 0,5 mL di citochine hanno impoverito NMM per consentire la differenziazione. Aggiorna il mezzo ogni 2-3 giorni.
    6. Al giorno 30 e al giorno 40 (10 o 20 giorni di differenziazione), fissare le rosette con 0,5 ml di PFA al 4%, 20 minuti, RT.
  3. Biogenesi pc e analisi funzionale su NSPC isolati
    1. Dissociazione NSPC
      1. Tagliare le rosette neurali dal passaggio 1.1.8 in uno schema a griglia con un ago e rimuovere i grappoli usando un raschietto cellulare. Trasferire le cellule in piastre da 35 mm rivestite di PO/lam in 2 ml di NMM e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
      2. Aggiornare NMM a giorni alterni fino alla confluenza (circa 5-7 giorni).
      3. Dopo aver raschiato via le grandi e chiare cellule che circondano le rosette neurali, raccoglierle manualmente e trasferirle su piatti da 35 mm freschi rivestiti di PO / lam per arricchire le NSPC e esaurire i tipi di cellule non neurali.
      4. Dopo uno o due passaggi manuali (ripetere il passaggio 1.3.1.3, se necessario) necessari per rimuovere tutti i tipi di cellule contaminanti, rimuovere il mezzo e risciacquare con PBS.
      5. Aggiungere 300 μL di tripsina allo 0,05% e incubare per 5 minuti a 37 °C fino a quando la maggior parte delle cellule si stacca.
      6. Aggiungere 2 ml del mezzo contenente il 10% di FBS (DMEM + 10% FBS) per inattivare la tripsina. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù tre volte per rompere i grumi cellulari.
      7. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
      8. Aspirare accuratamente il surnatante e risospese le cellule in NMN.
      9. Seminare gli NSPC dissociati come singole cellule (1 x 105 cellule/cm2) in NMM su piatti rivestiti di PO/lam e incubarli in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
      10. Espandi NSPC in NMM cambiando il mezzo a giorni alterni.
        NOTA: gli NSPC sono seminati ad alta densità per evitare differenziazioni.
    2. Analisi della biogenesi del PC
      1. Seminare NSPC dissociati a 100.000 cellule/cm2 e incubarli in un incubatore umidificato a 37 °C e co2 al 5% in NMM per 2 giorni.
      2. Aspirare il mezzo e affamare le NSPC nel mezzo impoverito di citochine (mezzo di fame NSPC, Tabella supplementare 1) per 48 ore.
      3. Correggi NSPC con PFA al 4% per 20 minuti a RT.
      4. Lavare due volte con PBS per 5 minuti a RT prima dell'immunocolorazione.
    3. Analisi delle funzioni del PC: percorso di segnalazione SHH
      1. NSPC dissociati con semi a 100.000 cellule/cm2 su vetrini a 8 camere rivestiti di PO/lam (300 μL) o piatti T25 (5 ml) e incubano in un incubatore umidificato a 37 °C e CO2 al 5% in NMM per 2 giorni.
      2. NSPC affamati in mezzo di fame NSPC (300 μL per pozzetto di slitta a 8 pozzetti e 5 mL in pallone T25) per 48 ore.
      3. Per indurre la via SHH, incubare le NSPC con il mezzo di fame integrato con SHH ricombinante (100 ng/mL) o SAG (500 nM); (150 μL per pozzetto di uno scivolo a camera a 8 pozzetti e 2 mL in pallone T25) per 24 ore.
      4. Fissare NSPC coltivati su vetrini a camera a 8 pozzetti in 250 μL di PFA al 4% per pozzetto per 20 minuti a RT e lavarli due volte con 250 μL di PBS per 5 minuti a RT prima dell'analisi immunocolorante.
      5. Rimuovere il mezzo e lavare gli NSPC coltivati in piatti T25 con PBS.
      6. Aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,05% e incubare per 5 minuti a 37 °C fino a quando le cellule si staccano.
      7. Aggiungere 2 mL di mezzo contenente il 10% di FBS (DMEM + 10% FBS) per inattivare la tripsina e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL.
      8. Centrifugare a 300 x g per 5 min e aspirare accuratamente il surnatante per ottenere pellet NSPC che possono essere crioconservati a -80 °C prima dell'estrazione dell'RNA e dell'analisi RT-PCR.

2. Generazione di organoidi del proencefalo dorsale

  1. Coltura unicellulare di hIPSC
    1. Inizia con le colture hIPSC che ospitano grandi colonie regolari che mostrano una differenziazione inferiore al 10% e che sono state passate quasi una volta. Assicurarsi che le cellule non siano confluenti per più dell'80%.
    2. Lavare le colonie con 2 ml di PBS.
    3. Aggiungere 500 μL di Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) e incubare per 5-7 minuti a 37 °C.
    4. Aspirare il GCDR e aggiungere 2 mL di mTeRS1 medium integrato con 5 μM di Y-27632.
    5. Pipettare delicatamente le cellule su e giù 10 volte per dissociare tutte le colonie in singole cellule.
    6. Trasferire le cellule su piatti rivestiti in vitronectina e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
      NOTA: Eseguire almeno 1 passaggio delle hIPSC utilizzando GCDR prima dell'esperimento di differenziazione per adattare le hIPSC alle condizioni di coltura monocellulare.
  2. Il giorno 0, consentire alle hIPSC di formare corpi embrionali in mezzo EB contenenti una bassa concentrazione di FGF2 e un'alta concentrazione di inibitore della roccia necessaria per la sopravvivenza all'hIPSC. Per fare ciò, segui i passaggi seguenti.
    1. Lavare le colonie con 2 ml di PBS.
    2. Aggiungere 500 μL di Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) e incubare per 5-7 minuti a 37 °C.
    3. Aspirare il GCDR e aggiungere 1 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632; Utilizzare una pipetta da 1 mL per staccare delicatamente le cellule e trasferirle in un tubo conico da 15 mL.
    4. Risciacquare ancora una volta con 2 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632, trasferire le cellule rimanenti nel tubo conico da 15 mL. Aggiungere immediatamente 3 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632 al tubo conico e omogeneizzare delicatamente la soluzione utilizzando una pipetta da 5 mL.
    5. Centrifugare le cellule dissociate a 100 x g per 5 min.
    6. Aspirare delicatamente il surnatante e risospese le cellule in 6 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632.
    7. Centrifugare le celle a 100 x g per 5 min.
    8. Aspirare il surnatante e risospese le cellule in 1 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632. Utilizzare una pipetta da 1 mL per dissociare delicatamente le cellule in una sospensione a cella singola.
    9. Immediatamente dopo aver risospeso le cellule, diluirle e contarle.
    10. Diluire il volume corretto di sospensione cellulare (contenente 900.000 cellule) in 30 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632 e 4 ng/mL di bFGF e mescolare delicatamente la soluzione.
    11. Piastra 9.000 celle/pozzo in una piastra 96U di attacco ultra-bassa (300 μL/pozzetto). Per evitare fastidiose emissioni di EB, incubare la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2 fino al Giorno 3 senza cambio di mezzo.
  3. Induzione neurale (doppia inibizione SMAD)
    1. Il giorno 3, assicurati che gli EB misurino 300-400 μm e mostrino bordi regolari. Se vengono raggiunti entrambi i criteri, sostituire metà del mezzo (150 μL) con un mezzo di induzione-1 contenente inibitori SMAD doppi, portando a un illuminamento del contorno degli EB dal giorno 6 al giorno 7 indicando differenziazione neuroectodermica (Tabella supplementare 2).
    2. Il giorno 4, sostituire 3/4 del mezzo (225 μL) con il mezzo di induzione-1.
    3. Il giorno 6 e il giorno 8: rinfrescare metà dell'induzione media-1 (150 μL).
  4. Incorporamento di organoidi nella matrice della membrana basale (Giorno 10)
    1. Il giorno 10, incorporare gli EB nella matrice della membrana basale ridotta del fattore di crescita (BMM).
      NOTA: Da questo passaggio, utilizzare sempre forbici sterili per tagliare l'apertura delle punte delle pipette per evitare di danneggiare gli organoidi mediante ripetuti pipettaggio.
    2. Primo trasferimento di circa 15-17 organoidi in tubi conici. Lascia che gli EB si depositino e rimuovi il mezzo. Aggiungere 50 μL di media-2 di induzione e trasferirli in un tubo microcentrifuga contenente 100 μL di BMM.
    3. Distribuire la miscela matrice-EB sul centro di un pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa e separare gli EB per evitare che si fondano.
    4. Lasciare solidificare il BMM nell'incubatore a 37 °C per 45 min.
    5. Aggiungere 3 mL di induzione medium-2 in ogni pozzetto e mettere la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
      NOTA: Assicurarsi che questa procedura venga eseguita il più rapidamente possibile poiché BMM si solidifica a temperatura ambiente.
  5. Coltura stazionaria di organoidi incorporati nella matrice della membrana basale
    1. Giorno 12, 14: Aggiornamento induzione media-2.
    2. Giorno 16: Aggiornare l'induzione media-2 e controllare al microscopio l'espansione delle anse neuroepiteliali.
  6. Dissociazione e coltura della matrice della membrana basale su uno shaker orbitale
    1. Il giorno 17, dissociare gli organoidi dal BMM pipettando su e giù 10 volte con una pipetta da 5 ml e trasferirli in differenziazione media-1 (senza vitamina A). Incubare su uno shaker orbitale a 80 giri/min in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2 per migliorare l'assorbimento nutrizionale.
      NOTA: Utilizzare un incubatore diverso per la coltura stazionaria e la coltura su uno shaker orbitale per evitare vibrazioni dannose per la crescita delle cellule hIPS aderenti.
    2. Giorno 19: Aggiornamento differenziazione medio-1.
    3. Giorno 21: Cambiare la differenziazione da medio-1 a differenziazione da media-2 (con vitamina A).
    4. Dal giorno 23 al giorno 35: aggiorna il mezzo con differenziazione medio-2 ogni 2-3 giorni.
    5. Dal giorno 35 al giorno 70: aggiorna la differenziazione medio-2 con l'1% di BMM e aggiorna ogni 2-3 giorni.
    6. Raccogliere gli organoidi dopo 28, 42 e 70 +/- 2 giorni di differenziazione e fissarli durante la notte a 4 °C, in 5 mL 4% PFA su un tubo conico da 15 ml.
    7. Per ulteriori analisi di immunocolorazione toto o fluttuanti, gli organoidi vengono quindi risciacquati due volte in PBS e conservati a 4 °C in PBS + 0,05% di azide di sodio.
    8. Per l'analisi immunocolorante su sezioni congelate, immergere organoidi fissi al 4% di PFA in 10 mL 30% di saccarosio a +4 °C ON (o fino a quando gli organoidi non affondano). Incorporarli in una matrice di incorporamento congelata e conservarli a -80 ° C fino alla criosezione.

3. In toto immunolabeling, clearing, and lightsheet acquisition of dorsal forebrain organoids

  1. Fissazione
    1. Raccogliere gli organoidi in piastre a 6 pozzetti, rimuovere il mezzo e fissarli con 2 ml di PFA al 4%, a 4 °C, durante la notte.
    2. Eseguire tre lavaggi in 2 ml di PBS a temperatura ambiente.
    3. Trasferire gli organoidi in tubi da 2 mL e conservare a 4 °C in 2 mL di PBS + 0,05% di sodio azide.
  2. Permeabilizzazione
    1. Incubare gli organoidi in 1 mL di PBS contenenti lo 0,2% di Triton X100 a RT per 1 ora. Fallo due volte.
    2. Incubare in 1 mL di PBS contenente lo 0,2% di Triton X100 e il 20% di DMSO, a 37 °C, durante la notte.
    3. Incubare in 1 mL di PBS contenente 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% Desossicolato, 0,1% NP40 e 20% DMSO, a 37 °C, durante la notte.
    4. Incubare in 1 mL di PBS contenente lo 0,2% di Triton-X100, a RT, per 1 ora. Fallo due volte.
  3. Blocco e immunolabeling
    1. Blocco in 1 mL di soluzione bloccante (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Donkey Serum, 10% DMSO), a 37 °C, ON.
    2. Incubare con anticorpi primari diluiti in 250 μL di PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/mL di eparina, 5% DMSO e 3% Siero d'asino, a 37 °C, per 2 giorni.
    3. Lavare in 1 mL di PBS contenente 0,2% di Tween20 e 0,1 μg/mL di eparina, per 1 ora, a 37 °C. Fallo quattro volte.
    4. Lavare in 1 mL di PBS contenente lo 0,2% di Tween20 e 0,1 μg/mL di eparina, durante la notte, a 37 °C.
    5. Incubare con anticorpi secondari diluiti in 250 μL di PBS contenenti 0,2% di Tween 20, 0,1 μg/mL di eparina e 3% di siero d'asino, a 37 °C, per 2 giorni.
    6. Lavare in 1 mL di PBS contenente 0,2% tween 20 e 0,1 μg/mL di eparina, per 1 ora, su una ruota, a RT. Fallo quattro volte.
    7. Lavare in 1 mL di PBS contenente 0,2% Tween 20 e 0,1 μg/mL di eparina, durante la notte, su una ruota, a RT.
    8. Lavare in 1 mL di PBS, per 24 ore, a RT.
    9. Stock a +4 °C in 1 mL di PBS e 0,05% di azide di sodio fino alla compensazione.
  4. Clearing in TDE (2,2′ -Tiodietanolo)
    1. Incubare gli organoidi in 1 mL di TDE al 30% (3 mL di TDE + 7 mL di PBS), per 24 ore, a RT.
    2. Incubare in 1 mL di TDE al 60% (6 mL di TDE + 4 mL di PBS), per 24 ore, a RT.
    3. Incubare in 1 mL di TDE all'80% (8 mL di TDE + 2 mL di PBS), per 24 ore, a RT.
  5. Incorporamento di organoidi prima dell'acquisizione di fogli leggeri
    NOTA: utilizzare un sistema personalizzato; realizzato con una siringa da 1 mL con la punta tagliata con un bisturi.
    1. Preparare 100 mL di agarosio a bassa fusione al 4% in soluzione di TDE al 60% e aliquota in tubi da 2 mL. Conservare a +4 °C.
    2. Prima dell'incorporazione dell'organoide, preriscaldare un tubo contenente 1,5 mL di agarosio a bassa fusione al 4% in TDE al 60% a bagnomaria a 37 °C fino a quando non si liquefa.
    3. Nel frattempo, prepara un sistema di stampaggio su misura realizzato con una siringa da 1 mL la cui punta viene tagliata usando un bisturi.
    4. Pompare nella siringa 600 μL della soluzione gel usando lo stantuffo.
    5. Posizionare il campione utilizzando una punta di pipetta ingrandita la cui apertura è stata tagliata con forbici sterili.
    6. Riempire la siringa con 400 μL di soluzione gel in modo che il campione sia posizionato entro il terzo inferiore della siringa.
    7. Lasciare polimerizzare il gel e conservare in soluzione di TDE all'80% a 4 °C al riparo dalla luce fino all'acquisizione.
    8. Per l'acquisizione di fogli Light, utilizzare un obiettivo 20x immerso in una soluzione TDE all'80% aggiunta nella camera del campione per consentire di adattarsi con precisione all'indice di rifrazione del metodo di compensazione.
    9. Inserire la siringa contenente l'organoide incorporato nell'agarosio nel portacampioni più grande progettato per ospitare una siringa da 1 mL il cui stantuffo può essere azionato per posizionare l'organoide davanti all'obiettivo.
      NOTA: L'acquisizione di un intero organoide in fogli leggeri richiede circa 5-10 min.

4. Immunocolorazione e pulizia di sezioni fluttuanti di organoidi del proencefalo dorsale

  1. Fissazione, incorporamento di agarosio e sezionamento degli organoidi
    1. Raccogliere gli organoidi dopo 28, 42 e 70 +/- 2 giorni di differenziazione in una piastra a 6 pozzetti e fissare durante la notte a 4 °C in 2 ml di PFA al 4%.
    2. Risciacquare due volte in 2 mL di PBS e conservare a 4 °C in 2 mL di PBS + 0,05% di sodio azide.
    3. Incorporare gli organoidi fissi in agarosio a bassa fusione al 4% in uno stampo di incorporamento in plastica (7 x 7 mm). Rimuovere con cura il blocco di agarosio dallo stampo di plastica e incollarlo allo stadio di vibratoma.
    4. Sezionare gli organoidi incorporati utilizzando un vibratoma per ottenere sezioni flottanti da 150 μm trasferite in un pozzo di una piastra a 24 pozzetti contenente 500 μL di PBS utilizzando un pennello per evitare di danneggiare le sezioni.
      NOTA: si raccomanda l'agarosio a bassa fusione in quanto la sua temperatura di fusione è solo di circa 60 °C. Preparare l'agarosio a bassa fusione al 4% in soluzione di PBS e lasciarlo raffreddare appena sopra i 37 °C a bagnomaria prima dell'incorporamento dell'organoide.
  2. Permeabilizzazione, blocco e immunocolorazione
    1. Incubare le sezioni in 500 μL di PBS contenenti lo 0,3% di Triton X100, a RT, sotto agitazione, per 20 min. Fallo tre volte.
    2. Incubare le sezioni in 500 μL di PBS contenenti lo 0,3% di Triton X100 e il 5% di latte non grasso, a RT, sotto agitazione, per 2 ore.
    3. Incubare le sezioni in 250 μL di soluzione anticorpale primaria (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% di latte non grasso), sotto agitazione, a +4 °C, durante la notte.
    4. Lavare le sezioni in 500 μL di PBS, a RT, sotto agitazione, per 20 min. Fallo quattro volte.
    5. Incubare le sezioni in 250 μL di soluzione anticorpale secondaria (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% di latte non grasso), a RT, sotto agitazione, per 2 ore.
    6. Lavare le sezioni in 500 μL di PBS, a RT, sotto agitazione, per 20 min. Fallo quattro volte.
    7. Conservare le sezioni in 500 μL di PBS, a +4° C fino alla pulizia.
  3. Clearing in TDE (2,2′ -Tiodietanolo)
    1. Incubare le sezioni in 500 μL di 30% e 60% di TDE per 1 ora ciascuna a RT, e poi in 500 μL di 80% di TDE durante la notte, a RT.
    2. Conservare le sezioni eliminate in 500 μL di TDE all'80% fino all'acquisizione a +4 °C.
  4. Montaggio di sezioni flottanti prima dell'acquisizione con confocale a scansione risonante
    1. Montare una sezione flottante in una camera sigillata che consente di mantenere il campione in soluzione TDE all'80% e progettata per adattarsi a uno stadio XY motorizzato di microscopi confocali.
    2. Metti un coverslip rotondo nel sistema della camera.
    3. Trasferire con cura la sezione immunocolorata eliminata usando un pennello.
    4. Riempire la camera con una soluzione di TDE all'80%.
    5. Aggiungi due coverslip standard più un secondo coverslip rotondo e un sigillo in silicone.
    6. Avvitare l'anello di avvitamento della camera per sigillare perfettamente il sistema.

5. Foglio leggero e analisi confocale a scansione risonante

  1. Elabora le acquisizioni di fogli luminosi e scansioni risonanti utilizzando un software che consente la visualizzazione e l'analisi 3D dell'intero campione immunocolorato.
    NOTA: Tale software consente di aprire rapidamente enormi dati per creare facilmente istantanee e animazioni. Permette di spostare il campione in diversi orientamenti e di generare viste 2D grazie a uno strumento slicer 2D in diversi orientamenti, XY e YZ ad esempio.
  2. Per il rilevamento automatico sia dei centrosomi che delle ciglia primarie, utilizzare una procedura guidata spot che consenta di quantificare il loro numero in condizioni patologiche rispetto a quelle di controllo.
  3. Per la ricostruzione 3D del PC che consente una misurazione precisa della loro lunghezza, utilizzare una procedura guidata del filamento per fissare manualmente il punto di partenza del PC e il software utilizza il segnale di fluorescenza per ricostruire il PC con precisione.

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Representative Results

Modelli cellulari 2D hIPS per studiare la biogenesi e la funzione del cilio primario
Il protocollo qui dettagliato è stato adattato da studi pubblicati in precedenza20,21,22. Questo protocollo consente la generazione di strutture neurali a rosetta che contengono progenitori neocorticali e neuroni simili a quelli osservati nella neocorteccia in via di sviluppo. La convalida dettagliata può essere eseguita mediante analisi immunocolorante convenzionale utilizzando produttori specifici3. Ad esempio, i progenitori apicali (AP) dovrebbero essere doppiamente colorati con SOX2 e PAX6, i progenitori intermedi (IP) sono rivelati dalla colorazione TBR2 / EOMES e i neuroni neocorticali nati all'inizio sono rivelati dalla colorazione CTIP2 (Figura 1A-C). Tali strutture neurali simili a rosette modellano la migrazione nucleare intercinetica (INM) di AP che può essere visualizzata immunocolorando con anticorpi sollevati contro la fosfo-vimentina, che macchia i nuclei mitotici e TPX2 che macchia il fuso mitotico. Questi marcatori, quindi, permettono l'analisi di diverse caratteristiche dell'AP, tra cui l'INM con divisione cellulare da avvenire apicalmente attorno al lume centrale (Figura 1D,D'), nonché la modalità di divisione determinata misurando l'angolo tra il piano di divisione e la superficie apicale. Infine, la ciliogenesi può essere analizzata immunocolorando con anticorpi sollevati contro PCNT, che macchia il corpo basale di PC, e ARL13B che macchia l'axoneme. Su tali strutture a rosetta, i PC si estendono dal polo apicale degli AP nel lume centrale di ciascuna regione simile a un ventricolo (Figura 1E, E'), mentre sporgono anche dai neuroni CTIP2+ (Figura 1E'').

La dissociazione di queste strutture a rosetta consente di ottenere NSPC isolati coltivati su piastre di coltura rivestite di poli-L-ornitina/laminina in NMM ad alta densità per consentire il mantenimento di una popolazione stabile ed espandibile di NSPC per almeno 15 passaggi senza accumulare anomalie del cariotipo21,27. Per analizzare la biogenesi del PC, le NSPC dissociate vengono coltivate alla confluenza e affamate per 48 ore. Le analisi immunocoloranti che utilizzano anticorpi sollevati contro i marcatori PC mostrano che quelle NSPC ospitano PC (Figura 2A). Combinando due strumenti open source complementari, Ilastik, uno strumento di analisi delle immagini basato sull'apprendimento automatico utile per la segmentazione del PC28 e CiliaQ, un pacchetto di plugin Fiji / ImageJ29, che consente la ricostruzione 3D del PC da stack di immagini confocali 3D, è possibile valutare facilmente diversi parametri strutturali, tra cui il numero di PC e la loro lunghezza.

La funzione PC degli NSPC può anche essere valutata testando la trasduzione della via di segnalazione Hedgehog. Per valutare la trasduzione della via di segnalazione SHH, le NSPC sono affamate per 48 ore e trattate con SHH ricombinante (rSHH) o un agonista levigato (SAG) per 24 ore. Utilizzando anticorpi sollevati contro GPR161, SMO e GLI2, l'analisi immunofluorescente (IF) consente di testare il traffico di questi attori chiave di segnalazione SHH lungo il PC, con GPR161 che normalmente esce dal PC mentre GLI2 e SMO si accumulano all'interno del PC in risposta all'attivazione della via SHH (Figura 2C-D). L'analisi di stack di immagini confocali 3D utilizzando gli strumenti CiliaQ consente di quantificare l'uscita gpR161 dal PC e l'accumulo di GLI2 e SMO all'interno del PC dopo l'attivazione del percorso SHH (Figura 2F-G). Inoltre, l'analisi semi-quantitativa RT-PCR su mRNA estratto da NSPC trattati con rSHH o SAG mostra l'induzione di due geni bersaglio SHH, GLI1 e PTCH1, attestando la normale trasduzione della segnalazione SHH in NSPC derivati da hIPSCs di controllo (Figura 2B).

Nel complesso, i modelli cellulari 2D di sviluppo del proencefalo dorsale riproducono chiaramente diversi aspetti del normale sviluppo della corteccia cerebrale e rappresentano strumenti promettenti per sezionare i meccanismi associati al PC alla base delle anomalie dello sviluppo neocorticale utilizzando il controllo rispetto alle hIPSC del paziente che ospitano mutazioni nei geni responsabili delle anomalie dello sviluppo umano della corteccia cerebrale.

Modelli cellulari 3D hIPS per studiare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale
Il protocollo qui descritto (Figura 3A) è stato adattato dai protocolli precedentemente pubblicati23,24,25,26,30 e testato con successo su cinque distinte linee hIPSC di controllo. Permette la generazione di organoidi del proencefalo dorsale derivati da hIPSC che aumentano di dimensioni nel tempo formando grandi anse neuroepiteliali (Figura 3B). L'analisi immunolabeling su criosezioni organoidi (criostato, 20 μm), sezioni fluttuanti (vibratome, 150 μm) o in toto, può essere eseguita per controlli di qualità. Al giorno 28 ± 2, gli organoidi sono costituiti da anse neuroepiteliali stratificate che co-esprimono il marcatore progenitore neurale SOX2 e il marcatore del proencefalo dorsale PAX6, attestando l'identità del proencefalo dorsale. Al giorno 42 ± 2 (6 settimane di differenziazione), questi loop dovrebbero mostrare un'organizzazione stratificata più complessa. Dalla superficie apicale a quella basale di queste strutture ad anello, è possibile delineare una regione simile alla zona ventricolare (VZ) con progenitori gliali radiali apicali SOX2/PAX6-positivi (aRG) e una regione simile alla zona subventricolare (SVZ) con progenitori intermedi (IP) TBR2-positivi e una regione simile alla piastra corticale (CP) contenente neuroni neocorticali nati all'inizio CTIP2-positivi (Figura 3C, E). La polarità molecolare apicale di aRG può essere valutata mediante l'arricchimento apicale sulla superficie ventricolare di ZO-1 e N-CADH (Figura 4A, Video 1). Le proprietà di divisione progenitrice aRG possono essere valutate utilizzando marcatori TP2X e P-VIM per analizzare l'INM che normalmente porta all'allineamento dei nuclei mitotici aRG sulla superficie ventricolare delle anse corticali (Figura 4B, Video 2). Tale immunolabeling consente anche la misurazione dell'angolo di divisione per valutare la modalità di divisione simmetrica rispetto a quella asimmetrica di aRG. I progenitori positivi di P-Vim possono anche essere osservati nella regione simile a SVZ, che ospita un processo basale unico che si estende alla superficie basale che ricorda la glia radiale esterna (oRG o glia radiale basale, Figura 4C, Video 2). Mentre sono assenti dagli organoidi del giorno 42, i neuroni nati tardivi SATB2 positivi dovrebbero essere rilevati dal giorno 70 (10 settimane di differenziazione) (Figura 3D, F), attestando la tempistica in vivo della differenziazione neuronale neocorticale.

Esperimenti di immunolabeling utilizzando i marcatori del corpo basale (gamma Tubulin) e dell'axoneme (ARL13B) consentono la visualizzazione del PC su criosezioni da 20 μm (Figura 3G,H). Per sfruttare l'organizzazione 3D degli organoidi del proencefalo dorsale, è possibile eseguire l'immunocolorazione a montaggio intero. L'acquisizione di fogli leggeri di tali organoidi immunocolorati e cancellati consente il rilevamento sia di centrosomi che di PC su tutti i tipi di NSPC e sui neuroni neocorticali (Video 3). Inoltre, per eseguire analisi più accurate della biogenesi del PC, possono essere eseguite analisi immunoistochimiche su sezioni spesse fluttuanti (150 μm) di organoidi del proencefalo dorsale. Dopo la compensazione, tali sezioni possono essere acquisite utilizzando un obiettivo ad olio 40x (NA 1.3) o 63x (NA 1.4) di un microscopio laser confocale a luce bianca risonante invertito, consentendo di migliorare la risoluzione preservando le informazioni spaziali 3D degli organoidi. Tale microscopio confocale a scansione laser consente una rapida acquisizione di sezioni spesse, con un'eccitazione e un rilevamento precisi e flessibili senza alcuna interferenza (Video 4). È possibile valutare diversi parametri strutturali del PC, tra cui il numero del PC, la lunghezza e l'orientamento, utilizzando un software di imaging 3D. Strumenti open source dedicati e liberamente disponibili come Ilastik28, uno strumento di analisi delle immagini basato sull'apprendimento automatico e il pacchetto di plug-in CiliaQ su Fiji / ImageJ29 sono molto utili per la segmentazione automatica del PC che consente la successiva analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del PC in condizioni di controllo rispetto a quelle patologiche.

Figure 1
Figura 1: Generazione e caratterizzazione di rosette neurali 2D. Caratterizzazione immunoistochimica delle strutture neurali delle rosette utilizzando (A) anticorpi SOX2 e PAX6 per rilevare AP, (B) TBR2 / EOMES per rivelare IP e (C) CTIP2 per macchiare i neuroni neocorticali nati precocemente. Gli AP proliferanti sono rilevati con anticorpi fosfo-vimentina e TPX2 e si trovano sulla superficie apicale (D,D'). I PC sono rivelati da una doppia immunocolorazione con anticorpi PCNT e ARL13B. I PC si estendono da ciascun AP nel lume centrale di ogni rosetta, mentre vengono rilevati anche su IP e neuroni nati precocemente (E,E',E''). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: NSPC isolati derivati da rosette neurali 2D ospitano PC funzionali. La dissociazione delle rosette neurali 2D dà origine a NSPC isolati che ospitano PC dopo la fame per 48 ore, come rivelato dall'immunocolorazione ARL13B e PCNT (A). Le NSPC ospitano PC funzionale come rivelato dalla quantificazione RT-PCR di due geni bersaglio SHH GLI1 e PTCH1 dopo la fame per 48 ore e la successiva attivazione della via mediante trattamento con SHH ricombinante (rSHH) per 24 ore. I dati di espressione gli1 e PTCH1 sono stati eseguiti in triplice copia e normalizzati ai dati di espressione ACTB . I dati sono stati analizzati con il metodo 2−ΔΔCt e presentati come espressione relativa ± SEM (test di Mann Whitney) (B). Analisi IF su NSPC affamati con (D) o senza (C) trattamento rSHH per testare la dinamica di due attori cruciali della via di segnalazione SHH, GLI2 e GPR161, che rispettivamente accumulano o escono dal PC dopo l'attivazione della via SHH. Combinando gli strumenti Ilastik e CiliaQ per l'analisi delle immagini confocali, l'intensità del segnale GPR161 (F) e GLI2 (G) all'interno del PC è stata confrontata in NSPC trattati con +/- rSHH. La colorazione ARL13B è stata utilizzata per la segmentazione del PC e, come previsto, la lunghezza del PC è rimasta invariata negli NSPC trattati con +/- rSHH (E). I dati sono riepilogati in grafici a scatola e baffi (valori medi ± SEM). p < 0,0001 (test di Mann Whitney). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Generazione e caratterizzazione di organoidi del proencefalo dorsale. (A) Panoramica schematica del protocollo per la generazione di organoidi del proencefalo dorsale. (B) Immagini rappresentative in campo luminoso di organoidi ai giorni 1, 3, 7, 24 e 42 di differenziazione. Immagini confocali di criosezioni di 20 μm di organoidi al giorno 42 (C) e 70 (D) dopo immunocolorazione con anticorpi SOX2, TBR2 e CTIP2 che delineano, rispettivamente, la zona ventricolare (VZ), la zona subventricolare (SVZ) contenente IP TBR2 positivo e la regione preplate-simile (CP) contenente neuroni neocorticali primitivi CTIP2 positivi. Immagini confocali di criosezioni di 20 μm di organoidi al giorno 42 (E) e 70 (F) dopo immunocolorazione con anticorpi PAX6, CTIP2 e SATB2 che mostrano la comparsa di neuroni nati tardivi SATB2 positivi al giorno 70. Immagini confocali di criosezioni di 20 μm di un organoide al giorno 42 dopo immunocolorazione con anticorpi ARL13B e PCNT che rivelano PC al polo apicale dei progenitori gliali radiali (G) mentre sono presenti anche sui neuroni CTIP2 positivi (H). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Imaging 3D di organoidi del proencefalo dorsale. (A) Acquisizione di un intero organoide del proencefalo dorsale (Giorno 42) colorato con anticorpi PAX6, N-CADH e CTIP2 che mostrano le molteplici anse neuroepiteliali con progenitori gliali radiali POSITIVI PAX6 che mostrano una polarità apicobasale corretta come rivelato dall'accumulo di N-Caderina sul lato apicale e neuroni neocorticali primitivi CTIP2 positivi che delineano una regione simile a un prelato. (B) Acquisizione leggera di un intero organoide del proencefalo dorsale (Giorno 42) colorato con anticorpi TPX2, P-Vim e CTIP2 che illustrano la migrazione nucleare intercinetica dei progenitori gliali radiali ventricolari. (C) Zoom sull'acquisizione del foglio luminoso di un intero organoide del proencefalo dorsale (Giorno 42) colorato con anticorpi TPX2 e P-Vim che mostra un progenitore che estende un processo basale unico e localizzato nella zona subventricolare, che ricorda un progenitore gliale radiale esterno. (D) Acquisizione di uno scanner risonante di una sezione di 150 μm di un organoide del proencefalo dorsale (giorno 42) colorato con anticorpi PCNT e ARL13B che mostrano PC in NSPC e neuroni neocorticali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Generazione e caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule hIPS dello sviluppo del proencefalo dorsale per sezionare il coinvolgimento del PC nella fisiopatologia delle anomalie corticali cerebrali. Le cellule hIPS sono autorizzate a formare corpi embrioidi (EB) in piastre di coltura a bassa adesione e vengono quindi incubate in un mezzo di induzione contenente due inibitori SMAD per indurre la differenziazione neuroectodermica. L'adesione degli EB in piatti rivestiti di PO/lam consente la generazione di strutture neurali a rosetta 2D mentre la coltura fluttuante di EB con successiva incorporazione in BMM consente la generazione di organoidi del proencefalo dorsale. Il ritiro dei fattori mitogenici dal mezzo a rosetta neurale aderente promuove l'insorgenza della neurogenesi che può essere testata mediante analisi IF. La dissociazione di rosette neurali aderenti consente la generazione di colture di NSPC isolate utili per la biogenesi del PC e l'analisi delle funzioni. Gli organoidi del proencefalo dorsale vengono raccolti dopo 4, 6 o 10 settimane di differenziazione e fissati per successive analisi immunocoloranti in toto, su sezioni spesse 150 μm o criosezioni da 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Acquisizione di un intero organoide del proencefalo dorsale (Giorno 42) immunocolorato con anticorpi PAX6, CTIP2 e NCADH. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Acquisizione di un intero organoide del proencefalo dorsale (Giorno 42) immunocolorato con anticorpi TPX2, P-VIM e CTIP2. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Acquisizione di un intero organoide del proencefalo dorsale (Giorno 42) immunocolorato con anticorpi PCNT e ARL13B. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 4: Acquisizione confocale a scansione risonante di una sezione di 150 μm di un organoide del proencefalo dorsale (Giorno 42) immunostanziato con anticorpi ARL13B e PCNT. Clicca qui per scaricare questo video.

FILE SUPPLEMENTARI: Clicca qui per scaricare le Tabelle.

Tabella supplementare 1: Ricetta dei media utilizzati per la generazione di rosette neurali 2D e NSPC.

Tabella supplementare 2: Ricetta dei mezzi utilizzati per la generazione di organoidi del proencefalo dorsale.

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Discussion

I PC sono ora considerati organelli chiave che regolano i passaggi cruciali durante il normale sviluppo corticale cerebrale18,19,31 tra cui l'espansione e l'impegno NSPC8,9,10,11,12, nonché la migrazione neuronale13,14 e la sinaptogenesi16,17 . Oltre all'analisi in modelli animali o tessuti cerebrali fetali umani, la generazione di modelli di sviluppo neocorticale altamente innovativi e rilevanti derivati dal paziente basati su hIPSC è essenziale per sezionare il ruolo della PC durante lo sviluppo corticale cerebrale sia normale che patologico.

Il protocollo di modellazione 2D basato su hIPSC dettagliato qui è stato adattato da tre importanti pubblicazioni20,21,22. Il differenziamento neuroepiteliale è indotto dalla doppia inibizione di SMAD utilizzando inibitori di piccole molecole delle vie activina/nodale (SB-431542) e BMP (LDN-193189)22. Le cellule sono organizzate in strutture a forma di rosetta contenenti NSPC e neuroni neocorticali dello strato profondo dopo 20 giorni di differenziazione. Inoltre, queste strutture simili a rosette mostrano una corretta polarità apicobasale, migrazione nucleare intercinetica di progenitori apicali e PC che si estende da tutti i NSPC e neuroni. Dopo la dissociazione di queste strutture a rosetta, si ottiene una popolazione omogenea e stabile di progenitori corticali21. Quando coltivati alla confluenza e affamati per 48 ore, quei progenitori corticali ospitano PC per i quali la morfologia, il numero e la lunghezza possono essere facilmente analizzati combinando il pacchetto di plugin Ilastik28 e CiliaQ28,29 su Fiji / ImageJ. Inoltre, utilizzando citochine per indurre la via di segnalazione SHH, la funzione PC può anche essere utilizzata da IF per testare la dinamica di attori cruciali della via di segnalazione lungo il PC come GLI2, SMO e GPR161. Inoltre, i saggi semi-quantitativi RT-PCR consentono di testare l'induzione dell'espressione genica bersaglio SHH, inclusi GLI1 e PTCH1, in risposta all'attivazione della via SHH. Dovrebbero essere testate anche altre vie di segnalazione dipendenti dalla funzione del PC, comprese le vie WNT e IGF2,32,33. Per concludere su questo approccio di modellazione 2D, che riproduce chiaramente diversi aspetti del normale sviluppo della corteccia cerebrale, rappresenta uno strumento utile e rilevante per testare la biogenesi e la funzione del PC in condizioni normali rispetto a quelle patologiche e dovrebbe contribuire a ottenere ulteriori informazioni sul coinvolgimento del PC durante lo sviluppo neocorticale.

Complementari agli approcci di modellazione 2D basati su hIPSC, gli organoidi del proencefalo dorsale offrono opportunità senza precedenti per studiare lo sviluppo cerebrale normale e patologico in vitro in quanto ricapitolano molte caratteristiche e caratteristiche della corteccia cerebrale umana in via di sviluppo precoce. Attualmente vengono utilizzati due tipi principali di protocolli: i metodi intrinseci e quelli guidati. Il protocollo intrinseco sviluppato da Lancaster e colleghi23 si basa sulla capacità intrinseca delle IPSC di auto-organizzarsi con fattori esterni minimi e dà origine a organoidi cerebrali contenenti rudimenti di regioni cerebrali distinte che offrono un'opportunità unica per modellare le interazioni tra diverse regioni del cervello. Tuttavia, l'elevata variabilità ed eterogeneità inerenti a tale strategia di modellazione presenta sfide significative di riproducibilità. I protocolli di differenziazione organoide guidata consentono la generazione di organoidi specifici della regione cerebrale con eterogeneità minima24,25,26. Questo approccio ci ha permesso di generare con successo organoidi del proencefalo dorsale con strutture simili a ventricoli che ricapitolano i principali processi dello sviluppo corticale cerebrale umano precoce. Il primo problema critico è quello di iniziare con colture hIPSC di alta qualità che ospitano grandi colonie regolari che mostrano una differenziazione inferiore al 10% e che sono state passate quasi una volta come monostrato per adattare le hIPC alle condizioni di coltura monocellulare. Infatti, per limitare l'eterogeneità organoide, una delle maggiori sfide nel campo, la formazione di EB con una dimensione omogenea è un prerequisito che implica la necessità di dissociazione delle colonie di hIPSC in sospensione monocellulare che consente la semina alla densità cellulare definita. Un altro passo critico è l'inclusione BMM di EB, necessaria per supportare la struttura 3D e l'espansione neuroepiteliale. Abbiamo favorito l'inclusione di gruppo di una quindicina di organoidi rispetto all'inclusione individuale anche se comporta un ulteriore passaggio, la dissociazione BMM. È stato dimostrato che la dissociazione BMM prima della coltura di scuotimento riduce la variabilità all'interno e tra i lotti di organoidi, determinando così una maggiore riproducibilità34. Inoltre, consente di eliminare i processi cellulari che si estendono nel BMM che non sono dannosi per le seguenti fasi di differenziazione, ma che rendono difficile l'osservazione degli organoidi per l'ispezione della qualità durante le fasi successive della procedura. Per migliorare l'assorbimento nutrizionale e lo scambio di ossigeno, abbiamo confrontato la maturazione degli organoidi su agitatori orbitali e bioreattori rotanti che hanno portato a risultati simili. Abbiamo quindi scelto l'opzione scuotitore orbitale, in quanto permette di ridurre sensibilmente i volumi medi e quindi il costo totale degli esperimenti. È importante sottolineare che utilizzare un incubatore diverso per la coltura stazionaria e scuotitrice su uno shaker orbitale per evitare vibrazioni dannose per la crescita hIPSC aderente. Abbiamo applicato con successo questo protocollo su cinque distinte linee hIPSC di controllo35 che danno luogo a risultati omogenei garantendo la robustezza di questa procedura.

La caratterizzazione di tali organoidi può essere ottenuta utilizzando diversi metodi. Per preservare le informazioni spaziali 3D all'interno degli organoidi, abbiamo impostato un protocollo che consente l'immunocolorazione a montaggio intero e la compensazione di interi organoidi con successiva acquisizione di fogli leggeri. Sono emersi diversi metodi di compensazione con efficienza a seconda dell'origine e dello spessore del campione36,37. Qui, abbiamo impostato un metodo di compensazione semplice, veloce ed economico che si basa sul TDE (2,2'-tiodietanolo), un derivato glicole precedentemente utilizzato per eliminare il cervello del topo e gli organoidi intestinali38,39. L'acquisizione di organoidi immunocolorati e cancellati è stata eseguita su un microscopio a foglio ottico utilizzando un obiettivo 20x immerso nell'80% di TDE. Rispetto ad altri metodi di acquisizione di immagini 3D, la microscopia a foglio luminoso è interessante per diversi motivi: acquisizione rapida, buona penetrazione e riduzione del fotosbiancamento. L'ottimizzazione della fase di permeabilizzazione consente di raggiungere una penetrazione anticorpale efficiente e omogenea che consente di visualizzare corpi basali e assonemi di PC che si estendono da tutti i tipi di cellule progenitrici e neuronali dell'intero organoide. Inoltre, l'acquisizione di sezioni di spessore 150 μm fluttuanti utilizzando un microscopio confocale a scansione risonante invertita con obiettivi di olio 40x (NA 1.3) o 63x (NA 1.4) consente di ottenere ulteriori risultati nella risoluzione, preservando un grado significativo di informazioni spaziali 3D e consentendo l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del PC.

La combinazione di tali modelli cellulari 2D e 3D e l'analisi di imaging 3D (Figura 5) su hIPPC generate riprogrammando le cellule dei pazienti con ciliopatia o utilizzando la tecnologia CRISPR / CAS9 per modificare specificamente i geni centrosomiali o ciliari dovrebbe consentire progressi significativi nella comprensione del contributo del PC durante lo sviluppo normale e patologico della corteccia cerebrale. È importante sottolineare che la tecnologia di editing del genoma consente anche di salvare specificamente le mutazioni dei pazienti per ottenere hIPSC di controllo isogenico per superare l'eterogeneità genetica che sfida il rilevamento dei meccanismi della malattia. Inoltre, gli approcci genomici a singola cellula sono ora ampiamente utilizzati in tutto il campo e rappresentano approcci pertinenti e complementari all'analisi immunocolorante. Pertanto, nonostante alcune limitazioni e difficoltà inerenti a tutte le tecnologie emergenti e che vengono ampiamente affrontate, tali modelli basati su hIPSC 2D e 3D e i metodi di caratterizzazione che abbiamo presentato qui offrono strumenti potenti e pertinenti per sezionare il coinvolgimento del PC nei meccanismi patologici alla base delle anomalie neocorticali dello sviluppo umano.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Agence Nationale de la Recherche (ANR) a S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) e N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 e ANR-19-CE16-0002-01). LB è supportato dall'ANR nell'ambito del programma Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) e dalla Fondation Bettencourt Schueller (programma MD-PhD). L'Imagine Institute è sostenuto da finanziamenti statali dell'ANR nell'ambito del programma Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, progetti CrossLab) e come parte del secondo programma Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

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References

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Biologia dello sviluppo Numero 181 cilio primario cellule staminali pluripotenti indotte umane hIPPC cellule staminali neurali e progenitrici sviluppo corticale cerebrale umano rosette neurali organoidi del proencefalo dorsale modelli di sviluppo neocorticale basati su hIPSC 2D e 3D organoidi cerebrali riccio sonico immunocolorazione integrale clearing ottico microscopio a foglio luminoso
Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale
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