Et svært nøyaktig in vitro høygjennomstrømningsanalysesystem ble utviklet for å evaluere anticancer-legemidler ved hjelp av pasientavledede tumororganoider (PUD), som ligner kreftvev, men er uegnet for in vitro høygjennomstrømningsanalysesystemer med 96-brønns og 384-brønnsplater.
Pasientavledede tumororganoider (PUD) forventes å være en preklinisk kreftmodell med bedre reproduserbarhet av sykdom enn tradisjonelle cellekulturmodeller. PUD-er har blitt generert fra en rekke menneskelige svulster for å rekapitulere arkitekturen og funksjonen til tumorvev nøyaktig og effektivt. Imidlertid er PUD-er uegnet for et in vitro high-throughput analysesystem (HTS) eller celleanalyse ved hjelp av 96-brønns eller 384-brønnsplater når de evaluerer anticancer medisiner fordi de er heterogene i størrelse og danner store klynger i kulturen. Disse kulturene og analysene bruker ekstracellulære matriser, som Matrigel, for å skape tumorvevstillaser. Derfor har PUD-er lav gjennomstrømning og høye kostnader, og det har vært vanskelig å utvikle et passende analysesystem. For å løse dette problemet ble det etablert en enklere og mer nøyaktig HTS ved hjelp av PDOer for å evaluere styrken til anticancer medisiner og immunterapi. En in vitro HTS ble opprettet som bruker PUD-er etablert fra solide svulster dyrket i 384-brønnsplater. En HTS ble også utviklet for vurdering av antistoffavhengig cellulær cytotoksisitetsaktivitet for å representere immunresponsen ved hjelp av PUD-er dyrket i 96-brønnsplater.
Human kreftcellelinjer er allment akseptert for å studere kreftbiologien og evaluere kreftmidler. Imidlertid bevarer disse cellelinjene ikke nødvendigvis de opprinnelige egenskapene til kildevevet fordi deres morfologi, genmutasjon og genuttrykksprofil kan endres under kultur over lange perioder. Videre dyrkes de fleste av disse cellelinjene i en monolayer eller brukes som murine xenografts, som ingen av dem fysisk representerer tumorvev1,2. Dermed kan den kliniske effekten av kreftmidler ikke være den samme som observert i kreftcellelinjer. Derfor er in vitro-systemer, som ex vivo-analyser ved hjelp av pasientavledede tumor xenografter eller pasientavledede tumororganoider (PUD) og tumorsfæroidmodeller som nøyaktig reproduserer strukturen og funksjonen til tumorvev, utviklet. Økende bevis tyder på at disse modellene forutsier pasientens respons på anticancer agenter ved å være direkte sammenlignbar med tilsvarende kreftvev. Disse in vitro-systemene er etablert for forskjellige tumorvevstyper, og tilhørende høygjennomstrømningsanalysesystemer (HTS) for legemiddelscreening er også utviklet3,4,5,6,7. Heterogene ex vivo organoid kulturer av primære svulster hentet fra pasienter eller pasientavledede tumor xenografts har fått betydelig trekkraft de siste årene på grunn av deres enkle kultur og evne til å opprettholde kompleksiteten av celler i det stromale vevet8,9,10. Disse modellene forventes å øke forståelsen av kreftbiologien og lette evalueringen av legemiddeleffekt in vitro.
En rekke nye PUD-er ble nylig opprettet fra forskjellige typer tumorvev, utpekt som F-PUD, under Fukushima Translational Research Project. PUD-ene danner store celleklynger med en morfologi som ligner på kildesvulsten og kan dyrkes i mer enn seks måneder11. De komparative histologi- og omfattende genuttrykksanalysene viste at egenskapene til PUD-ene er nær de av deres kildesvulstvev, selv etter langvarig vekst under kulturforhold. Videre ble det etablert en egnet HTS for hver type PUD i 96-brønns og 384-brønnsplater. Disse analysene ble brukt til å evaluere flere molekylære målrettede midler og antistoffer. Her ble standard kjemoterapeutikk (paclitaxel og karboplatin) som brukes til endometriekreft evaluert ved hjelp av F-PUD-er avledet fra en pasient som ikke reagerte på paclitaksel og karboplatin. Følgelig var celleveksthemmeraktiviteten til paclitaksel og karboplatin mot denne PUD svak (IC50: >10 μM). I tillegg har tidligere forskning rapportert at følsomheten til noen F-PUD-er til kjemoterapeutiske midler og molekylære målrettede midler er i samsvar med den kliniske effekten11,12,13. Til slutt ble endringer i pdoenes høyere rekkefølge forårsaket av kreftmidler analysert ved hjelp av et tredimensjonalt celleanalysesystem12,13. Resultatene av evalueringen av kreftmidler ved bruk av PUD-basert HTS er sammenlignbare med de kliniske resultatene som er oppnådd for disse midlene. Her presenteres en protokoll for en enklere og mer nøyaktig HTS som kan brukes til å evaluere styrken til anticancer agenter og immunterapi ved hjelp av PUD-modellene.
Den unike egenskapen til PUD-er er at de ikke er enzymatisk delt inn i enkeltceller under kultur eller analyse og opprettholder celleklynger i kultur. Derfor kan antall celler ikke telles nøyaktig under et mikroskop. For å løse dette problemet bestemmes antall celler visuelt ved å fôre et sentrifugerør som inneholder cellene med rør merket med nivåer for 50-200 μL (Figur 1B). Videre, fordi det er vanskelig å måle pelletsvolumet av celleklynger dyrket i en 25 cm2 kolbe visuelt, ble passasjetiden bestemt ved hjelp av middels fargeendring fra rød til gul og den merkbare økningen i enkeltceller eller rusk sammenstilt med tiden for passivisering som indikatorer (Figur 1A,C). Dette er poenget med passivitet for PUD-er. Mengden PUD-pellets måles visuelt etter sentrifugering ved hver mediumendring. Når pelletsvolumet slutter å øke, og mediet blir gult dagen etter middels utskifting, anses mediet å være mettet med tetthet, og passivring utføres. Pelletsvolumet er definert for hver PUD. Hvis PUD-ene ikke sprer seg, endres mengden medium fra 80% til 50% på tidspunktet for middels utveksling, og tettheten av PUD-er økes i kulturen.
En HTS egnet for PUD ble utviklet. Dens gjennomstrømning er minst ti til tjue 384-brønns plater utført ved hjelp av en 75 cm2 kolbe av PUD, og antall plater behandlet per dag er minst 50. I tillegg er resultatene av evalueringen av ulike anticancer-legemidler ved HTS ved hjelp av PDA-er allerede rapportert.
Når du utfører HTS, blir tilstopping av maskefilteret forårsaket av mincing av F-PUD-ene ved hjelp av cellefragmenterings- og dispersjonsutstyret adressert i utgangspunktet ved å endre maskestørrelsen på filteret til 100 μm. Det neste trinnet er å redusere volumet på PUD-suspensjonen som påføres glassbeholderen. Ved tilberedning av teststoffløsninger for HTS oppløses lavmolekylære forbindelser vanligvis i dimetylsulfoksid, og antistoffene oppløses i fosfatbufret saltvann. Riktig løsningsmiddel brukes som teststoff, og kontrolldataene hentes fra løsningsmidlet som brukes.
Nedenfor finner du en beskrivelse av hvordan man håndterer variasjoner i analysedataene. Hvis det er stor variasjon i dataene i testen ved hjelp av 384-brønnsplater, bør analyseplaten endres til et 96-brønns plateformat. PUD-fortynningsfaktoren (antall frøcelleklynger) undersøkes også etter sådd av platen. Til slutt kan celleplukkings- og bildesystemet brukes til å velge størrelsen på PUD-er for analysen. Før du legger til PUD-er i kammeret, bør enkeltceller og småcelleklynger fjernes ved lavhastighets sentrifugering for å kunne gjenkjenne PDOer på riktig måte. Hvis enkeltceller eller små celleklynger er synlige etter at du har lagt til PDI-er i kammeret, kan det utføres flere dispersjoner for å fjerne enkeltcellene. Deretter, selv om celleplukkings- og bildesystemet har en funksjon som gjør at platen kan holdes varm, brukes denne funksjonen ikke på grunn av fordampning av kulturmediet når systemet jobber i lang tid. Til slutt er volumet av celleklynger ukjent fordi det gjenkjennes av et planbilde. Hvis to eller flere PUD-er overlapper hverandre, gjenkjennes heller ikke en enkelt PUD på riktig måte. Det er imidlertid mulig å fjerne uønskede PDA-er ved hjelp av fjern-funksjonen ved å sjekke dem på det skannede bildet etter flyttingen.
Det elektriske impedansmålingsinstrumentet brukes vanligvis til tilhengermålkreftceller for å overvåke endringer i impedans under celleproliferasjon. Det oppdages derfor ikke en endring i celleindeksen for ikke-tilfølgende PDOer. I et forsøk på å løse dette problemet er det nødvendig å undersøke såingsforholdene som PUD-tetthet og enzymatisk behandling (celledissosiasjonsenzym og behandlingstid) avhengig av type PUD. Brønnene i platen må også belegges med en passende ekstracellulær matrise for såing av PUD-er. PUD-er blir sådd uten enzymatisk behandling, avhengig av type PUD. RLUN007 ble brukt til å måle impedansen ved å så PUD-ene på en 96-brønnsplate etter å ha dispergert dem ved enzymatisk behandling. RLUN007 ble behandlet med cellekulturens dissosiasjonsreagens i 20 min ved 37 °C for å spre cellene og feste dem til brønnene på en 96-brønnsplate. Gitt at dissosierte RLUN007-celler umiddelbart danner aggregater, er det ønskelig å frø på platene like etter filtrering ved hjelp av en sil. Etter å ha overført celleopphenget fra røret til et reservoar, ble reservoaret forsiktig flyttet fra høyre til venstre to til tre ganger og pipettert opp og ned fem ganger før sådd på platen. Suspensjonen ble også blandet med hvert tillegg til brønnen. Platen ble deretter plassert i et biologisk sikkerhetsskap i 30 min (for PUD) eller 15 min (for NK-celler) slik at cellene kunne fordele seg jevnt i brønnen. Det andre viktige poenget er at behandling med antistoffer og NK-celler bør tidsdestreres før celleindeksen når et platå og verdien ikke er mindre enn 0,5. Når det gjelder RLUN007, er den optimale tiden for å starte analysen 20-22 timer etter plating, og cellenummeret for såing er 5 x 104 celler / brønn.
Generelt bruker kulturen og analysene for tumororganoider ekstracellulære matriser som Matrigel for å skape tumorvevstillaser eller enzymer som trypsin og kollagenase for å forstyrre organoidene3,4,5,6,7. Fordelen med denne metoden er at ingen ekstracellulær matrise eller enzymatisk behandling er nødvendig under kultur og analyse (bortsett fra analyser ved hjelp av det elektriske impedansmålingsinstrumentet), noe som reduserer arbeidsbehov og kostnader betydelig. Videre er denne metoden relativt enkel å tilpasse seg HTS analysesystemer og ulike målesystemer. Imidlertid er bruken av en ekstracellulær matrise ønskelig for noen forskningsformål fordi den kan fungere som et stillas for celler og påvirke morfogenese, differensiering og homeostase i vev.
I denne studien ble PUD-er (RLUN007) med EGFR-mutasjon (L858R) som er klinisk følsomme for EGFR-hemmere og høyt uttrykk for EGFR-genet (data ikke vist) brukt til å evaluere EGFR-hemmere. Det ble demonstrert at følsomheten til RLUN007 for EGFR-hemmere var høyere enn for andre lungekreftavledede F-PUD13 (figur 4). Dermed er en HTS ved hjelp av PUD-er, som beholder egenskapene til tumorvev, overlegen for evaluering av potensielle anticancer-midler og presenterer muligheter for legemiddelvurdering og fremskritt i personlig medisin. Selv om HTS er egnet for den første screeningen av midler, reproduserer den ikke tumormikromiljøet og kan dermed ikke evaluere effekten av legemidler in vivo. Derfor er et in vitro-system som kan etterligne humant tumorvev in vivo ved samkultur med vaskulære endotelceller og andre stromale celler eller organ-on-a-chip-teknologi i fravær av dyremodeller nå under utvikling.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke pasientene som ga de kliniske prøvene som ble brukt i denne forskningen. Denne forskningen støttes av tilskudd fra Translational Research Program of Fukushima Prefecture.
384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
CELL HANDLER | Yamaha Motor | – | Cell picking and imaging system |
CellPet FT | JTEC | – | Cell fragmentation and dispersion equipment |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
Echo 555 | Labcyte | – | Liquid handler |
EnSpire | PerkinElmer | – | Plate reader |
E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | – | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | – | Cell viability analyzer |
xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | – | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | – | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |