Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) anvendes til at billedet og analysere dendritiske pigge i murine hippocampus.
Tredimensionel elektronmikroskopi (3D EM) giver mulighed for at analysere morfologiske parametre for dendritiske rygsøjler med nanoskalaopløsning. Derudover kan nogle funktioner i dendritiske rygsøjler, såsom volumen af rygsøjlen og postsynaptisk tæthed (PSD) (der repræsenterer postsynaptisk del af synapsen), tilstedeværelse af præsynaptisk terminal og glat endoplasmisk reticulum eller atypisk form af PSD (f.eks. multiin innerverede rygsøjler), kun observeres med 3D EM. Ved at anvende seriel blok-ansigt scanning elektronmikroskopi (SBEM) er det muligt at opnå 3D EM data lettere og på en mere reproducerbar måde end ved udførelse af traditionel seriel sektionsopdele. Her viser vi, hvordan man forbereder muse hippocampalprøver til SBEM-analyse, og hvordan denne protokol kan kombineres med immunfluorescensundersøgelse af dendritiske rygsøjler. Mild fiksering perfusion giver os mulighed for at udføre immunfluorescens undersøgelser med lys mikroskopi på den ene halvdel af hjernen, mens den anden halvdel blev forberedt til SBEM. Denne fremgangsmåde reducerer antallet af dyr, der skal anvendes til undersøgelsen.
De fleste af de excitatoriske synapser i centralnervesystemet er placeret på dendritiske rygsøjler – små fremspring af en neuronal membran. Disse fremspring danner begrænsede biokemiske rum, der styrer intracellulær signaltransduktion. Strukturel plasticitet af dendritiske rygsøjler og synapser er tæt forbundet med de funktionelle ændringer i synaptisk effekt, der ligger til grund for så vigtige processer som læring og hukommelse1,2. Det er vigtigt at bemærke, at elektronmikroskopi (EM) er den eneste teknik, der gør det muligt at afgøre, om en dendritisk rygsøjle har et præsynaptisk input. EM-opløsning er også nødvendig for at studere ultrastrukturelle detaljer såsom form af en postsynaptisk tæthed (PSD), der repræsenterer en postsynaptisk del af en synapse, eller dimensioner af en dendritisk rygsøjle, samt størrelsen og formen af en axonal bouton. Derudover er det med EM muligt at visualisere synapser og deres omgivelser.
Takket være fremskridt inden for billed- og computerteknologier er det muligt at rekonstruere hele neurale kredsløb. Volumenelektronmikroskopiteknikker, såsom seriel sektionstransmissionselektronmikroskopi (ssTEM), seriel blok-ansigtsscanning elektronmikroskopi (SBEM) og fokuseret ionstrålescanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) er almindeligt anvendt til neuronale kredsløbsrekonstruktioner3.
I vores undersøgelser anvendes SBEM-metoden med succes til at undersøge den strukturelle plasticitet af dendritiske rygsøjler og PSD’er i prøver af musen hippocampus og organotypiske hjerneskiver 4,5. SBEM er baseret på installation af en miniature ultramikromitomi inde i scanningselektronmikroskopkammeret6,7,8,9. Toppen af prøveblokken afbildes, og derefter skæres prøven i en bestemt dybde af ultramikrotomen og afslører en ny blokflade, som igen afbildes, og derefter gentages processen8. Som følge heraf er det kun billedet af en blok-ansigt er tilbage, mens skiven, der er blevet skåret er tabt som snavs. Derfor kaldes SBEM en destruktiv teknik, hvilket betyder, at det ikke er muligt at afbilde det samme sted igen. Fordelen ved de destruktive on-block-metoder er imidlertid, at de ikke lider af vridningsproblemer og sektionstab, der kan påvirke datakvaliteten og dataanalysen3betydeligt . Desuden giver SBEM mulighed for at afbilde et relativt stort synsfelt ( > 0,5 mm × 0,5 mm) ved høj opløsning3.
For at anvende SBEM skal prøverne forberedes i henhold til en dedikeret, meget kontrasterende protokol på grund af den backscattered elektrondetektor, der bruges til at erhverve billeder. Vi viser her, hvordan man udfører prøveforberedelse i henhold til protokollen baseret på en procedure udviklet af Deerinck10 (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) metode), ved hjælp af reducerede osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) pletter udviklet i 1980’erne8,11. Derudover introducerer vi en to-trins fikseringsmetode med mild fikseringsperfusion, der gør det muligt at bruge den samme hjerne både til immunfluorescensundersøgelser med lysmikroskopi og SBEM.
I protokollen er en musehjerne primært fastgjort med et mildt fikseringsmiddel og skæres derefter i halve, og den ene halvkugle anbringes og forberedes til immunfluorescens (IF), mens den anden til EM-undersøgelser (Figur 1).
Figur 1. Skematisk repræsentation af arbejdsprocessen for forberedelsen af dendritiske rygsøjler til analysen med SBEM. Mus blev ofret og perfunderet med en mild primær fikseringsmiddel. Hjernen blev skåret i halve, og en halvkugle blev anbragt med immunfluorescens (IF)-dedikeret fiksativ, kryobeskyttet, skåret ved hjælp af en kryostat og behandlet for IF-undersøgelser, mens den anden halvkugle blev anbragt med EM fiksativ, skåret med vibratomet og forberedt til EM-undersøgelser. Hjerneskiver til SBEM-undersøgelser blev kontrasteret, fladt indlejret i harpiks, så blev en CA1-region af hippocampus monteret på stiften og afbildet med SBEM (Figur 1). Den del af protokollen, der er fremhævet i en gul boks, blev vist i videoen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Der er mange variationer af den primære NCMIR-metode beskrevet af Deerinck i 201010. De grundlæggende principper forbliver de samme, men afhængigt af den undersøgte type materiale gennemføres små ændringer. Det blev tidligere beskrevet, at forskellige harpikser kan bruges til at integrere prøver til SBEM, og for eksempel i tilfælde af planter er Spurr’s den valgte harpiks på grund af dens lave viskositet, der giver bedre infiltration gennem cellevæggene22,</…
The authors have nothing to disclose.
SBEM billeddannelse, lys mikroskopi billeddannelse og elektron mikroskopi prøve forberedelse blev udført med brug af udstyr fra Laboratory of Imaging Tissue and Function, der fungerer som en billeddannelse kerne facilitet på Nencki Institute of Experimental Biology.
Til forberedelse af figur 1 blev billedet af en mus (Souris_02) og et hætteglas fra https://smart.servier.com/ brugt.
Dette arbejde blev støttet af National Science Centre (Polen) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) tildelt KR.
Anesthetic: | |||
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Fixatives: | |||
Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
Perfusion: | |||
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
Brain slices preparation for EM: | |||
12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
Brain slices preparation for IF: | |||
96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
Immunostaining: | |||
24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
Electron microsocpy sample preparation | |||
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, 98% (HPLC) |
Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trace metals basis |
Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N) |
Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
Specimen mounting for SBEM | |||
96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
50-001521 | |
Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
10-006003 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
Software | webpage | tutorials | |
FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
Animals | |||
Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |