Summary

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Published: October 02, 2021
doi:

Summary

La microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) viene applicata per l’immagine e l’analisi delle spine dendritiche nell’ippocampo murino.

Abstract

La microscopia elettronica tridimensionale (3D EM) offre la possibilità di analizzare i parametri morfologici delle spine dendritiche con risoluzione su scala nanometrica. Inoltre, alcune caratteristiche delle spine dendritiche, come il volume della colonna vertebrale e la densità post-sinaptica (PSD) (che rappresenta la parte post-sinaptica della sinapsi), la presenza di terminale presinaptico e il reticolo endoplasmatico liscio o la forma atipica di PSD (ad esempio, spine multi-innervate), possono essere osservate solo con EM 3D. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) è possibile ottenere dati EM 3D in modo più semplice e riproducibile rispetto a quando si esegue il sezionamento seriale tradizionale. Qui mostriamo come preparare campioni di ippocampo di topo per l’analisi SBEM e come questo protocollo può essere combinato con lo studio di immunofluorescenza delle spine dendritiche. La lieve perfusione di fissazione ci consente di eseguire studi di immunofluorescenza con microscopia ottica su una metà del cervello, mentre l’altra metà è stata preparata per SBEM. Questo approccio riduce il numero di animali da utilizzare per lo studio.

Introduction

La maggior parte delle sinapsi eccitatorie nel sistema nervoso centrale si trovano su spine dendritiche – piccole sporgenze di una membrana neuronale. Queste sporgenze formano compartimenti biochimici confinati che controllano la trasduzione del segnale intracellulare. La plasticità strutturale delle spine dendritiche e delle sinapsi è strettamente correlata ai cambiamenti funzionali nell’efficacia sinaptica che sono alla base di processi importanti come l’apprendimento e la memoria1,2. È importante notare che la microscopia elettronica (EM) è l’unica tecnica che consente di determinare se una colonna vertebrale dendritica ha un input presinaptico. La risoluzione EM è necessaria anche per studiare dettagli ultrastrutturali come la forma di una densità postsinaptica (PSD), che rappresenta una parte postsinaptica di una sinapsi, o le dimensioni di una colonna vertebrale dendritica, nonché le dimensioni e la forma di un bouton assonale. Inoltre, con EM è possibile visualizzare le sinapsi e l’ambiente circostante.

Grazie ai progressi delle tecnologie di imaging e calcolo è possibile ricostruire interi circuiti neurali. Le tecniche di microscopia elettronica a volume, come la microscopia elettronica a trasmissione a sezione seriale (ssTEM), la microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) e la microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) sono comunemente utilizzate per le ricostruzioni di circuiti neuronali3.

Nei nostri studi, il metodo SBEM è impiegato con successo per studiare la plasticità strutturale delle spine dendritiche e delle PSD in campioni di ippocampo di topo e fette di cervello organotipico 4,5. Lo SBEM si basa sull’installazione di un ultramicrotomo in miniatura all’interno della camera del microscopio elettronico a scansione6,7,8,9. La parte superiore del blocco campione viene tagliata, quindi il campione viene tagliato a una profondità specificata dall’ultramicrotomo, rivelando una nuova faccia del blocco, che viene nuovamente tagliata e quindi il processo viene ripetuto8. Di conseguenza, rimane solo l’immagine di una faccia di blocco mentre la fetta che è stata tagliata viene persa come detriti. Ecco perché SBEM è chiamata una tecnica distruttiva, il che significa che non è possibile immaginare di nuovo lo stesso posto. Tuttavia, il vantaggio dei metodi distruttivi on-block è che non soffrono di problemi di deformazione e perdita di sezione che possono influire in modo significativo sulla qualità dei dati e sull’analisi dei dati3. Inoltre, SBEM dà la possibilità di visualizzare un campo visivo relativamente ampio (> 0,5 mm × 0,5 mm) ad alta risoluzione3.

Per utilizzare SBEM, i campioni devono essere preparati secondo un protocollo dedicato e altamente contrastante a causa del rilevatore di elettroni retrodatterato utilizzato per l’acquisizione di immagini. Mostriamo qui come eseguire la preparazione del campione secondo il protocollo basato su una procedura sviluppata da Deerinck10 (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) metodo), utilizzando macchie ridotte di osmio-tiocarboidrazide-osmio (rOTO) sviluppate nel 19808,11. Inoltre, introduciamo un approccio di fissazione in due fasi, con lieve perfusione di fissazione che consente di utilizzare lo stesso cervello sia per studi di immunofluorescenza con microscopia ottica e SBEM.

Nel protocollo un cervello di topo viene fissato principalmente con un lieve fissativo, e poi tagliato a metà, e un emisfero viene postfisso e preparato per l’immunofluorescenza (IF), mentre l’altro per gli studi EM (Figura 1).

Figure 1
Figura 1. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro per la preparazione delle spine dendritiche per l’analisi con SBEM. I topi sono stati sacrificati e perfusi con un lieve fissativo primario. Il cervello è stato tagliato a metà e un emisfero è stato postfisso con fissativo dedicato all’immunofluorescenza (IF), crioprotetto, affettato usando un criostato ed elaborato per studi IF, mentre l’altro emisfero è stato postfisso con fissativo EM, affettato con il vibratoma e preparato per gli studi EM. Le fette di cervello per gli studi SBEM sono state contrastate, piatte incorporate nella resina, quindi una regione CA1 dell’ippocampo è stata montata sul perno e tagliata con SBEM (Figura 1). La parte del protocollo evidenziata in una casella gialla è stata presentata nel video. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

La ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida dell’Istituto Nencki e il permesso del Comitato Etico Locale. Gli studi sono stati effettuati conformemente alla direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609/CEE), alla legge polacca sulla protezione degli animali e approvati dal primo comitato etico locale di Varsavia. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza. ATTENZIONE: Tutte le p…

Representative Results

Utilizzando il metodo sopra descritto ad alto contrasto, è possibile ottenere immagini a buona risoluzione del tessuto cerebrale del topo. Un ampio campo visivo fornito dalla tecnica SBEM facilita la selezione precisa della regione di interesse. La grande immagine della regione CA1 dell’ippocampo è stata presa per misurare la lunghezza dello strato radiato (SR) (Figura 2A) e per impostare l’imaging precisamente al centro (Figura 2B). Successivamente, …

Discussion

Ci sono molte varianti del metodo NCMIR primario descritto da Deerinck nel 201010. I principi di base rimangono gli stessi ma, a seconda del tipo di materiale studiato, vengono implementate lievi modifiche. È stato descritto in precedenza che diverse resine possono essere utilizzate per incorporare campioni per SBEM e ad esempio nel caso di piante, Spurr’s è la resina di scelta grazie alla sua bassa viscosità che consente una migliore infiltrazione attraverso le pareti cellulari<sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’imaging SBEM, l’imaging al microscopio ottico e la preparazione del campione al microscopio elettronico sono stati eseguiti con l’uso dell’attrezzatura del Laboratorio di imaging tissutale e funzionale che funge da struttura centrale di imaging presso l’Istituto di biologia sperimentale di Nencki.

Per la preparazione della Figura 1 è stata utilizzata l’immagine di un mouse (Souris_02) e di una fiala del https://smart.servier.com/.

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Centre (Polonia) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) assegnato a KR.

Materials

Anesthetic:
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Sodium pentobarbital (Morbital) Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Fixatives:
Glutaraldehyde (GA) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA G5882 Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative
Hydrochloric acid (HCl) POCH, Gliwice, Poland 575283115 pure p.a.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 441244 prilled, 95%
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA P4417-50TAB tablets
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S5881 reagent grade, Equation98%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S3264
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S3139
Perfusion:
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 14519-14
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10091-12
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany KD-FINE 900413 1.80 x 40 mm
Pair of fine (Graefe) tweezers Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11050-10
Perfusion pump Lead Fluid BQ80S
Plastic vials Profilab, Warsaw, Poland 534.02 plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm
Straight iris scissors (~9 cm) Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 14058-11
Brain slices preparation for EM:
12-well plate NEST, Rahway, NJ, USA 712001
Cyanoacrylic glue Fenedur, Montevideo, Uruguay
Glass vials Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 72632 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100
Pasteur pipette VWR, Radnor, PA, USA 612-4545 LDPE, disposable, 7.5 ml
Razor blade Wilkinson Sword, London, UK Classic double edge safety razor blades
Scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK No. 20
Vibratome Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica VT1000 S
Brain slices preparation for IF:
96-well plate NEST, Rahway, NJ, USA 701101
Criostat Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica CM 1950
Ethylene glycol Bioshop, Burlington, Canada ETH001
Low-profile disposable blade 819 Leica Biosystems Inc., USA 14035838925
Scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK No. 20
Sodium azide (NaN3) POCH, Gliwice, Poland 792770426
Sucrose POCH, Gliwice, Poland 772090110
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound Leica Biosystems, Switzerland 14020108926
Immunostaining:
24-well plate NEST, Rahway, NJ, USA 702001
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody Merck-Millipore, Burlington, MA, USA MAB1598
Confocal microscope Zeiss, Göttingen, Germany Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm)
Cover slide Menzel Glaser, Braunschweig, Germany B-1231 24 x 60 mm
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA A31570
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 00-4959-52
Microscope slide Thermo Scientific, Waltham, MA, USA AGAA00008 SuperFrost
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA 017-000-121
Shaker JWElectronic, Warsaw, Poland KL-942
TritonT X-100 Reagent Grade Bioshop, Burlington, Canada TRX506
Electron microsocpy sample preparation
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate POCH, Gliwice, Poland 746980113
Aclar 33C Film Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 50425 Fluoropolymer Film embedding sheet
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA T58203 Epoxy embedding medium accelerator
Durcupan ACM single component A, M Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 44611 Durcupan ACM single component A, M epoxy resin
Durcupan ACM single component B Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 44612 Durcupan ACM single component B, hardener 964
Durcupan ACM single component D Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 44614 Durcupan ACM single component D , plasticizer
Ethyl alcohol absolute POCH, Gliwice, Poland 64-17-5 Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC
Genlab laboratory oven Wolflabs, York, UK Mino/18/SS Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply
L-Aspartic acid Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA A-9256 reagent grade, Equation98% (HPLC)
Lead (II) nitrate Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 467790 Equation99.95% trace metals basis
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 75632 for electron microscopy, 4% in H2O
pH meter Elmetron, Zabrze, Poland CP-5-5
Rotator BioSan, Józefów, Poland Multi Bio RS-24 rotator Multi Bio RS-24
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S5881 reagent grade, Equation98%, pellets (anhydrous)
Sunflower mini shaker Grant bio, Shepreth,UK PD-3D
Syringe filter Millipore, Burlington, MA, USA SLGP033NB 0,22 µm pore size
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 88535 purum p.a., for electron microscopy, Equation99.0% (N)
Uranyl acetate Serva, Heidelberg, Germany 77870 Uranyl acetate·2H2O, research grade
Water bath WSL, Swietochlowice, Poland LWT
Specimen mounting for SBEM
96-well culture plate VWR, Radnor, PA, USA 734-2782 96-well plates, round bottom, non treated
AM Gatan 3View stub handling tweezers Micro to Nano, Haarlem, Netherlands
Netherlands
50-001521
Binocular OPTA-TECH, Warsaw, Poland X2000
Conductive glue Chemtronics, Georgia, USA CW2400 conductive eopxy
Gatan 3View sample pin stubs Micro to Nano, Haarlem, Netherlands
Netherlands
10-006003
Parafilm Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA P7793 roll size 20 in. × 50 ft
Pelco conductive silver paint Ted Pella, Redding, CA, USA 16062-15 PELCO® Conductive Silver Paint, 15g
Razor blades double edge Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 72000 Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box.
Scanning Electron Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm
trim 90° diamond knife Diatome Ltd., Nidau, Switzerland DTB90
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica ultracutR
Software webpage tutorials
FijiJ https://fiji.sc/
Microscopy Image Browser http://mib.helsinki.fi/ http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Reconstruct https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Animals
Mice Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.

References

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
  2. Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
  3. Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience. Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).
  4. Śliwińska, M. A., et al. Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII. Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).
  5. Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density. Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).
  6. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  7. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  8. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).
  9. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).
  11. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  12. Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).
  15. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  16. Mercer, E. H. a scheme for section staining in electron microscopy. Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  19. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).
  20. Roels, J., et al. An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).
  21. Radwanska, K., et al. Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).
  22. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  23. Fendrych, M., et al. Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis. Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).
  24. Russell, M. R. G., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  25. Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae). Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).
  26. Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).
  27. Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).
  28. Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella. Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).
  29. Starborg, T., et al. Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization. Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).
  30. Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).
  31. Bojko, A., et al. Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).
  32. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).
  33. Glauert, A. M., Lewis, P. R. . Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).
  34. Genoud, C. Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice. Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).

Play Video

Cite This Article
Śliwińska, M. A., Cały, A., Szymański, J., Radwańska, K. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines. J. Vis. Exp. (176), e62712, doi:10.3791/62712 (2021).

View Video