Summary

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBEM) para o estudo de espinhas dendríticas

Published: October 02, 2021
doi:

Summary

A Microscopia eletrônica de varredura de blocos de blocos serial (SBEM) é aplicada à imagem e análise de colunas dendríticas no hipocampo murino.

Abstract

A microscopia eletrônica tridimensional (3D EM) oferece a possibilidade de analisar parâmetros morfológicos de colunas dendríticas com resolução de nanoescala. Além disso, algumas características das espinhas dendríticas, como volume da coluna vertebral e densidade pós-sináptica (PSD) (representando parte pós-sináptica da sinapse), presença de terminal pré-sináptico e retículo endoplasmático liso ou forma atípica de PSD (por exemplo, colunas multi-inervadas), podem ser observadas apenas com EM 3D. Ao empregar microscopia eletrônica de varredura de blocos serial (SBEM), é possível obter dados EM 3D mais fáceis e de forma mais reprodutível do que ao realizar seções seriais tradicionais. Aqui mostramos como preparar amostras hipocampais de camundongos para análise do SBEM e como este protocolo pode ser combinado com o estudo de imunofluorescência de espinhas dendríticas. A fixação leve da perfusão nos permite realizar estudos de imunofluorescência com microscopia leve em metade do cérebro, enquanto a outra metade foi preparada para o SBEM. Essa abordagem reduz o número de animais a serem utilizados para o estudo.

Introduction

A maioria das sinapses excitatórias no sistema nervoso central estão localizadas em espinhas dendríticas – pequenas saliências de uma membrana neuronal. Essas saliências formam compartimentos bioquímicos confinados que controlam a transdução de sinal intracelular. A plasticidade estrutural das espinhas e sinapses dendríticas está intimamente relacionada com as mudanças funcionais na eficácia sináptica que fundamentam processos tão importantes como a aprendizagem e a memória1,2. É importante notar que a microscopia eletrônica (EM) é a única técnica que permite determinar se uma coluna dendrítica tem uma entrada pré-sináptica. A resolução EM também é necessária para estudar detalhes ultraestruturais, como a forma de uma densidade postiáspática (PSD), representando uma parte postsiáspática de uma sinapse, ou dimensões de uma coluna dendrítica, bem como o tamanho e a forma de um bouton axonal. Além disso, com o EM é possível visualizar sinapses e seus arredores.

Graças aos avanços nas tecnologias de imagem e computação é possível reconstruir circuitos neurais inteiros. Técnicas de microscopia eletrônica de volume, como microscopia eletrônica de transmissão de seção serial (ssTEM), microscopia eletrônica de varredura de rosto serial (SBEM) e microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons (FIB-SEM) são comumente utilizadas para reconstruções de circuito neuronal3.

Em nossos estudos, o método SBEM é empregado com sucesso para investigar a plasticidade estrutural de espinhos dendráticos e PSDs em amostras do hipocampo do camundongo e das fatias cerebrais organotípicas 4,5. O SBEM é baseado na instalação de um ultramicromo em miniatura dentro da câmara de microscópio eletrônico de varredura6,7,8,9. A parte superior do bloco de amostra é imageda e, em seguida, a amostra é cortada a uma profundidade especificada pelo ultramicrotome, revelando um novo bloco-face, que é novamente imagedo e, em seguida, o processo é repetido8. Como resultado, apenas a imagem de um rosto de bloco é deixada enquanto a fatia que foi cortada é perdida como detritos. É por isso que o SBEM é chamado de técnica destrutiva, o que significa que não é possível imaginar o mesmo lugar novamente. No entanto, a vantagem dos métodos destrutivos no bloco é que eles não sofrem de problemas de deformação e perda de seção que podem afetar significativamente a qualidade dos dados e a análise de dados3. Além disso, a SBEM dá a possibilidade de imagem de um campo de visão relativamente grande (> 0,5 mm × 0,5 mm) em alta resolução3.

Para empregar o SBEM, as amostras devem ser preparadas de acordo com um protocolo dedicado e altamente contrastante devido ao detector de elétrons backscattered usado para a aquisição de imagens. Mostramos aqui como realizar a preparação da amostra de acordo com o protocolo baseado em um procedimento desenvolvido pelo Deerinck10 (Centro Nacional de Pesquisa em Microscopia e Imagem (NCMIR), utilizando manchas reduzidas de osmium-thiocarbohydrazida-osmium (rOTO) desenvolvidas na década de 19808,11. Além disso, introduzimos uma abordagem de fixação em duas etapas, com perfusão de fixação leve que permite usar o mesmo cérebro tanto para estudos de imunofluorescência com microscopia leve e SBEM.

No protocolo, um cérebro de camundongo é fixado principalmente com um fixador leve, e depois cortado em metades, e um hemisfério é postfixado e preparado para imunofluorescência (IF), enquanto o outro para estudos EM(Figura 1).

Figure 1
Figura 1. Representação esquemática do fluxo de trabalho para a preparação das lombadas dendríticas para a análise com a SBEM. Os ratos foram sacrificados e perfundidos com um leve fixador primário. O cérebro foi cortado em metades, e um hemisfério foi postfixado com imunofluorescência (IF) dedicada fixação, crioprotegida, fatiada usando um criostat e processada para estudos if, enquanto o outro hemisfério foi postfixado com FIXAtivo EM, fatiado com o vibratome e preparado para estudos EM. As fatias cerebrais para estudos da SBEM foram contrastadas, planas embutidas em resina, em seguida, uma região ca1 do hipocampo foi montada ao pino, e imageada com SBEM (Figura 1). A parte do protocolo destacada em uma caixa amarela foi destaque no vídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

A pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes do Instituto Nencki e a permissão do Comitê De ética Local. Os estudos foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho europeu de Comunidades de 24 de Novembro de 1986 (86/609/CEE), Lei de Proteção Animal da Polônia e aprovado pelo primeiro Comitê de Ética Local em Varsóvia. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento. ATENÇÃO: Todos os procedimentos descritos abaixo …

Representative Results

Usando o método descrito acima de alto contraste, podem ser obtidas imagens de boa resolução do tecido cerebral do camundongo. Um grande campo de visão proporcionado pela técnica da SBEM facilita a seleção precisa da região de interesse. A grande imagem da região ca1 do hipocampo foi tomada para medir o comprimento do radiador de estrato (SR) (Figura 2A) e para definir a imagem precisamente no centro (Figura 2B). Em seguida, a pilha de imagens …

Discussion

Existem muitas variações do método NCMIR primário descrito por Deerinck em 201010. Os princípios básicos permanecem os mesmos, mas, dependendo do tipo de material estudado, pequenas mudanças são implementadas. Foi descrito anteriormente que diferentes resinas podem ser usadas para incorporar espécimes para SBEM e, por exemplo, no caso de plantas, Spurr é a resina de escolha devido à sua baixa viscosidade que permite melhor infiltração através das paredescelulares 22…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Foram realizadas imagens da SBEM, imagens de microscopia leve e preparação de amostras de microscopia eletrônica com o uso do equipamento do Laboratório de Tecido e Função de Imagem, que serve como uma instalação de núcleo de imagem no Instituto Nencki de Biologia Experimental.

Para a preparação da Figura 1, foi utilizada a imagem de um rato (Souris_02), e um frasco da https://smart.servier.com/.

Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência (Polônia) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) concedido à KR.

Materials

Anesthetic:
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Sodium pentobarbital (Morbital) Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Fixatives:
Glutaraldehyde (GA) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA G5882 Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative
Hydrochloric acid (HCl) POCH, Gliwice, Poland 575283115 pure p.a.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 441244 prilled, 95%
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA P4417-50TAB tablets
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S5881 reagent grade, Equation98%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S3264
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S3139
Perfusion:
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 14519-14
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10091-12
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany KD-FINE 900413 1.80 x 40 mm
Pair of fine (Graefe) tweezers Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11050-10
Perfusion pump Lead Fluid BQ80S
Plastic vials Profilab, Warsaw, Poland 534.02 plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm
Straight iris scissors (~9 cm) Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 14058-11
Brain slices preparation for EM:
12-well plate NEST, Rahway, NJ, USA 712001
Cyanoacrylic glue Fenedur, Montevideo, Uruguay
Glass vials Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 72632 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100
Pasteur pipette VWR, Radnor, PA, USA 612-4545 LDPE, disposable, 7.5 ml
Razor blade Wilkinson Sword, London, UK Classic double edge safety razor blades
Scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK No. 20
Vibratome Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica VT1000 S
Brain slices preparation for IF:
96-well plate NEST, Rahway, NJ, USA 701101
Criostat Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica CM 1950
Ethylene glycol Bioshop, Burlington, Canada ETH001
Low-profile disposable blade 819 Leica Biosystems Inc., USA 14035838925
Scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK No. 20
Sodium azide (NaN3) POCH, Gliwice, Poland 792770426
Sucrose POCH, Gliwice, Poland 772090110
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound Leica Biosystems, Switzerland 14020108926
Immunostaining:
24-well plate NEST, Rahway, NJ, USA 702001
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody Merck-Millipore, Burlington, MA, USA MAB1598
Confocal microscope Zeiss, Göttingen, Germany Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm)
Cover slide Menzel Glaser, Braunschweig, Germany B-1231 24 x 60 mm
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA A31570
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 00-4959-52
Microscope slide Thermo Scientific, Waltham, MA, USA AGAA00008 SuperFrost
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA 017-000-121
Shaker JWElectronic, Warsaw, Poland KL-942
TritonT X-100 Reagent Grade Bioshop, Burlington, Canada TRX506
Electron microsocpy sample preparation
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate POCH, Gliwice, Poland 746980113
Aclar 33C Film Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 50425 Fluoropolymer Film embedding sheet
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA T58203 Epoxy embedding medium accelerator
Durcupan ACM single component A, M Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 44611 Durcupan ACM single component A, M epoxy resin
Durcupan ACM single component B Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 44612 Durcupan ACM single component B, hardener 964
Durcupan ACM single component D Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 44614 Durcupan ACM single component D , plasticizer
Ethyl alcohol absolute POCH, Gliwice, Poland 64-17-5 Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC
Genlab laboratory oven Wolflabs, York, UK Mino/18/SS Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply
L-Aspartic acid Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA A-9256 reagent grade, Equation98% (HPLC)
Lead (II) nitrate Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 467790 Equation99.95% trace metals basis
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 75632 for electron microscopy, 4% in H2O
pH meter Elmetron, Zabrze, Poland CP-5-5
Rotator BioSan, Józefów, Poland Multi Bio RS-24 rotator Multi Bio RS-24
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S5881 reagent grade, Equation98%, pellets (anhydrous)
Sunflower mini shaker Grant bio, Shepreth,UK PD-3D
Syringe filter Millipore, Burlington, MA, USA SLGP033NB 0,22 µm pore size
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 88535 purum p.a., for electron microscopy, Equation99.0% (N)
Uranyl acetate Serva, Heidelberg, Germany 77870 Uranyl acetate·2H2O, research grade
Water bath WSL, Swietochlowice, Poland LWT
Specimen mounting for SBEM
96-well culture plate VWR, Radnor, PA, USA 734-2782 96-well plates, round bottom, non treated
AM Gatan 3View stub handling tweezers Micro to Nano, Haarlem, Netherlands
Netherlands
50-001521
Binocular OPTA-TECH, Warsaw, Poland X2000
Conductive glue Chemtronics, Georgia, USA CW2400 conductive eopxy
Gatan 3View sample pin stubs Micro to Nano, Haarlem, Netherlands
Netherlands
10-006003
Parafilm Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA P7793 roll size 20 in. × 50 ft
Pelco conductive silver paint Ted Pella, Redding, CA, USA 16062-15 PELCO® Conductive Silver Paint, 15g
Razor blades double edge Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 72000 Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box.
Scanning Electron Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm
trim 90° diamond knife Diatome Ltd., Nidau, Switzerland DTB90
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica ultracutR
Software webpage tutorials
FijiJ https://fiji.sc/
Microscopy Image Browser http://mib.helsinki.fi/ http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Reconstruct https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Animals
Mice Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.

References

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
  2. Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
  3. Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience. Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).
  4. Śliwińska, M. A., et al. Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII. Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).
  5. Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density. Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).
  6. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  7. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  8. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).
  9. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).
  11. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  12. Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).
  15. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  16. Mercer, E. H. a scheme for section staining in electron microscopy. Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  19. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).
  20. Roels, J., et al. An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).
  21. Radwanska, K., et al. Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).
  22. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  23. Fendrych, M., et al. Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis. Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).
  24. Russell, M. R. G., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  25. Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae). Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).
  26. Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).
  27. Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).
  28. Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella. Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).
  29. Starborg, T., et al. Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization. Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).
  30. Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).
  31. Bojko, A., et al. Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).
  32. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).
  33. Glauert, A. M., Lewis, P. R. . Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).
  34. Genoud, C. Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice. Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).

Play Video

Cite This Article
Śliwińska, M. A., Cały, A., Szymański, J., Radwańska, K. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines. J. Vis. Exp. (176), e62712, doi:10.3791/62712 (2021).

View Video