A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Seriell blokk-ansiktsskanning Elektronmikroskopi (SBEM) påføres bildet og analyserer dendrittiske spines i murin hippocampus.

Abstract

Tredimensjonal elektronmikroskopi (3D EM) gir en mulighet til å analysere morfologiske parametere av dendritiske spines med nanoskala oppløsning. I tillegg kan noen funksjoner i dendrittiske ryggrader, for eksempel volum av ryggraden og postsynaptisk tetthet (PSD) (som representerer postsynaptisk del av synapsen), tilstedeværelse av presynaptisk terminal og glatt endoplasmisk retikulum eller atypisk form for PSD (f.eks. multi-innerverte spines), bare observeres med 3D EM. Ved å bruke seriell blokk-ansikt skanning elektronmikroskopi (SBEM) er det mulig å skaffe 3D EM-data enklere og på en mer reproduserbar måte enn ved utførelse av tradisjonell seriell seksjonering. Her viser vi hvordan du forbereder mus hippocampal prøver for SBEM analyse og hvordan denne protokollen kan kombineres med immunfluorescence studie av dendritiske spines. Mild fikseringsperfusjon gjør at vi kan utføre immunfluorescensstudier med lett mikroskopi på den ene halvdelen av hjernen, mens den andre halvparten var forberedt på SBEM. Denne tilnærmingen reduserer antall dyr som skal brukes til studien.

Introduction

De fleste eksitatoriske synapsene i sentralnervesystemet ligger på dendritiske spines – små fremspring av en nevronmembran. Disse fremspringene danner begrensede biokjemiske rom som styrer intracellulær signaltransduksjon. Strukturell plastisitet av dendritiske spines og synapser er nært knyttet til funksjonelle endringer i synaptisk effekt som ligger til grunn for slike viktige prosesser som læring og minne^1,2. Det er viktig å merke seg at elektronmikroskopi (EM) er den eneste teknikken som gjør det mulig å avgjøre om en dendritisk ryggrad har en presynaptisk inngang. EM-oppløsning er også nødvendig for å studere ultrastrukturelle detaljer som form av postsynaptisk tetthet (PSD), som representerer en postsynaptisk del av en synapse, eller dimensjoner av en dendritisk ryggrad, samt størrelsen og formen på en axonal bouton. I tillegg, med EM er det mulig å visualisere synapser og deres omgivelser.

Takket være fremskritt innen bilde- og datateknologi er det mulig å rekonstruere hele nevrale kretser. Volumelektronmikroskopiteknikker, for eksempel seriell seksjonsoverføringselektronmikroskopi (ssTEM), seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBEM), og fokusert ionstråleskanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) brukes vanligvis til nevronale kretsrekonstruksjoner³.

I våre studier er SBEM-metoden vellykket brukt til å undersøke den strukturelle plastisiteten til dendritiske spines og PSDs i prøver av musen hippocampus og organotypiske hjerneskiver ^4,5. SBEM er basert på installasjon av en miniatyr ultramikrotomi inne i skanning elektron mikroskop kammer^6,7,8,9. Toppen av prøveblokken er avbildet, og deretter blir prøven kuttet på en bestemt dybde av ultramikrotomet, og avslører en ny blokk-ansikt, som igjen er avbildet og deretter prosessen gjentas⁸. Som et resultat er bare bildet av en blokk-ansikt igjen mens stykket som er kuttet, går tapt som rusk. Det er derfor SBEM kalles en destruktiv teknikk, noe som betyr at det ikke er mulig å bilde samme sted igjen. Fordelen med de destruktive on-block-metodene er imidlertid at de ikke lider av fordreiningsproblemer og seksjonstap som kan påvirke datakvaliteten og dataanalysen³betydelig . Videre gir SBEM muligheten til å bilde et relativt stort synsfelt (> 0,5 mm × 0,5 mm) ved høy oppløsning³.

For å bruke SBEM må prøver tilberedes i henhold til en dedikert, svært kontrasterende protokoll på grunn av den bakscattered elektrondetektoren som brukes til å skaffe bilder. Vi viser her hvordan du utfører prøvepreparering i henhold til protokollen basert på en prosedyre utviklet av Deerinck¹⁰ (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) metode), ved hjelp av redusert osmium-tiocarbohydrazide-osmium (rOTO) flekker utviklet på 1980-tallet^8,11. I tillegg introduserer vi en to-trinns fiksering tilnærming, med mild fiksering perfusjon som gjør det mulig å bruke samme hjerne både for immunfluorescence studier med lys mikroskopi og SBEM.

I protokollen er en musehjerne primært festet med et mildt fikseringsmiddel, og deretter kuttet i halvdeler, og en halvkule er postfixed og forberedt på immunfluorescence (IF), mens den andre for EM-studier (Figur 1).

Figur 1. Skjematisk representasjon av arbeidsflyten for klargjøring av dendrittiske ryggrader for analysen med SBEM. Mus ble ofret og perfundert med et mildt primært fikseringsmiddel. Hjernen ble kuttet i halvdeler, og en halvkule ble postfixed med immunfluorescence (IF)-dedikert fixative, kryorotected, skiver ved hjelp av en kryostat og behandlet for IF-studier, mens den andre halvkule ble postfixed med EM fixative, skiver med vibratom og forberedt for EM-studier. Hjerneskiver for SBEM-studier ble kontrastert, flat innebygd i harpiks, deretter ble en CA1-region av hippocampus montert på pinnen, og avbildet med SBEM (Figur 1). Den delen av protokollen som er uthevet i en gul boks, ble omtalt i videoen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Forskningen ble utført i samsvar med Nencki Institutes retningslinjer og tillatelse fra Den lokale etiske komité. Studiene ble utført i samsvar med Det europeiske fellesskapsråds direktiv av 24. Alle anstrengelser ble gjort for å minimere antall dyr som ble brukt og deres lidelse. FORSIKTIG: Alle prosedyrer beskrevet nedenfor må utføres i en laboratorierøykhette. På grunn av reagensenes farlige natur. Personlige sikkerhetstiltak som hansker, labfrakk, vernebriller og munnbind er nødv…

Representative Results

Ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor høykontrast, kan du få bilder med god oppløsning av musens hjernevev. Et stort synsfelt levert av SBEM-teknikken letter presis utvelgelse av interesseområdet. Det store bildet av CA1-regionen i hippocampus ble tatt for å måle lengden på stratum radiatum (SR) (Figur 2A) og for å angi bildet nøyaktig i midten (Figur 2B). Deretter ble bunken med bilder anskaffet og gjenstandene av interesse, for eksempel dend…

Discussion

Det er mange varianter av den primære NCMIR-metoden beskrevet av Deerinck i 2010¹⁰. De grunnleggende prinsippene forblir de samme, men avhengig av hvilken type materiale som studeres, implementeres små endringer. Det ble tidligere beskrevet at forskjellige harpikser kan brukes til å legge inn prøver for SBEM, og for eksempel når det gjelder planter, er Spurrs den valgte harpiksen på grunn av sin lave viskositet som gir bedre infiltrasjon gjennom celleveggene^22,</…

Materials

Anesthetic:
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin)	Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Sodium pentobarbital (Morbital)	Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Fixatives:
Glutaraldehyde (GA)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	G5882	Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative
Hydrochloric acid (HCl)	POCH, Gliwice, Poland	575283115	pure p.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	441244	prilled, 95%
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	P4417-50TAB	tablets
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S5881	reagent grade, 98%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3264
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3139
Perfusion:
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14519-14
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8")	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	10091-12
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle)	KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany	KD-FINE 900413	1.80 x 40 mm
Pair of fine (Graefe) tweezers	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	11050-10
Perfusion pump	Lead Fluid	BQ80S
Plastic vials	Profilab, Warsaw, Poland	534.02	plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm
Straight iris scissors (~9 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14058-11
Brain slices preparation for EM:
12-well plate	NEST, Rahway, NJ, USA	712001
Cyanoacrylic glue	Fenedur, Montevideo, Uruguay
Glass vials	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72632	20 ml Scintillation Vial, a pack of 100
Pasteur pipette	VWR, Radnor, PA, USA	612-4545	LDPE, disposable, 7.5 ml
Razor blade	Wilkinson Sword, London, UK		Classic double edge safety razor blades
Scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	No. 20
Vibratome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica VT1000 S
Brain slices preparation for IF:
96-well plate	NEST, Rahway, NJ, USA	701101
Criostat	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica CM 1950
Ethylene glycol	Bioshop, Burlington, Canada	ETH001
Low-profile disposable blade 819	Leica Biosystems Inc., USA	14035838925
Scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	No. 20
Sodium azide (NaN3)	POCH, Gliwice, Poland	792770426
Sucrose	POCH, Gliwice, Poland	772090110
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound	Leica Biosystems, Switzerland	14020108926
Immunostaining:
24-well plate	NEST, Rahway, NJ, USA	702001
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody	Merck-Millipore, Burlington, MA, USA	MAB1598
Confocal microscope	Zeiss, Göttingen, Germany		Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm)
Cover slide	Menzel Glaser, Braunschweig, Germany	B-1231	24 x 60 mm
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	A31570
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	00-4959-52
Microscope slide	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	AGAA00008	SuperFrost
Normal donkey serum (NDS)	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA	017-000-121
Shaker	JWElectronic, Warsaw, Poland	KL-942
TritonT X-100 Reagent Grade	Bioshop, Burlington, Canada	TRX506
Electron microsocpy sample preparation
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	POCH, Gliwice, Poland	746980113
Aclar 33C Film	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	50425	Fluoropolymer Film embedding sheet
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	T58203	Epoxy embedding medium accelerator
Durcupan ACM single component A, M	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44611	Durcupan ACM single component A, M epoxy resin
Durcupan ACM single component B	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44612	Durcupan ACM single component B, hardener 964
Durcupan ACM single component D	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44614	Durcupan ACM single component D , plasticizer
Ethyl alcohol absolute	POCH, Gliwice, Poland	64-17-5	Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC
Genlab laboratory oven	Wolflabs, York, UK	Mino/18/SS	Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	A-9256	reagent grade, 98% (HPLC)
Lead (II) nitrate	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	467790	99.95% trace metals basis
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	75632	for electron microscopy, 4% in H2O
pH meter	Elmetron, Zabrze, Poland	CP-5-5
Rotator	BioSan, Józefów, Poland	Multi Bio RS-24	rotator Multi Bio RS-24
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S5881	reagent grade, 98%, pellets (anhydrous)
Sunflower mini shaker	Grant bio, Shepreth,UK	PD-3D
Syringe filter	Millipore, Burlington, MA, USA	SLGP033NB	0,22 µm pore size
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	88535	purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N)
Uranyl acetate	Serva, Heidelberg, Germany	77870	Uranyl acetate·2H2O, research grade
Water bath	WSL, Swietochlowice, Poland	LWT
Specimen mounting for SBEM
96-well culture plate	VWR, Radnor, PA, USA	734-2782	96-well plates, round bottom, non treated
AM Gatan 3View stub handling tweezers	Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands	50-001521
Binocular	OPTA-TECH, Warsaw, Poland	X2000
Conductive glue	Chemtronics, Georgia, USA	CW2400	conductive eopxy
Gatan 3View sample pin stubs	Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands	10-006003
Parafilm	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	P7793	roll size 20 in. × 50 ft
Pelco conductive silver paint	Ted Pella, Redding, CA, USA	16062-15	PELCO® Conductive Silver Paint, 15g
Razor blades double edge	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72000	Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box.
Scanning Electron Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm
trim 90° diamond knife	Diatome Ltd., Nidau, Switzerland	DTB90
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica ultracutR
Software	webpage		tutorials
FijiJ	https://fiji.sc/
Microscopy Image Browser	http://mib.helsinki.fi/		http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Reconstruct	https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0		https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Animals
Mice	Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.