Summary
Este artigo descreve um método para modelar a anestesia venosa total (TIVA) durante a cirurgia de ressecção de câncer em camundongos. O objetivo é replicar as principais características da administração anestésica a pacientes com câncer. O método permite investigar como a técnica anestésica afeta a recorrência do câncer após a cirurgia de ressecção.
Abstract
A anestesia é um componente de rotina do tratamento do câncer que é usado para procedimentos diagnósticos e terapêuticos. A técnica anestésica tem sido recentemente implicada em impactar os resultados do câncer a longo prazo, possivelmente através da modulação de respostas adrenérgico-inflamatórias que afetam o comportamento das células cancerígenas e a função das células imunes. Evidências emergentes sugerem que a anestesia intravenosa total (TIVA) baseada em propofol pode ser benéfica para os desfechos de câncer a longo prazo quando comparada à anestesia volátil inalatória. No entanto, os achados clínicos disponíveis são inconsistentes. Estudos pré-clínicos que identifiquem os mecanismos subjacentes envolvidos são criticamente necessários para orientar o desenho de estudos clínicos que acelerem a percepção. A maioria dos modelos pré-clínicos de anestesia foi extrapolada a partir do uso de anestesia em pesquisas in vivo e não são projetados de forma ideal para estudar o impacto da própria anestesia como desfecho primário. Este artigo descreve um método para a administração de anestesia propofol-TIVA em um modelo de camundongo de ressecção de câncer de mama que replica aspectos-chave da entrega clínica em pacientes com câncer. O modelo pode ser usado para estudar mecanismos de ação da anestesia sobre os resultados do câncer em diversos tipos de câncer e pode ser extrapolado para outras áreas não cancerígenas da pesquisa em anestesia pré-clínica.
Introduction
Mais de 60% dos pacientes com câncer recebem anestesia para ressecção cirúrgica1. Atualmente, não existem diretrizes clínicas específicas que determinem a escolha da anestesia utilizada em pacientes com câncer. Levantamentos com anestesiologistas indicam preferência pela anestesia volátil, inclusive durante a cirurgia oncológica 2,3. No entanto, há um crescente corpo de evidências de que o uso de anestesia venosa total (TIVA) baseada em propofol durante a cirurgia oncológica pode estar associado a melhores resultados pós-operatórios (sobrevida livre de progressão, sobrevida global) quando comparado à anestesia volátil4. Estudos clínicos subsequentes continuam a relatar resultados contraditórios 5,6,7,8. Esses achados reforçam a necessidade de estudos pré-clínicos para entender melhor os efeitos mecanicistas de diferentes agentes anestésicos nos desfechos relacionados ao câncer.
No entanto, em estudos in vivo que modelam a cirurgia de câncer, a anestesia é frequentemente uma parte incidental do procedimento. A justificativa para a escolha da anestesia muitas vezes não é o foco do delineamento experimental, e seu impacto nos desfechos relacionados ao câncer pode não ser avaliado. Por exemplo, estudos in vivo que requerem manutenção da anestesia para cirurgia oncológica mais comumente utilizam anestesia volátil inalatória9. Nos casos em que o propofol tem sido utilizado em estudos in vivo , ele foi administrado por dose única em bolus com administração intraperitoneal, que não replica protocolos clínicos onco-anestésicos10. Essa abordagem da administração de propofol induz anestesia leve que é adequada para procedimentos rápidos. No entanto, não permite a manutenção da anestesia que é necessária para a cirurgia de ressecção do câncer, que pode ser prolongada. Além disso, a cinética de absorção do parto intraperitoneal é distinta dos métodos clínicos de administração.
Um modelo de TIVA baseada em propofol para cirurgia de ressecção de câncer foi desenvolvido para atender a essa necessidade. Um protocolo para manutenção sustentada da anestesia com titulação do agente anestésico para permitir a resposta ao estímulo cirúrgico foi desenvolvido para replicar aspectos-chave da entrega anestésica a pacientes submetidos à cirurgia oncológica. O protocolo resultante é usado com um modelo de câncer em camundongo para fornecer TIVA durante a cirurgia de ressecção do câncer. O efeito sobre os resultados relacionados ao câncer de curto e longo prazo é avaliado.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram realizados sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Monash. Neste estudo, foram utilizadas fêmeas de camundongos Balb/c com idades entre 6-8 semanas.
1. Prepare as células cancerosas
- Cultura de células tumorais em meio. Cultura de células de câncer mamário murino 66cl4 em alfa-MEM contendo 10% de FBS e 200 mM de glutamina. As células devem enviar texto negativo para micoplasma. OPCIONAL: Use células que são transduzidas de forma estável para expressar luciferase de vagalume para imagens de bioluminescência para permitir o monitoramento da recorrência do câncer após a cirurgia de ressecção11 (ver etapa 4).
NOTA: A linhagem celular e o meio mencionado acima foram utilizados neste estudo. - Cultivar células a 37 °C com 5% de CO2. Células de passagem assepticamente em um exaustor com <80% de confluência. Use células de baixa passagem na fase de crescimento logarítmico para obter ótimos resultados in vivo.
- Levantar as células aderentes com 0,5 mg/mL de tripsina em PBS com EDTA 10 mM; 2 ml para um balão T75. Quando levantado, adicione o meio para desativar a tripsina e lave as células em PBS.
- Conte as células usando um hemocitômetro. Dilua as células em PBS para injeção. Para 66cl4 células cancerígenas mamárias, injete 1 x 105 células em 20 μL de PBS por rato.
- Coloque as células no gelo antes da injeção.
2. Gerar um modelo de rato de câncer de mama
- Use isoflurano a 4% para anestesiar o camundongo em uma câmara de indução. Em seguida, mantenha a anestesia com isoflurano a 2%-3% usando um cone nasal. Confirme a anestesia adequada por falta de resposta à beliscão do dedo do pé.
- Prepare o local da injeção limpando a quarta área da almofada mamária esquerda usando um cotonete com álcool de uso único.
- Desenhe as células tumorais (ver passo 1.4) numa seringa Hamilton de 25 μL ligada a uma agulha hipodérmica estéril de 27 G.
- Injete as células na quarta almofada mamária esquerda. Use fórceps para prender e levantar a pele. Injete aproximadamente 1 mm do mamilo.
- OPCIONAL: Se as células forem marcadas com luciferase, confirme a injeção bem-sucedida de células tumorais por imagem de bioluminescência. Injete 100 μL de 150 mg/kg de D-luciferina na veia lateral da cauda dos camundongos anestesiados usando uma seringa de insulina de 0,5 mL com uma agulha hipodérmica de 30 G.
- OPCIONAL: Coloque o rato num sistema de imagem de bioluminescência com a almofada de gordura mamária virada para cima. Aguarde 2 minutos da injeção de luciferina para uma absorção tecidual ideal de luciferina e, em seguida, a imagem por 10 s.
- Coloque o rato numa gaiola limpa e deixe-o recuperar da anestesia.
- Continuar a monitorar o bem-estar animal de acordo com as diretrizes institucionais de ética animal.
3. Induzir anestesia estável com administração intravenosa de propofol
- Monitorar o crescimento do tumor primário usando a medida do paquímetro e calcular o volume do tumor usando a equação: Volume (mm3) = (comprimento x (largura)2 ÷ 2 ).
- Realize a cirurgia de ressecção tumoral em camundongos quando o tumor primário atingir o volume necessário (aqui, 80-90 mm3).
- Configure uma bomba de seringa automatizada com uma seringa de insulina 30 G 1 mL contendo formulação de propofol (Lipuro propofol a 2%) (Figura 1A).
- Induzir anestesia do rato numa câmara de indução com sevoflurano ou isoflurano a 3%.
NOTA: Aqui, o sevoflurano foi utilizado, pois este é o volátil predominante usado clinicamente. - Transfira o rato para uma almofada de aquecimento a 37 °C durante a cirurgia. Mantenha brevemente a anestesia com sevoflurano a 2%-3% usando um cone nasal.
- Aplique lubrificante aquoso nos olhos para evitar a secagem.
- Injete 0,05 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia.
- Para se preparar para a cirurgia, raspe o abdômen e prepare a pele para a cirurgia com uma solução de iodo-povidona. Limpe a pele usando um álcool ou lenço umedecido.
- Para administrar a TIVA à base de propofol, canular a veia lateral da cauda usando uma agulha hipodérmica estéril de 30 G presa a um cateter de poliuretano estéril. Confirme a colocação correta por flashback de sangue no cateter (Figura 1B). Ajustar a administração de sevoflurano conforme necessário durante a canulação intravenosa para manter uma profundidade estável de anestesia demonstrada pela perda do reflexo corneano e pedal, e frequência respiratória < 100 respirações por minuto.
- Iniciar propofol-TIVA administrando propofol a 2% como bolus inicial de 27 mg/kg por mais de 1 min. Cessar a administração de sevoflurano.
- Continue a infusão de propofol a uma taxa de manutenção de 2,2-4,0 mg/kg/min para manter uma profundidade estável de anestesia durante a cirurgia (Figura 1C).
4. Ressecar o tumor primário
- Faça uma incisão reta de 1 cm inferior ao tumor na região da almofada mamária quarta esquerda. Ressecar cuidadosamente o tumor e o linfonodo inguinal esquerdo usando dissecção com pinça contundente.
- OPCIONAL: Se estiver usando células tumorais marcadas com luciferase, use imagens de bioluminescência para confirmar margens cirúrgicas claras. Injete 150 mg/kg de D-luciferina na veia lateral da cauda, aguarde 2 minutos e, em seguida, faça uma imagem por 60 s usando um sistema de imagem de bioluminescência. Se um tumor residual for identificado, resssecte o tecido adicional da almofada mamária e refaça a imagem para obter margens claras.
- Assegure-se da hemostasia no local da cirurgia e feche a pele usando suturas de nylon 5-0. Certifique-se de que a pele não entre no local da cirurgia.
- Na conclusão da cirurgia de ressecção, cesse a anestesia. Coloque o rato numa gaiola limpa numa almofada de aquecimento a 37 °C e deixe-o recuperar da anestesia.
- Monitore a cada 15 minutos após a anestesia até que o rato tenha retornado ao estado de alerta normal. Em seguida, monitore o mouse a cada 12 h por 48 h após a cirurgia.
- Administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea a cada 12 h durante 48 h após a cirurgia.
- Após 7-10 dias, remova as suturas usando cortadores de ponto curvos estéreis sob breve anestesia com sevoflurano ou isoflurano.
5. Acompanhe a recorrência do câncer com imagens in vivo
- Use imagens de bioluminescência para rastrear a recorrência do câncer após a cirurgia de ressecção de forma não invasiva. Use um sistema de imagem de bioluminescência para monitorar os camundongos uma vez por semana em busca de evidências de recorrência do tumor primário ou recorrência à distância, começando na semana seguinte à cirurgia.
- Induzir anestesia do rato numa câmara de indução com isoflurano a 4%. Em seguida, transfira o rato para uma almofada de aquecimento a 37 °C durante a anestesia e mantenha a anestesia com isoflurano a 2%-4% utilizando um cone nasal.
- Aplique lubrificante aquoso nos olhos para evitar a secagem.
- Injete D-luciferina 150 mg/kg na veia lateral da cauda. Aguarde 2 minutos e, em seguida, meça a bioluminescência ao longo de uma exposição de 60 s para detectar a recorrência do tumor primário ou metástase à distância.
- Se o tumor primário se repetir e se tornar palpável, inicie o monitoramento do crescimento do tumor usando medidas de paquímetro.
- No final do experimento, mate humanamente os ratos de acordo com o protocolo aprovado. Aqui, utilizou-se CO2 , seguido de luxação cervical.
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Representative Results
Este método descreve um modelo de anestesia venosa total (TIVA) com propofol durante a cirurgia de ressecção de câncer em camundongos. O propofol é administrado neste modelo de camundongo através de um cateter intravenoso usando uma bomba de seringa (Figura 1A,B) para replicar a administração de TIVA no ambiente clínico de anestesia para cirurgia de câncer. O uso da bomba de seringa minimiza a exposição à anestesia volátil, permitindo a rápida conversão da indução inicial pela anestesia inalatória para a administração intravenosa.
Após a anestesia estável ser obtida por TIVA à base de propofol, o tumor mamário primário foi ressecado. A imagem de bioluminescência in vivo foi utilizada para confirmar a ressecção completa do tumor primário (Figura 2). O monitoramento regular de camundongos por imagens de bioluminescência in vivo não invasivas identificou recorrência à distância por células tumorais marcadas com luciferase no pulmão (Figura 2). Este método também é adequado para rastrear a recorrência local na almofada mamária.
Além de rastrear eventos de longo prazo, como recorrência, o modelo pode ser usado para avaliar eventos que ocorrem durante o período perioperatório. Esses eventos iniciais podem fornecer uma visão mecanicista sobre os efeitos da anestesia e outros fatores cirúrgicos nos resultados relacionados ao câncer. Vinte e quatro horas após a cirurgia oncológica sob propofol, um ensaio imunoenzimático multiplex foi utilizado para quantificar citocinas plasmáticas circulantes (Figura 3). As citocinas foram avaliadas em 7 camundongos; o tamanho apropriado do grupo será influenciado pelo tamanho do efeito do ponto final de interesse.
Figura 1: Configuração experimental para TIVA à base de propofol. (A) Uma bomba de seringa é usada para garantir a entrega controlada de propofol a partir de uma seringa de insulina de 1 mL. (B) O propofol é administrado na veia caudal lateral por cateter intravenoso, conectado a uma bomba de seringa, através de uma agulha de 30 G. O asterisco mostra o ponto de inserção da agulha. (C) Esquema que ilustra a concentração plasmática de propofol alcançada pela administração sequencial de um bolus seguido de uma perfusão constante utilizando a bomba de seringa, em comparação com a administração por bolus ou perfusão apenas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Progressão do câncer após ressecção cirúrgica do tumor mamário primário sob TIVA baseada em propofol. Imagens de bioluminescência não invasivas de células tumorais marcadas com luciferase foram usadas para rastrear o crescimento inicial do crescimento do tumor primário, a ressecção cirúrgica bem-sucedida e a subsequente recorrência à distância para o pulmão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Níveis de citocinas circulantes medidos após ressecção do câncer sob TIVA à base de propofol. O ensaio de imunoadsorção enzimática multiplex foi utilizado para quantificar as citocinas plasmáticas 24 h após a cirurgia. Cada ponto de dados representa dados de um mouse. As linhas mostram a média e o erro padrão (N = 4-7). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este estudo relata um protocolo para administração de anestesia venosa total (TIVA) com propofol em um modelo de camundongo de câncer de mama que replica aspectos-chave da prática clínica para TIVA em pacientes que necessitam de cirurgia oncológica. O protocolo permite a investigação de desfechos clinicamente relevantes a curto e longo prazo após a cirurgia de câncer em um modelo de camundongo de progressão do câncer, incluindo a medição dos níveis de citocinas e recorrência do câncer (Figura 2 e Figura 3). A metodologia será útil para a avaliação dos efeitos da TIVA sobre os desfechos relacionados ao câncer e sua comparação com outras técnicas anestésicas, como a anestesia volátil.
Em contraste com os protocolos existentes que fornecem um único bolus intraperitoneal de propofol para sedação durante intervenções menores, como a entrega de amostras de sangue10, esse protocolo permite a entrega intravenosa prolongada de propofol para manutenção da anestesia durante grandes intervenções, como a cirurgia. Tanto a dose de indução quanto a de manutenção de propofol foram cuidadosamente tituladas para otimizar a profundidade anestésica adequada para grandes intervenções cirúrgicas, minimizando a mortalidade por hipotensão ou parada cardíaca. Verificou-se que a hipotensão poderia ser evitada usando uma dose de indução estrita de 27 mg/kg administrada ao longo de 60 s, com titulação para baixo concomitante e cessação do sevoflurano inalatório. A manutenção foi obtida com uma infusão de propofol a 2,2-4,0 mg/kg/min. Durante grandes intervenções cirúrgicas, como a ressecção do câncer, a titulação dentro dessa faixa foi importante para responder e obtonizar a magnitude da estimulação cirúrgica. Isso replica a prática clínica e evita a superdosagem da anestesia, que pode resultar em hipotensão ou morte, ou a subdosagem, que pode resultar na emergência da anestesia, movimento ou estresse cirúrgico.
Uma limitação do modelo é o breve uso de anestesia volátil para induzir a anestesia antes da canulação. Essa abordagem foi escolhida devido à facilidade de canulação após a indução anestésica, permitindo a rápida entrega de uma dose terapêutica de propofol para continuar a anestesia. Além disso, os camundongos foram brevemente anestesiados com anestesia volátil para inoculação de células tumorais, para remoção de sutura e para imagem. O sevoflurano foi utilizado para anestesia volátil durante a cirurgia de ressecção, pois é frequentemente utilizado na prática clínica. No entanto, o isoflurano também é usado na prática clínica. Estudos futuros podem utilizar um único agente para todos os episódios de anestesia inalatória. Com a experiência, menos de 2 minutos decorridos da perda do reflexo de endireitamento em resposta à exposição à anestesia volátil ao início da dosagem de propofol. No entanto, para análises que pretendem comparar a TIVA baseada em propofol com técnicas de anestesia volátil inalatória, a interpretação pode ser confundida até mesmo pelo breve uso de anestesia volátil.
Uma abordagem alternativa para a indução de anestesia volátil é canular a veia lateral da cauda de um rato acordado. Embora não seja adequado para todas as situações, isso pode fornecer uma alternativa à indução por anestesia inalatória. No entanto, o movimento do rato acordado pode resultar no deslocamento da cânula, levando à falha da indução anestésica. Além disso, o movimento da agulha pode resultar em extravasamento de propofol da veia, o que coloca a cauda em risco de necrose tecidual. Isso tem implicações para o bem-estar do camundongo, e qualquer ativação adrenérgica associada como resultado do estresse fisiológico pode afetar a validade dos resultados observados11.
Uma limitação potencial adicional é o uso de buprenorfrina como analgésico pós-operatório. Os opioides podem modular as respostas inflamatórias e imunes pós-operatórias12,13. A buprenorfina foi escolhida para analgesia, pois seus efeitos sobre a resposta imune são menores do que para outros opiáceos13. No entanto, estudos futuros podem considerar o uso de analgésicos não opioides.
Apesar dos avanços na terapia oncológica, a recorrência do câncer local e à distância pode ocorrer após a cirurgia e continua sendo uma causa dominante de mortalidade em pacientes com câncer. Muitos pacientes serão expostos à anestesia, muitas vezes várias vezes, durante procedimentos cirúrgicos diagnósticos e terapêuticos. Um crescente corpo de evidências de estudos in vivo e in vitro implica agentes anestésicos na modulação da resposta perioperatória à cirurgia e no impacto de diversos aspectos da biologia celular tumoral14. Para melhor compreender o impacto dos agentes anestésicos na progressão do câncer, o modelo de anestesia intravenosa com propofol aqui desenvolvido será importante em futuras pesquisas pré-clínicas mecanicistas. Este modelo pode ser usado para interrogar os mecanismos subjacentes aos efeitos dos agentes anestésicos na imunomodulação, resposta inflamatória perioperatória e crescimento e invasão de células tumorais. Além disso, esse modelo pode ser extrapolado para uso em pesquisas de cirurgia não oncológica, onde os agentes anestésicos podem ter efeitos em outros sistemas, como cirurgia cardíaca, pesquisa de trauma ou doença crítica (por exemplo, sepse), já que o propofol é uma sedação comum usada em unidades de terapia intensiva.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer aos membros do Cancer Neural-Immune Laboratory e ao Dr. Cameron Nowell do Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University, Parkville. Este trabalho foi apoiado por doações do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica 1147498, da Fundação Nacional do Câncer de Mama IIRS-20-025, do Colégio Australiano e Neozelandês de Anestesistas (ANZCA), Perpetual e CTC for Cancer Therapeutics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresnius Kabi | AUST R 197198 | |
| Artery forceps | Proscitech | TS1322-140 | |
| Buprenorphine | Temgesic | TEMG I | |
| Heated surgical mat | Custom | - | |
| Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe) | Terumo | NN3013R | |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | 126274 | |
| Luciferin | Promega | P1041/2/3 | |
| Polyurethane catheter | Intramedic | 427401 | |
| Povidone Iodine | Betadine | AUST R 29562 | |
| Propofol Lipuro, 2% | Braun | 3521490 | |
| Sevoflurane | Baxter | ANZ2L9117 | |
| Sevoflurane vaporiser | Vetquip | VQ1334 | |
| Sterile gauze | Multigate Medical Products | 11-600A | |
| Surgical scissors | Proscitech | TS1044 | |
| Sutures, 5-0 nylon | Dynek | V504 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringes (1 mL) | Terumo | SS+01T |
References
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