ゼノプス・ラエビス胚の芽球に分泌される成長因子ßファミリー切断産物の分析

Summary

変容成長因子ßファミリー前駆体タンパク質が ゼノプス・ラエビス 胚で異所性発現すると、二量体化し、切断され、後期芽胞から早期胃管ステージに至るブラストコエレに分泌される。免疫ブロット解析のためのブラストコア腔から切断産物を吸引する方法について述べている。

Abstract

Tgfß/Nodalまたは骨形態形成タンパク質(Bmp)リガンドに代表されるトランスフォーム成長因子ß(Tgfß)スーパーファミリーの2つの腕は、それぞれ胚発生および成人恒常性に不可欠な役割を果たす。Tgfßファミリーのメンバーは、小胞体内で二量体化および折り畳む不活性前駆体として作られる。前駆体は、その後、リガンドおよびプロドメイン断片に切断される。二量体リガンドだけがTgfß受容体を関与させ、下流シグナル伝達を活性化することができるが、プロドメイン部分がリガンド活性に寄与するという認識が高まっている。この記事では、Tgfß前駆体タンパク質の活性化中に生成された切断産物を同定するために使用できるプロトコルについて説明します。Tgfß前駆体をコードするRNAは、まず X.ラエビス 胚にマイクロインジェクションされる。翌日、切断産物はガストルラ期胚の芽球体から採取され、ウェスタンブロットで分析される。このプロトコルは、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供します。

Introduction

トランスフォーム成長因子 ß (Tgfß) スーパーファミリーのメンバーは、非活性で二量体化された前駆体タンパク質として合成されます。前駆体は、分泌経路内または細胞外のプロプロテインコンフォーターゼ(PC)ファミリーのメンバーによって切断される。これは、活性なジスルフィド結合リガンドダイマーと2つのプロドメインフラグメント¹を作成する。Tgfßファミリー前駆体のプロドメインが活性リガンド²を生成するために必要とされているのは30年以上前から知られているが、プロドメインがリガンド機能にどのように寄与するかを理解することは不完全である。

Tgfßファミリーメンバーのタンパク質分解活性化のプロセスの理解は不完全なままであるが、どのPCコンセンサスモチーフが生体内で切断されるか、切断が特定の細胞内または細胞外区画で起こるか、そしてプロドメインが切断リガンド³と共有結合的にまたは非共変に関連しているかの理解に関心が高まっている。いくつかの研究は、プロドメインが切断^4、5の前にリガンド折りたたみを導くだけでなく、成長因子の安定性と作用範囲^{6、7、8、9}に影響を与え、ホモダイマーまたはヘテロ二量体¹⁰の形成を促進し、リガンドを細胞外マトリックスに固定してリガンド遅延¹¹を維持し、場合によっては、アガンドとして機能することを示している。 シグナリング¹².Tgfßファミリーの多くのメンバーのプロドメイン内のヘテロ接合点突然変異は、ヒトの眼、骨、腎臓、骨格または他の欠陥に関連している^3。これらの知見は、プロドメインが活性リガンドを生成および維持する上で重要な役割を強調し、Tgfßファミリー前駆体のタンパク質分解性成熟中に開発された切断産物の役割を同定し、解読することの重要性を強調する。

ここでは、X.ラエビス胚の芽球からTgfßファミリー前駆体の成熟中に生成された切断産物を吸引し、免疫ブロットで分析するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、前駆体タンパク質の1つ以上のPCコンセンサスモチーフが生体内^10、13で切断されているかどうかを判断するために使用され、各モチーフ13、14を切断する内因性PCを同定し^、Tgfßファミリーホモダイマー対ヘテロダイマー¹⁰の生体内形成を比較するか、またはTgfのヒト疾患関連点突然変異をTgfおよびCgのヒト疾患関連点突然変異をTgfの前駆体に対して分析する。

Protocol

記載されているすべての手順は、ユタ大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。カエルはIACUC承認施設に収容されています。オスのカエルは、心臓の心室をクリッピングすることによって続くトリカインに浸漬することによって安楽死させられる。雌のカエルは、卵の採取を可能にするために産卵のホルモン誘導に続いて最大24時間実験室に収容され、その後、ケア施設に戻されます。

1. X.ラエビス 精巣のコレクション

1. 動物が爪のピンチに反応しなくなるまで、0.2%トリケーヌ(表1)で性的に成熟した男性を30〜40分間麻酔します。
2. 鈍い鉗子を使用して、皮膚を体壁から引き離します。手術用ハサミを使用して下腹部を横切って皮膚に水平切開を行います。下の体壁に平行な切開を行い、次に肋骨ケージを通して体壁を通して3番目の垂直切開を行います。
   1. 得られたフラップを折り返し、心臓の心室を見つけ、ベースを切り取って興奮させ、死を確実にします。
3. 鈍い鉗子で腹部から黄色い脂肪体を引き出し、脂肪体の基部の下にある両側の精巣を見つけます。各精巣を取り除き、脂肪体や手術用ハサミを使用して付属の内臓から切り取ります。
4. 1x修正バースの溶液(MBS)を含むペトリ皿に精巣を移す(表1)。接着性の血管や付属の内臓をすすいで除去します。
   1. 1つの試験を、すぐに使用するために、精巣バッファーを含む35mmペトリ皿(表1)に移し、後で使用するために精巣バッファーで満たされた10 mL円錐形のチューブにもう一方を保管します。精巣は使用しない場合は4°Cで保存する必要があり、少なくとも2週間は生存可能です。
      注: 精巣の分離の写真は、リファレンス 15 にあります。

2. X.ラエビス卵の採取と受精

注意:カエルは、カエルを扱う前と後に洗浄ビニール手袋や手で処理する必要があります。ラテックス手袋、ローション、洗剤残渣は、カエルの壊れやすい皮膚を損傷します。

1. 産卵前の晩、26G針を装着した1mL注射器を用いて、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(表1)の0.3mL(1200 IU)を2~3匹の成熟した X.ラエビス メスの後部リンパ嚢に注入する。注射ごとに新しい針を使用します。
2. 注射後、メスを密閉容器(気密ではない)に18°Cの生物学的インキュベーターに入れます。産卵は一般的に14-16時間後に始まる。
   注:蓋に切り取られた空気穴を持つプラスチック製の引き出しやプラスチック容器は、女性を一晩保持するためにうまく機能します。カエルがインキュベーターで逃げ出して乾燥するのを防ぐために、蓋がしっかりとついようにしてください。
3. 1x MBSを含む100mmペトリ皿の上にメスを保持し、皿に卵を排出するためにカエルの腹部に穏やかな圧力を適用します。
4. カミソリの刃を使用して精巣の小片(〜1/5)を切り、1x MBSの〜500μLを含む1.5 mLチューブに移します。ペレットの害虫や組織ホモジナイザーでつぶす。得られた精子懸濁液を氷上または4°Cで保管し、その後の受精を同日に行う。
5. 100 mm のペトリ皿を傾けて、できるだけ多くの 1x MBS を注ぎ、残りをプラスチック製の転送ピペットを使用して取り除きます。約100μLの精子懸濁液を塗布し、0.1x MBSの約1mLを加え、混合するために渦巻く。
   1. 5分後、食器をフッ化した水道水または0.1x MBSであふれさせ、30分間放置します。
      注:水は、フィルターまたは市営水道水を使用してデクロリン化することができ、通常の塩素が水に添加されている領域で塩素が消散できるように、少なくとも24時間放置することができます。クロラミンを添加して飲料水を消毒する地域では、クロラミンを分解できる市販のコンディショナーで水を処理する必要があります。
      注:卵は高塩溶液(1x MBS)で採取され、受精の障壁となるゼリーコートの形成を防ぎます。受精後、低塩溶液(デクリエーション水または0.1x MBS)はゼリーコートの形成を可能にし、卵は互いに付着し、皿に付着します。受精した卵は、色素動物の棒が30分以内に上向きになるように回転します。これが起こらず、卵が顕微鏡の下で健康に見える場合、精子の生存率が疑われ、新しい精巣を収穫する必要があるかもしれません。
6. 卵を覆う溶液を注ぎ、ペトリ皿に作りたての2%システイン溶液を充填する(表1)。ゼリーコートが溶けて卵が互いや皿にくっついてなくなるまで、皿の中で3〜5分間溶液を旋回させます。
   1. 皿を傾け、慎重にシステイン溶液を注ぐか、プラスチックピペットで取り出します。1x DeBoerの池水に置き換えます(表1)。すすいでデカントするために渦巻く。
   2. DeBoerの溶液(0.1x MBS)で1回の洗浄を繰り返し、0.1x MBSで皿を補充します。ゼリーコートを取り外した後、卵はより壊れやすくなり、空気と液体の界面にさらされてはならない。
7. 受精卵を16°Cの生物学的インキュベーターに移すか、室温でベンチに置きます。室温で放置すると、受精後1~1.5時間で最初の切断が起こり、その後の切断は約30分ごとに起こります。対照的に、胚が15〜16°Cでインキュベートされた場合、切断はおよそ1時間ごとに起こり、所定のスポーンからより多くの胚を注入することが可能になる。

3. X.ラエビス胚の微小注入

1. 次の設定でマイクロピペットプーラーを使用して細かい点にガラスの毛細血管を加熱し、引っ張ります: 2ステッププル;熱1:67.4°C;熱2:62°C
   注:これらの設定は、ここで使用されるマイクロピペットの引き手とガラスの毛細血管に固有のものです(資料表)。
2. 解剖顕微鏡の下で、Dumont #5鉗子を使用して端に近い引っ張られた針の先端を切り取ります。針は鋭くあるべきだが、先端が胚に接触したときに曲がるほど薄くはない。 図1 は、マイクロインジェクション(A)のためにクリップされていない適切に引っ張られた針と、クリップされた針(B)の例を示す。
3. マイクロインジェクターに接続された針ホルダーに針を挿入します。ニードルホルダーをマイクロマニピュレータに取り付けます。Tgfß前駆体タンパク質をコードする2~4 μLの合成RNAを、分析顕微鏡下の小さなパラフィルム上に置きます。
   1. マイクロマニピュレーターを使用して、針をドロップに下げ、マイクロインジェクターのフィル機能を使用してRNAを針に吸い込みます。針を落下面の下に置き、針に空気を吸い込まないように顕微鏡の下で進捗状況を見守るようにしてください。
      注:分析するTgfß前駆体のプロドメインおよび/またはリガンドドメインを認識する抗体が利用できない場合、エピトープタグ(V5、myc、Flagなど)をコードする配列を、RNA転写のテンプレートとして使用するcDNAにフレーム内に挿入することができます。タグ付きタンパク質の in vivo 生物活性は、エピトープが適切な折り畳み、切断または活性を妨げないように、タグなしタンパク質の生物活性と比較する必要があります。
4. RNA溶液の滴を空気中に排出し、注入段階または顕微鏡の接眼部に取り付けられたマイクロメータを使用して、落下サイズを測定します。マイクロインジェクタの時間と圧力制御を利用して、ドロップサイズを約10 nLに調整します。
   注:5〜20 ng/μLの範囲のRNA濃度は、各胚に50〜200pgのRNAを送達するのに適しています。この量のRNAは、一般的に10〜20個の胚からの吸引における切断産物を検出するのに十分である。免疫ブロットで検出可能なシグナルを与えるRNAの最低用量を目指すことが最善です。RNAの量が多いほど、ガストルレーション欠陥を引き起こし、ブラストコアの膨張を妨げる可能性があります。
5. 2-4細胞の段階に達すると、胚を0.1x MBS(表1)の5%Ficollを含む注射皿またはトレイに移動します。底部にナイロンメッシュの一部を取り付けた35mmペトリ皿は、胚を固定し続ける安価な注入皿として役立ちます。動物の棒の近くに針を挿入し、各胚の1つの細胞に10 nLのRNAを注入する。
   注:胚は1つから16の細胞の段階の間のいつでも容易に注入することができる。切断後に胚を注入すると、卵子が受精し、胚が健康であることを保証する。注射の正確な位置は必須ではありません。 X.ラエビス 胚へのRNAの産卵、培養およびマイクロインジェクションのより詳細な説明は、参照15で見つけることができます。
6. 注入した胚を0.1x MBSで5%フィコールで満たされた35mmペトリ皿に移す(表1)。150 mm のペトリ皿の中に小皿を入れ、ふたでゆるやかに覆って、培養培地が蒸発するのを防ぎます。胚を15〜16°Cで一晩培養する。
   注:Ficollで胚を培養することは、注射部位を癒すのに役立ちます。細かい針を使用する場合、2〜3%Ficollでの培養で十分であるのに対し、見かけの損傷が認められる場合は5%Ficollが好ましい。注射後1〜2時間Ficoll溶液中の胚を保つことは治癒を助けるのに十分であるが、一晩のインキュベーションは、ガストルレーションの発症前に溶液が変化する限り胚に損傷を与えない。

4. Tgfß切断製品のブラストコーレ抽出と分析

1. 注射の翌朝、Ficoll溶液を取り除き、死んだまたは死んでいる胚を取り除く。0.1x MBSで胚を1、2回リンスし、室温でベンチで0.1x MBSで胚を培養する。
   注:胚は、開発を遅くするために16°Cの生物学的インキュベーターに戻すこともできます。
2. 次の設定でマイクロピペットプーラーを使用して細かい点にガラスの毛細血管を加熱し、引っ張ります: 2 ステッププル;熱1:67.4°C;熱2:62°C
   注:これらの設定は、ここで使用されるプーラーとガラスの毛管に固有のものです(資料表)。
3. 解剖顕微鏡の下で、鉗子を使用して引っ張られた針の先端を切り取ります。詰まりを防ぐために、ブラストコア吸引に使用される針の開口部は、マイクロインジェクションに使用される針のそれよりも大きくする必要があります。ブラストコア吸引に使用される良好な引っ張りおよび切り取られた針の例を 図1Cに示す。マイクロインジェクターに接続された針ホルダーに吸引針を挿入し、マイクロマニピュレータに針ホルダーを取り付けます。
   注意:最適な針の直径は試行および誤りによって経験的に決定される。大口径の針はあまりにも速く充填し、細胞の破片が針に入る可能性が高くなります。対照的に、非常に小さい直径の針は詰まる可能性があります。適切な針が生成されると、同じ位置で切り取られた複数の針を生成することが有用です。
4. 胚は、0.1x MBSで満たされたインジェクショントレイまたは皿に、早期から中期ガストルラ段階(ステージ10-11)に達したときに入れます。
5. 動物の棒の近くの胚の表面の下に針を挿入します。解剖顕微鏡を見ながらマイクロインジェクターの充填ボタンを押して、針と胚に目を光らせておきます。数秒で、透明な液体のレベルが針で上昇し、胚が崩壊し、凹状になります。
   1. 曇った白質が針に入った場合は、充填ボタンを放し、注入ボタンを1回以上パルスして、プロテアーゼを含む可能性が高い細胞破片で構成される曇った物質を排出します。
      注:ブラストコアが崩壊し、充填ボタンを押すとすぐに細胞デブリが針に入った場合、針の開口部が大きすぎることを示します。ブラストコアレが崩壊しないが、白い物質がすぐに針に入った場合、針が深く挿入されすぎてブラストコエレの床に触れていることを示しています。白い物質を排出し、次の胚に移動します。吸引率は、連続的に押すのではなく、フィルボタンをパルスすることによってより慎重に制御することができます。これは、針の開口部が最適よりも大きい場合に特に重要です。
6. 10~20個の胚の胚細胞から流体が吸引されるまで、ステップ4.5を繰り返します。
   注:一般的に、10〜20個の胚から吸引されたブラストコエレ液は、イムノブロット上の切断産物を検出するのに十分です。しかし、これは抗体の品質によって異なる場合があり、経験的に決定する必要があります。
7. 注射トレイにパラフィンを1μL置き、ヌクレアーゼを含まない水をピペット1μLに置きます。水滴の下に針を水に沈め、水にブラストコア液を払拭するために注入ボタンを押してください。
   1. あるいは、流体を直接パラフィルムに排出しますが、この場合は、注入ボタンを押さえるのではなくパルスします。これは、より低い圧力で流体を排出し、パラフィルム上で平らにするのを防ぎ、ピペットで描くのを困難にします。
8. ブラストコア液を氷上の無菌マイクロ遠心チューブに移します。胚当たり約0.3~0.5μLのブラストコア液を収穫することを期待します。ヌクレアーゼを含まない水を加えて、最終容積を30μLに調整します。
9. 胚細胞を液体で枯渇させた胚を氷上の別のチューブに移します。過剰な0.1x MBSを取り除き、200μLのチルド(4°C)胚ライセートバッファー(胚当たり10μL)を加える(表1)。胚が完全に均質化され、塊が残らなくなるまで、マイクロピペットを使用して10〜20回胚を上下にピペットします。
10. 冷蔵マイクロ遠心分離機中の均質化胚を10,000xgで10分間遠心分離する。P200ピペットを使用して上澄み物の160 μLを取り出し、氷上の新しいチューブに移し、チューブの下半分にある白い黄身タンパク質やその他の細胞の破片を避けるように注意してください。
    1. マイクロセントリフィケーションを一度繰り返し、清澄上清の128 μLを氷上の新しいチューブに移します。この時点で、クリアされた胚のライセートおよびブラストコア液は、所望の限り−80°Cで保存することができる。
       注:いくつかの例外を除いて、Tgfß前駆体タンパク質はブラストコアに分泌されず、枯渇した胚のライセートでのみ検出されます。対照的に、Tgfßファミリー切断産物は、主にブラストコア液中に見られる。ほとんどの目的で胚のライセートとブラストコア液の両方を収穫し、分析するのに役立ちます。少なくとも、前駆体が堅牢に翻訳され安定していることを確認するために、正のコントロールを提供します。さらに、異なる野生型または変異体タンパク質間の前駆体と切断産物の相対比を比較し、無傷の前駆体をブラストコア流体に分泌することを可能にする突然変異を同定することを可能にする(例えば、切断せずに適切な折りたたみおよび分泌を可能にするPCコンセンサスモチーフ内の突然変異、その場合は胚と胚体の両方で無傷の前駆体が検出される) 未開皮タンパク質(その場合、前駆体は胚のリセートで検出されますが、切断産物はブラストコア液に存在しません)。
11. メーカーの指示に従って、この時点でPNGase Fを用いてブラストコア液中に存在するタンパク質を脱グリコシル化します。
    注 これらはPNGase Fによって除去された複雑なN結合オリゴ糖を欠いている前駆体の存在形態である小胞体(ER)を表すので、胚リセートに存在する前駆体タンパク質を脱グリコシル化する必要はない。対照的に、ブラストコアレ流体に存在する切断産物は、炭水化物がさらに改変され、PNGase Fによって除去することができるトランスゴルジネットワーク(TGN)を通過した。脱糖鎖処理に続いて、切断産物はSDSゲルのより緊密に凝縮されたバンドとして移行し、切断産物の可視化、定量化、正確な同定に役立てることができます。これは厳密には必要ではありませんが、例えば、移行パターンに基づいてホモダイマーとヘテロ二量体を区別しようとしている場合や、切断産物に広いファジィバンドとして移行する原因となる異種炭水化物が含まれている場合などに役立ちます。
12. 4xサンプルバッファー(表1)を15μLのブラストコエイル液に5μL、透明化胚のリセートを15μL加えます。5 μL の非還元 4x サンプルバッファー (表 1) を、残りの 15 μL のブラストコア流体に加えます。100°Cに5分間加熱し、氷の上に置きます。
    注:非還元条件下でタンパク質を分析することは、切断されたホモジメリックまたはヘテロ二量体リガンドの形成を分析するために不可欠ですが、切断部位または切断タンパク質のレベルを分析する場合にのみ必要ではありません。いくつかの例外を除いて、プロドメインフラグメントはモノマーとして分泌されます。さらに、胚ライセートに存在する前駆体タンパク質が主に展開され、ER常駐モノマーが存在する。したがって、非還元条件下でこれらの製品を分析する必要はありません。
13. 15%SDS/ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により、前駆体タンパク質および切断産物を解決します。
14. 電気泳動移動を使用して、ゲルからPVDF膜にタンパク質を移管します。
15. プロドメインとリガンドドメイン(またはそれらのドメインに挿入されたエピトープタグ)を認識する適切な抗体を持つ膜をインキュベートし、適切な二次抗体で洗浄およびインキュベートする。化学発光または蛍光イメージングでタンパク質を可視化します。

Representative Results

以下に説明する実験の目的は、Bmp4およびBmp7がヘテロダイマー(1つのBmp4リガンドと1つのBmp7リガンドで構成されるダイマー)、ホモダイマー(2つのBmp4または2つのBmp7リガンドで構成される)、またはそれらが Xで 共発現される場合のそれぞれの混合物を決定することであった。 図 2 に示すデータは、以前に発表されたスタディ¹⁰から抽出されます。 図2A は、Bmp4またはBmp7ホモジマー前駆体またはBmp4/7ヘテロダイマー前駆体のタンパク質分解性成熟によって生成された切断産物を示す図表である。Bmp4はプロドメイン内の2つの部位で切断され、SDS-PAGEゲル上で〜26kDaで移動する2つのプロドメイン断片(濃い緑色および黄色)および1つの二量体リガンド断片(ライトグリーン)を生成する。Bmp7は、1つの部位で切断され、1つのプロドメインフラグメント(マルーン)と、~35kDaで移動する1つのジメリックリガンドフラグメント(ピンク)を生成する。ヘテロダイマーリガンドは~30kDaで移行する。リガンドダイマーの銀色の棒は、このドメインに挿入されたmyc-エピトープタグを表す。

Bmp4mycまたはBmp7myc前駆体(200pg)をコードするRNA、または両方のRNA(それぞれ100pg)を2-4細胞段階でX.ラエビス胚に注入した。胚は、初期の胃路に達するまで16°Cで一晩培養した。この時点で、各群の20個の胚の芽胞から流体を吸引し、滅菌水を加えて合計30μLの体積を持ち込んだ。脱糖剤化後、各サンプルを2つのチューブに分割した。還元サンプルバッファーを一方のチューブに加え、他方に非還元サンプルバッファーを加えた。試料を100°Cに5分間加熱した。次いで、SDS/PAGEによってタンパク質を分離し、免疫ブロットをmyc-エピトープタグを認識する抗体でプローブした(図2B)。減少条件下では、切断されたBmp4モノマーに対応する単一のバンドと、切断されたBMP7モノマーに対応するよりゆっくりと移行するバンドが、それぞれBmp4またはBmp7のみを発現する胚からライセートで検出された(図2C、D、下パネル、レーン1、2)。両バンドは、Bmp4およびBmp7との共発現胚で検出された(図2C、D、下パネル、レーン3)。3つの群のそれぞれに比較的同等量のBmp4およびBmp7モノマーが存在した(下側パネル、還元)。この実験では、非還元条件下でタンパク質を分離した場合、中間移動性の単一の成熟したBmp4/7ヘテロ二量体バンドが、胚のBmp4およびBmp7を同時発現するBmp4ホモジマーの微量と共に検出された(図2C、上パネル)。これらの結果から、Bmp4およびBmp7前駆体タンパク質の同等のレベルがゼノプス胚で発現する場合、それらはホモジマーではなくヘテロ二量体を優先的に形成すると結論付ける。図2Dに示す実験では、Bmp4に対して有意に多くのBmp7タンパク質が存在する(下パネル、還元)。その結果、Bmp7およびBmp4前駆体タンパク質の両方を発現する胚において、Bmp4ホモダイマーは検出されず、代わりに利用可能なBmp4がBmp4/7ヘテロダイマーとして存在し、過剰なBmp7はホモダイマーを形成する。この実験は最適ではないが、Bmp4とBmp7前駆体の同等量を共発現することが目標であったため、Bmp4とBmp7が共発現した場合にどちらかのホモジマーよりもヘテロ二量体を優先的に形成するという結論と依然として一致している。

図 1.注射と吸引針。注射針として使用するために引っ張って切り取られた(A)、または吸引針(C)として使用するために引っ張って切り取られた、または引っ張って切り取られた代表的な針の写真が示されている。矢印と矢印の頭(A)は、ガラスが注射と吸引のための針を生成するために切り取られた点を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.X.ラエビスブラスト胞液から抽出された切断Bmpリガンドの分析(A)Bmp4及びBmp7ホモジメリック又はヘテロ二量体前駆体タンパク質から生成された切断産物及びmycエピトープタグ(銀棒)の位置を模式的に示す(B)注射及びブラストコエレ液抽出のタイミングを示す概略図。(C-D)ゼノプス胚は、200pgのBmp7またはBmp4 RNAを注入した、またはBmp4およびBmp7 RNAを混合した(それぞれ100pg)。胃炎期において、各実験群において同数の胚の芽球体から流体を抽出した。ブラストコエレ液中に存在するタンパク質を脱糖化し、SDS-PAGEにより分離した。myc-エピトープタグを認識する抗体を、免疫ブロットをプローブするために使用した。免疫反応性リガンドモノマーおよびダイマーの相対位置は、各ゲルの右側に概略的に示される。黒線(C)は、ブロット上の介在車線の除去を示す。示されたデータは、以前に発表されたスタディ¹⁰から抽出されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

解決	組成
0.2% トリケーヌ	20 gのトリケーヌを脱イオン水に溶解し、重炭酸ナトリウムを加えて pH を 7.4 に調整する
10x MBS	880 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgSO4,0.14 mM Ca(NO3)2, 0.41 mM CaCl2;NaOHでpH 7.5に調整してください。10x MBSストックは4°Cで保存し、必要に応じて希釈することができます。
2%システイン溶液	システイン1g当たり100mLの脱イオン水、水酸化ナトリウムでpHを7.8~8.0に調整します。 毎日新鮮にしてください。
20xデボアの池の水	100 mM NaCl, 1.3 mM KCl, 0.44 mM CaCl2;NaHCO3で pH 7.4 に調整します。DeBoerの池水の20倍のストックは4°Cで貯蔵し、必要に応じて希釈することができます。
4倍の非還元サンプルバッファー	200 mM トリス pH 6.8, 8% SDS, 0.4% ブロモフェノールブルー, 40% グリセロール.
4倍の還元サンプルバッファー	200 mM トリス pH 6.8, 8% SDS, 0.4% ブロモフェノールブルー, 40% グリセロール, 14.4 M ß-メルカプトエタノール
5% Ficoll ソリューション	フィコールの25gを500 mL 0.1x MBSで、水酸化ナトリウムでpHを7.5に調整します。 4 °Cで保管。
胚のライセートバッファー	50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% トリトン X-100, 0.1% SDS, 2.5 % NP-40. 4 °Cで保管。
ヒト絨毛性ゴナドトロピン	19G針に取り付けられた3mLシリンジを使用して、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(10,000 IU)のバイアルのゴム栓を通して2.5mLの無菌水を注入する。4 °Cで保管する。
テストバッファ	牛胎児血清10%、ペン/ストレップ1%(100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン1x MBS

表 1.

Discussion

ここで説明するプロトコルの主な利点は、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供することです。もう一つの利点は、エピトープタグ付きタンパク質を分析し、ほとんどのTgfßファミリープロドメインを認識する市販の抗体の不足を回避できることです。また、トランスフェクトされた培養哺乳動物細胞におけるエピトープタグ付きTgfß前駆体タンパク質の切断を解析することも可能であるが、X.laevisを用いることはいくつかの利点がある。初期のX.ラエビス胚は、内因性Tgfßコンバーサーゼ(ふれん、Pcsk5、Pcsk6およびPcsk7)13、14、16の候補であるPCファミリーの4つのメンバーすべてを発現する。いくつかの哺乳動物細胞株は、1つ以上のPCを発現せず、切断¹⁷を調べるために前駆体タンパク質とそのコン転換体の両方の異所発現を必要とする。より重要な考慮事項は、変換された細胞の一過性トランスフェクトによって生成される非常に高いレベルの前駆体タンパク質が、誤って折り畳まれた切断産物の分泌などのアーティファクトを引き起こす可能性があり、前駆体レベルがER¹⁸の品質管理能力を超えた場合に起こり得る。これは、誤って折り畳まれた切断産物が媒体に現れ、活性がアッセイされない限り誤って折り畳まれるので、前駆体二量化および切断に対する有害突然変異の影響を隠すことができる。対照的に、X.ラエビス胚を利用した実験は、折り畳みにおける欠陥を容易に検出し、ERにおける誤って折り畳まれたタンパク質応答による前駆体の喪失または非還元条件下での切断産物の異常な移動に至る^10、18。

ブラストコア吸引術の間、各胚からほぼ同等量のブラストコア液を抽出することが不可欠であり、特に、例えば、野生型および変異型前駆体から生成された切断産物を比較することが目標であった。これは不正確な科学ですが、各胚からほぼ同じ時間の吸引は、体積を正常化するのに役立ちます。さらに、各群のより多くの胚から流体を吸引することは、個々の胚間の体積の違いを正常化するのに役立ちます。

In vitro切断反応は、Tgfß前駆体タンパク質に存在する特定のPCモチーフが切断されているかどうかを判断し、所定の基質に対する内因性コンバートアダーゼとして潜在的なPCを同定および/または排除するために使用できる代替手順です。既存のプロトコルは、X.ラエビス卵母細胞を使用して、例えばウサギ網状赤血球を使用して、またはインビボを使用して、放射性標識前駆体タンパク質がインビトロで生成される簡単なアッセイを記述する。次いで、基板を、電気泳動とオートラジオグラフィー¹⁹によって分析された候補組換えPCおよび切断製品とインビトロでインキュベートされる。このプロトコルは、タンパク質がPC基板であるかどうかを判断し、どの潜在的な切断部位が生体内で利用されているかを特定するための迅速かつ容易な方法を提供するが、前駆体タンパク質が十分に折り畳まれたり二量化されたりする可能性は低いため、これらの実験から得られた切断情報は生体内の状況を反映していない可能性がある。

ここで説明するプロトコルの欠点の1つは、X.laevis胚で適切に折り畳まれた二量体化前駆体タンパク質を視覚化することができないということです。非切断単量体前駆体タンパク質は、ER後二量体および折り畳まれた前駆体よりもはるかに高いレベルでER内に蓄積するため、一過性のトランスフェクション哺乳類細胞などの他の異所性発現系でも同じことが言えます。二量体化前駆体は、ERを離れると急速に切断され、分泌される。前駆体タンパク質の二量体化およびフォールディングを分析することが不可欠である場合、有用な代替手順は、X.laevis ^oocytes20における放射線標識前駆体の人身売買および切断を調べることである。オートラジオグラフィーの高感度は、タンパク質が培養された哺乳類細胞や胚よりも卵母細胞の分泌系をよりゆっくりと移動するという事実と相まって、卵母細胞内の二量体化された前駆体タンパク質を検出し、タンパク質が適切に折り畳まれ、糖鎖付加状態¹⁸を調べることによってERを離れているかどうかをテストすることを可能にする^{。 21}.

要約すると、このプロトコルは、Tgfßファミリー前駆体タンパク質の成熟によって生成された切断産物を分析するための迅速かつ簡単な方法を提供する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ß-mercaptoethanol	Fisher	AC125470100
Bromophenol Blue	Fisher	B392-5
Calcium Chloride	Fisher	C79-500
Calcium Nitrate	Fisher	C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder	Fisher	12-141-364
Dumont #5 forceps	Fine Science tools	11251-10
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150H
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm	Narshige	G-1
Glycerol	Fisher	G33-4
HEPES	Fisher	BP310-500
Human chorionic gonadotropin	Sigma Aldrich	CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL	Fisher	8881501368
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
Magnesium Sulfate	Fisher	M63-500
Needle, 26 G	Fisher	305111
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140148
Picoliter Microinjector	Warner Instruments	PLI-100A
Pipette Puller	Narashige	PC-100
Potassium Chloride	Fisher	P217-500
PVDF Membrane	Sigma Aldrich	IPVH00010
Sodium Bicarbonate	Fisher	S233-500
Sodium Chloride	Fisher	S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher	BP166-500
Sodium Hydroxide	Fisher	S318-500
Tricaine-S	Pentair	TRS5
Tris	Fisher	BP152-5