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Biology

एक MADS-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के दो मोनोमर और BiFC-FRET-FLIM परख द्वारा कैल्शियम सेंसर प्रोटीन के बीच त्रिपक्षीय बातचीत का निर्धारण

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62791
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Interdisciplinary Centre for Plant Genomics, Department of Plant Molecular Biology, University of Delhi South Campus, 2University School of Biotechnology, Guru Gobind Singh Indraprastha University
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम प्रस्तुत करते हैं, BiFC आधारित FRET-FLIM परख द्वारा फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन का उपयोग करके तीन प्रोटीन भागीदारों के बीच टर्नरी जटिल गठन की कल्पना करने के लिए एक विधि। यह विधि वीवो मेंप्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन कॉम्प्लेक्स का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान है।

Abstract

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन कोशिकाओं में सभी जैविक प्रक्रियाओं का एक अभिन्न हिस्सा हैं क्योंकि वे सेलुलर कार्यों को विनियमित करने, बनाए रखने और संशोधित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ये बातचीत सिग्नल ट्रांसडक्शन, रोगजनक प्रतिक्रिया, सेल-सेल इंटरैक्शन, मेटाबोलिक और विकासात्मक प्रक्रियाओं जैसी घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल हैं। प्रतिलेखन कारकों के मामले में, इन बातचीत से उपइकानों का अल्पाहारीकरण हो सकता है, विशिष्ट उपकोशिकीय संदर्भों जैसे नाभिक, साइटोप्लाज्म आदि में तनहा हो सकता है, जो बदले में, डाउनस्ट्रीम जीन की अभिव्यक्ति पर अधिक गहरा प्रभाव डाल सकता है। यहां, हम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग (आईएफएल) से जुड़े द्विमेदीय फ्लोरेसेंस पूरक (बीएफसी) आधारित फैरस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरटी) का उपयोग करके वीवो त्रिपक्षीय बातचीत में कल्पना करने के लिए एक पद्धति प्रदर्शित करते हैं। इस प्रदर्शन के लिए चयनित प्रोटीन के दो BiFC भागीदारों के रूप में बातचीत, और उनके पुनर्गठित फ्लोरेसेंस गतिविधि तीसरे साथी के साथ FRET-FLIM परख करने के लिए प्रयोग किया जाता है । चार से पांच सप्ताह पुराने विकास-चैंबर में उगाए जाने वाले निकोटियाना बेंथामियाना पौधों को इस प्रदर्शन के लिए मॉडल प्लांट सिस्टम के रूप में इस्तेमाल किया गया है ।

Introduction

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) विभिन्न मेटाबॉलिक और विकासात्मक प्रक्रियाओं को विनियमित करके यूकेरियोटिक कोशिकाओं के उचित कामकाज का आधार बनाते हैं। कुछ पीपीआई स्थिर हैं, जबकि अन्य प्रकृति में क्षणिक हैं। इंटरैक्शन को डिमेरिक, ट्राइमेरिक, टेट्रामेरिक होमोसेक्सुअल और हेट्रोमेरिक1जैसे इंटरैक्शन में सदस्यों की संख्या और प्रकार के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है। प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान और लक्षण वर्णन से प्रोटीन कार्यों और नियामक नेटवर्क की बेहतर समझ हो सकती है।

प्रतिलेखन कारक प्रोटीन हैं जो नियामक कार्यों में शामिल हैं। वे डीएनए के लिए बाध्यकारी द्वारा अपने डाउनस्ट्रीम जीन के प्रतिलेखन की दर को विनियमित करते हैं । कभी-कभी प्रोटीन द्वारा उच्च क्रम के परिसरों का अल्पाधिकार या गठन उनके कार्यों को करने के लिए एक शर्त है2। प्लांट एमएड्स-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन कारक होमोटिक जीन हैं जो पुष्प संक्रमण, पुष्प अंग विकास, निषेचन, बीज विकास, सेनेसेंस और वनस्पति विकास जैसी विभिन्न प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं। वे उच्च क्रम परिसरों जो डीएनए3, 4से बांधने के लिए जानाजाताहै । ट्रांसक्रिप्शन कारकों और उनके इंटरएक्टिव के बीच पीपीआई नेटवर्क का अध्ययन करना ट्रांसक्रिप्शनल नियमन में अंतर्निहित जटिलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

निकोटियाना बेंथामियाना में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति वीवो5में प्रोटीन स्थानीयकरण या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय दृष्टिकोण रहा है। BiFC और FRET फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सिस्टम6का उपयोग कर वीवो में प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के तरीके हैं । इन दोनों तकनीकों का संयोजन तीन प्रोटीन7के बीच बातचीत को प्रकट करने के लिए दिखाया गया है । FRET को स्वीकार्य फोटोब्लैचिंग, संवेदी उत्सर्जन, और फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग (एफबीम) तकनीक का उपयोग करके मापा जाता है। FLIM आधारित FRET परख एक उपकरण है कि उनके फ्लोरेसेंस जीवन काल 8 के आधार पर दो अणुओं के बीच ऊर्जा हस्तांतरण माप के लिए सटीक मात्राकरण और स्थानिक विशिष्टता प्रदान करता है के रूप मेंउभराहै । फ्लॉम उस समय का उपाय करता है जब एक फ्लोरोफोर फोटॉन उत्सर्जित करने से पहले उत्तेजित अवस्था में रहता है और यह तकनीकों से बेहतर होता है जो अकेले तीव्रता माप का उपयोग करते हैं9,10. निकोटियाना बेंथामियाना और प्याज एपिडर्मल छिलके जैसे विषम प्रणालियों के अलावा, हाल की रिपोर्टों में देशी परिस्थितियों11, 12के तहत प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के वीवो विश्लेषण में अरबीडोप्सिस जड़ों और युवा चावल रोपण आदि के उपयोग का प्रदर्शन किया गया है।

एक उपयुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के अलावा, BiFC और FRET परख के लिए बातचीत भागीदारों का चयन भी इस प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । बीआईएफसी विन्यास में उपयोग किए जाने वाले भागीदारों में पीपीआई को वीआइपी प्रयोग13में एक संयुग्मित भागीदार के रूप में उनके उपयोग से पहले उचित नियंत्रणों का उपयोग करके मान्य किया जाना चाहिए। बीएफसी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एन-और सी-टर्मिनल भागों के संरचनात्मक पूरक का उपयोग करता है। सबसे में एक आम सीमा नहीं तो सभी फ्लोरोसेंट BiFC में इस्तेमाल प्रोटीन दो व्युत्पन्न nonfluorescent टुकड़े के बीच आत्म विधानसभा गया है, झूठी सकारात्मक फ्लोरेसेंस में योगदान और संकेत को शोर (एस/एन) अनुपात14कम हो जाती है । हाल के घटनाक्रमों में बिंदु उत्परिवर्तन या फ्लोरोसेंट प्रोटीन को विभाजित करने की स्थिति सहित, बढ़ी हुई तीव्रता, उच्च विशिष्टता, उच्च एस/एन अनुपात15,16के साथ BiFC जोड़े को जन्म दिया है । इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग प्रयोग की उपयुक्तता के आधार पर बीएफसी को बाहर ले जाने के लिए भी किया जा सकता है।

परंपरागत रूप से, सीएफपी और वाईएफपी का उपयोग एफर्टप्रयोगों 17में दाता और स्वीकारकर्ता जोड़ी के रूप में किया गया है। हालांकि, YFP या एम-सिट्रीन को अरबीडोप्सिस रूट सिस्टम में लक्षित प्रोटीन की देशी अभिव्यक्ति के दौरान उच्च क्वांटम यील्ड (क्यूवाई) के कारण बेहतर FRET दाताओं (जब स्वीकारकर्ता के रूप में आरएफपी के साथ उपयोग किया जाता है) पाया गया। प्रमोटरों का चयन (मूल/अंतर्जात बनाम संविलियन) और फ्लोरोफोर भी एक सफल बिएफसी-FRET-FLIM प्रयोग को डिजाइन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यह ध्यान दें कि FRET दाताओं की दक्षता और FRET जोड़े की उपयुक्तता प्रमोटर में परिवर्तन और जैविक प्रणाली अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है के साथ बदल जाते है आवश्यक है । फ्लोरोफोर का क्यूवाई, जो इसकी चमक से संबंधित है, पीएच, तापमान और उपयोग में जैविक प्रणाली पर निर्भर करता है। हमारा सुझाव है कि FRET प्रयोग के लिए फ्लोरोफोर जोड़ी चुनने से पहले इन मानदंडों पर अच्छी तरह से विचार किया जाए। जैविक प्रणाली, प्रमोटरों, और इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल प्रोटीन BiFC FRET-FLIM प्रयोग के लिए CFP-YFP फ्लोरोफोरस के साथ अच्छी तरह से काम किया ।

वर्तमान अध्ययन में, हम BiFC आधारित FRET का उपयोग कर तीन प्रोटीन अणुओं के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए FLIM की सुविधा को शामिल करते हैं । इस तकनीक में दो प्रोटीन को स्प्लिट वाईएफपी प्रोटीन और तीसरा प्रोटीन सीएफपी के साथ टैग किया गया है। चूंकि हम कैल्शियम सेंसर प्रोटीन (सी) के साथ एक MADS-बॉक्स प्रोटीन (एम) होमोसैमर की बातचीत का अध्ययन करने में रुचि रखते थे, इसलिए इन प्रोटीनों को पीएसइट-1सीए और पीएसइट-3सीए वैक्टर18में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया गया था। बातचीत भागीदारों में से दो, इस परख में, N के साथ टैग किया गया था और सी-PSPYNE-35S और pSPYCE-35S वैक्टर19में YFP के टर्मिनल भागों, और कार्यात्मक YFP के पुनर्गठन में उनकी बातचीत के परिणाम है कि तीसरे बातचीत साथी है, जो CFP के साथ टैग किया गया है (FRET दाता के रूप में अभिनय)(चित्रा 11 ). इस विशेष मामले में, दो एम मोनोमर और एम और सी के बीच पीपीआई को खमीर-दो-हाइब्रिड प्रणाली के साथ तीन विभिन्न प्रणालियों में बीआईएफसी प्रदर्शन करके मान्य किया गया है। इन वैक्टर को इलेक्ट्रोपाउरेशन द्वारा एग्रोबैक्टीरियम टुमिफैक्टियंस जीवी 3101 स्ट्रेन में जुटाया गया था। GV3101 तनाव एक निरस्त्र Ti plasmid pMP90 (pTiC58DT-डीएनए) gentamicin प्रतिरोध20के साथ है । ट्रांसजीन को रोकने के लिए सभी घुसपैठ के साथ - साथ पी19 एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेनजोड़ा गया था । हम अनुशंसा करते हैं कि त्रिपक्षीय बातचीत को मान्य करने के लिए तीन प्रोटीन का उपयोग विपरीत संरचनाओं में भी किया जाना चाहिए।

इस तकनीक में, हमने FLIM को नियोजित किया है, जहां पहले, दाता (अनकांपित दाता जीवनकाल) का फ्लोरेसेंस जीवनकाल एक स्वीकार्य व्यक्ति के अभाव में मापा जाता है। उसके बाद, इसका जीवनकाल स्वीकारकर्ता (शमन दाता जीवनभर) की उपस्थिति में मापा जाता है। दाता फ्लोरेसेंस लाइफटाइम में यह अंतर FRET दक्षता की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है, जो फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी का प्रदर्शन करने वाले फोटॉनों की संख्या पर निर्भर करता है। नीचे उल्लिखित एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो निकोटियाना बेंथामियाना में फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन को क्षणिक रूप से व्यक्त करके किसी भी तीन प्रोटीन के बीच एक टर्नरी परिसर के गठन का निर्धारण करता है और बिएफसी-एफआरटी-आईएफएम द्वारा उनकी बातचीत को परखता है।

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Protocol

1. प्रवेश और गंतव्य वैक्टर में जीन की क्लोनिंग(चित्रा 2)

  1. पीसीआर द्वारा ब्याज के जीन (एम और सी जीन) के कोडिंग अनुक्रम (सीडीएस) को बढ़ाना और उन्हें उपयुक्त प्रवेश वैक्टर (जैसे, PENTR/D-TOPO वेक्टर) में क्लोन; इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले वैक्टर के लिए तालिका 1 देखें)।
  2. एंटीबायोटिक दवाओं युक्त प्लेटों पर क्लोन बढ़ो। 22,23,23को पाचन और डीएनए अनुक्रमण पर प्रतिबंध लगाकर एंटीबायोटिक दवाओं पर चुने गए क्लोनों को मान्य करें ।
  3. प्रवेश क्लोन से गंतव्य वैक्टर (PSPYNE-35S, PSPYCE-35S, PSITE-1CA और PSITE-3CA) के लिए पुनर्गठित सीडीएसएस जुटाएं और प्रतिबंध एंजाइम पाचन द्वारा गंतव्य वैक्टर के लिए प्रवेश से दृश्यों के हस्तांतरण की पुष्टि करें ।
    नोट: इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सभी वैक्टर तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।
  4. अंत में, इलेक्ट्रोपॉरेशन (चित्र 3)24)द्वारा गंतव्य वैक्टर के साथ एग्रोबैक्टीरियम जीवी 3101 (पीएफपी90 (जेंटआर))कोशिकाओं को बदलें।

2. निकोटियाना बेंथामियाना संयंत्रों के लिए विकास की स्थिति

नोट: नियंत्रण स्थितियों में 4-6 पत्ती चरण तक निकोटियाना पौधों को उगाएं।

  1. निकोटियाना पौधों को विकसित करने के लिए, 2:1:1 के अनुपात में कोकोपियट और खाद के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिट्टी घोला जा सकता है मिश्रण द्वारा मिट्टी मिश्रण तैयार करें ।
  2. मिट्टी के बिस्तर बनाने और इसे डिओनाइज्ड पानी से तर करने के लिए प्लास्टिक ट्रे में इस मिट्टी के मिश्रण की 1 इंच मोटी परत फैलाएं। इस मिट्टी के बिस्तर में लगभग 200 बीज छिड़कें।
  3. इसे 1 सेमी खड़े पानी वाली एक बड़ी ट्रे में स्थानांतरित करें। नमी कक्ष बनाने के लिए इस ट्रे को प्लास्टिक की चादर से ढक दें।
  4. इस सेट को 16 घंटे की रोशनी और 8 घंटे के अंधेरे चक्र के साथ 150-170 माइक्रोमोल/मीटर 2 एस प्रकाश तीव्रता के साथ23डिग्री सेल्सियस पर सेट एक विकास कक्ष में स्थानांतरित करें ।
  5. दो सप्ताह के बाद, युवा रोपण को छोटे, 3-4 इंच के बर्तनों में स्थानांतरित करें जिसमें पानी-संतृप्त मिट्टी मिश्रण होता है।
  6. इन बर्तनों को प्लास्टिक ट्रे में रखें और उन्हें चार और हफ्तों के लिए ग्रोथ चैंबर में स्थानांतरित करें।

3. कृषि घुसपैठ के लिए बैक्टीरियल उपभेदों को तैयार करें

नोट: कृषि घुसपैठ के लिए, जीवाणु उपभेदों को उपयुक्त अनुपात में एग्रोबैक्टीरियम के p19 तनाव के साथ हौसले से उपसंस्कृत और मिश्रित करने की आवश्यकता है।

  1. 2xYT एगर प्लेटें तैयार करें जिनमें रिफाम्पिकिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल), जेंटामिसिन (25 माइक्रोग्राम/एमएल) और कानमाइसिन (50 माइक्रोग्राम/एमएल) एग्रोबैक्टीरियम हार्बरिंग PSPYNE-35S और PSPYCE-35S वेक्टर के लिए तैयार करें। तनाव युक्त PSITE वेक्टर के लिए, रिफाम्पिकिन (१०० μg/mL), gentamicin (25 μg/mL) और spectinomycin (५० μg/mL) का उपयोग करें ।
  2. लकीर एक लैमिनार प्रवाह हुड में बाँझ टीका छोरों का उपयोग कर इन प्लेटों पर प्लाज्मिड युक्त एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों।
  3. अंधेरे में 48 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इन इनक्यूबेट।
  4. एग्रोबैक्टीरियम जीवी 3101 स्ट्रेन को बीमा बनाकर बीएफसी और वीआरटी स्ट्रक्ट्स (पीएसपीवाईने-35S में तैयार) को इनोक्यूलेट करके इस प्रक्रिया को शुरू करें, pSPYCE-35S और PSITE वैक्टर) 2xYT शोरबा के 10 mL में लकीर प्लेटों से उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं युक्त (Rifampicin (१०० μg/mL), gentamicin (25 μg/mL), kanamycin (५० μg/mL) या spectinomycin (५० μg/mL)) ।
  5. इसके अतिरिक्त, 2xYT शोरबा के 10 एमएल को इनोक्यूलाइज करके एग्रोबैक्टीरिया के पी 19 तनाव की संस्कृति शुरू करें जिसमें रिफाम्पिकिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) और कानमाइसिन (50 माइक्रोग्राम/एमएल) शामिल हैं।
    नोट: ट्रांसजीन चुप्पी को रोकने के लिए p19 तनाव जोड़ा जाता है।
  6. फ्लास्क को एल्यूमीनियम फॉयल से ढककर अंधेरे में 16 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस और 170 आरपीएम पर इनक्यूबेटर शेकर सेट में रखें।
  7. रातोंरात वृद्धि के बाद, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम पर संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व (O.D.) को मापने के लिए इस संस्कृति के 1 एमएल को डिस्पोजेबल क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
  8. उपयुक्त BiFC और FRET साथी की संस्कृतियों को मिलाएं जिसमें उपभेद होते हैं ताकि प्रत्येक संस्कृति का अंतिम O.D 0.5 हो और पी19 2 मिलील की कुल मात्रा में 0.3 हो।
  9. इन अनुपातों को प्राप्त करने के लिए, नीचे उल्लिखित सूत्र का उपयोग करें:
    Equation 1
    ओडीप्राप्त = संस्कृति के O.D. ६०० एनएम पर मापा
    वीसंस्कृति = संस्कृति की मात्रा आवश्यक
    ओडीअंतिम = निर्माण के लिए 0.5 और p19 के लिए 0.3
    Vअंतिम = घुसपैठ के लिए अंतिम मात्रा, जो 2 एमएल है
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले निर्माण संयोजन तालिका 2में निर्दिष्ट हैं।
  10. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर मिश्रित एग्रोबैक्टीरियम संस्कृतियों को सेंट्रलाइज करें और ध्यान से सुपरनैंट को त्यागें। हौसले से तैयार घुसपैठ बफर (10 mM एमईएस, एसीटोसिरिंगोन के 100 माइक्रोन, और 10 m M MgCl2)के 2 मिलीलन में गोली को फिर से रीस्ड करें। समरूप सेल सस्पेंशन बनाने के लिए भंवर मिक्सर का इस्तेमाल करें।
  11. 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में पुनर्नक्षित कोशिकाओं युक्त ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  12. इस बीच, निर्माण मिश्रण के साथ प्रत्येक संयंत्र पॉट लेबल यह के साथ घुसपैठ होने जा रहा है । प्रत्येक घुसपैठ मिश्रण के लिए दो पौधों का उपयोग करें।
  13. एग्रोबैक्टीरियल मिक्स के साथ 1 एमएल सुईलेस सिरिंज भरें। धीरे से लेकिन मजबूती से पूरी तरह से विस्तारित पत्ती के abaxial पक्ष पर सिरिंज प्रेस जबकि दूसरी तरफ से पत्ती का समर्थन । धीरे-धीरे प्लंजर को तब तक पुश करें जब तक कि समाधान सिरिंज टिप के बराबर पत्ती क्षेत्र में न उड़ जाएं।
  14. चित्रा 4 में दिखाया गया है, प्रति पौधे एक पत्ते और 3-4 पत्तियों पर चार स्थानोंतक घुसपैठ करें।
    नोट: क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए नमूनों के बीच 70% शराब के साथ दस्ताने बदलें या दस्ताने पोंछें।
  15. सभी बर्तनों को एक ट्रे में स्थानांतरित करें और चरण 2 में उल्लिखित समान शर्तों के तहत एक विकास कक्ष में इनक्यूबेट करें।
  16. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विभिन्न समय बिंदुओं पर एग्रोइंफिलट्रेट पत्ती के एक छोटे से हिस्से की जांच करें। जब YFP और CFP दोनों से फ्लोरेसेंस कोशिकाओं में पता लगाने योग्य हैं, BiFC-FRET FLIM परख के लिए कंफोकल माइक्रोस्कोप के लिए आगे बढ़ें । इस प्रयोग में यह विश्लेषण कृषि घुसपैठ के 3 दिन बाद किया गया।
    नोट: BiFC-FRET FLIM परख में इस्तेमाल किया चिमरिक प्रोटीन के अतिव्यक्तता से बचने के लिए हर प्रमोटर और जीन संयोजन के लिए व्यक्तिगत रूप से इनक्यूबेशन के बाद कृषि भराव अवधि निर्धारित करें । साथी प्रोटीन की अधिकव्यक्तता झूठी सकारात्मक बातचीत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

4. फ्लोरेसेंस विज़ुअलाइज़ेशन के लिए स्लाइड तैयार करें

  1. जब पौधे दृश्य के लिए तैयार होते हैं, तो घुसपैठ के घाव से 5-8 मिमी दूर स्क्वायर लीफ के नमूनों को काटें, और उन्हें साफ स्लाइड पर आसुत पानी में माउंट करें।
    नोट: पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए, 80% इथेनॉल के साथ स्लाइड को साफ करें जिसके बाद आसुत पानी 3-4 बार, हवा उन्हें सूखती है, और उन्हें शोषक शीट पर रखें।
  2. एक नाखून तामचीनी का उपयोग कर एक साफ कवरलिप और सील के साथ पत्ती के नमूने को कवर करें।
  3. एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के तहत इन नमूनों की कल्पना करें।

5. एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके FRET-FLIM विश्लेषण

नोट: इस प्रक्रिया में, दो प्रोटीन के बीच बातचीत का निर्धारण और मात्रा निर्धारित करने का आधार स्वीकारकर्ता के साथ अपनी बातचीत पर FRET-दाता साथी के फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी है, जिसका उपयोग FRET की दक्षता की गणना करने के लिए किया जाता है। त्रिपक्षीय बातचीत के मामले में जटिलता और बढ़ जाती है क्योंकि इस मामले में FRET-स्वीकारकर्ता, एक भी अणु नहीं है बल्कि एक स्प्लिट वाईएफपी-बीएफसी जोड़ी है, जिसे पहले वीवो में पुनर्गठित किया जाना चाहिए ताकि एक कार्यात्मक FRET-स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर बन सके। FRET-FLIM बाहर ले जाने के लिए, एक दाता अणु फ्लोरेसेंस जीवन भर निर्धारित करने की जरूरत है-पहले अकेले और फिर एक FRET साथी की उपस्थिति में ।

  1. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में फ्लैम एप्लिकेशन खोलें, कंसोल शुरू करें और फ्लोरेसेंस जीवनकाल को मापने के लिए पैटर्न-मान्यता फोटॉन-काउंटिंग का उपयोग करें। मानक 'सभी फोटॉन गिनती' माप मोड का चयन करें।
  2. दो प्रकार के कृषि-घुसपैठ वाले पौधों से नमूनों का विश्लेषण करें: एक दाता के साथ केवल (सी-सीएफपी) और दूसरा दाता और स्वीकारकर्ता (सी-सीएफपी, एम-वाईएफपी के साथ) दोनों के साथ।
    नोट: क्योंकि एम प्रोटीन की बातचीत पहले से ही बीएफसी और Y2H का उपयोग कर सी प्रोटीन के साथ मान्य किया गया है, इस बातचीत जोड़ी के साथ अच्छी FRET दक्षता की उम्मीद है।
  3. इसके बाद, सी-सीएफपी एग्रो-घुसपैठ वाले पत्ते को स्कैन करें और एक सेल पर ध्यान केंद्रित करें जिसमें अच्छा सीएफपी फ्लोरेसेंस दिखाया गया है। लेजर स्कैनिंग मोड शुरू करें और सीएफपी विज़ुअलाइज़ेशन और फ्लिम माप (λपूर्व 440 एनएम पल्स लेजर, λउन्हें हाइब्रिड डिटेक्टरों द्वारा 480-520 एनएम, स्कैन स्पीड 512 x 512 पिक्सल पर 400 हर्ट्ज) के लिए सिस्टम सेट करें।
  4. उस क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए फोकस, ज़ूम और स्मार्ट लाभ को समायोजित करें जिसे कैप्चर करने की आवश्यकता है।
  5. पल्स प्रति लगभग 0.1 फोटॉन का कब्जा प्राप्त करने के लिए पर्याप्त लेजर शक्ति पर नमूना रोशन करें। परिवर्तनीय फ्लोरेसेंस तीव्रता वाले नमूनों के लिए, आजीवन माप के लिए आवश्यक पर्याप्त फोटॉन एकत्र करने के लिए 50 फ्रेम कैप्चर करें। सीएफपी अपने अनुरूप अनुकूलन के कारण दो फ्लोरेसेंस जीवन काल को प्रदर्शित करता है; इसलिए, एन-घातीय टोह लेने वाले मॉडल का उपयोग करके डेटा को फिट करें, जबकि एन के मूल्य को 2 के बराबर रखते हुए।
  6. इन सेटिंग्स में, सीएफपी 1.0 और 3.2 एनएस के दो जीवन काल दिखाता है। यहां उच्च, 3.2 एनएस, जीवनकाल का उपयोग बाद की सभीगणनाओं 25, 26के लिए कियाजाताहै।
  7. FLIM का उपयोग करके FRET दक्षता की गणना करने के लिए, जो दो प्रोटीन के बीच बातचीत की डिग्री का पैमाना है, एक पत्ती का नमूना लें जिसे सी-सीएफपी और एम-वाईएफपी के साथ सह-घुसपैठ की गई है। एक सेल की तलाश करें जो सी-सीएफपी और एम-वाईएफपी दोनों को व्यक्त करता है और पूर्व 440 एनएम पल्स लेजर λ उपयोग करके अपने संबंधित उत्सर्जन पैटर्न की पुष्टि करता है, λउन्हें 480-520 एनएम और λपूर्व 514 एनएम सफेद प्रकाश लेजर के साथ λ 526-550 एनएम। क्रमिक रूप से एक कोशिका को स्कैन और पहचानें जो सीएफपी और वाईएफपी फ्लोरेसेंस दोनों को दिखाती है।
  8. दोनों प्रोटीन से फ्लोरेसेंस की पुष्टि करने के बाद, सीएफपी के जीवनकाल को मापने के लिए फ्लिम कंसोल पर स्विच करें, जो हमने सी-सीएफपी (चरण 5.5) के जीवनकाल को मापने के लिए पहले इस्तेमाल की थी।
    नोट: यह सेल एम-वाईएफपी को भी व्यक्त कर रहा है जो संभावित रूप से सी-सीएफपी के साथ बातचीत कर सकता है और सी-सीएफपी के जीवनकाल में कमी का कारण बन सकता है।
  9. एन = 2 के साथ एन-एक्सपोनेंटियल टोमेंवोल्यूशन मॉडल का उपयोग करके प्राप्त ग्राफ को फिट करें। सीएफपी जीवनकाल में 3.2 से 2.6 एनएस तक की कमी देखी गई, जो सीएफपी और वाईएफपी(चित्रा 5A)के बीच फैस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण का संकेत है।
  10. अब सॉफ्टवेयर में FRET कंसोल शुरू करें और सॉफ्टवेयर में प्रदान किए गए समीकरण में अनकांचित दाता जीवन भर मैन्युअल रूप से प्रवेश करके FRET दक्षता की गणना करें। और मनाया FRET दक्षता है: 56%.
  11. त्रिपक्षीय बातचीत
    1. अंत में, तीन भागीदारों के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए, सी-सीएफपी, एम-वाईएफपीएन और एम-वाईएफपीसी के साथ सह-घुसपैठ करने वाले पौधे से पत्ती का नमूना लें।
    2. एक कोशिका के लिए पत्ती एक्सप्लांट को स्कैन करें जो सीएफपी और पुनर्गठित वाईएफपी फ्लोरेसेंस दोनों को दिखाता है जो दो एम प्रोटीन के बीच बीएफसी इंटरैक्शन से उत्पन्न होता है। पहले इस्तेमाल किए गए एक ही लेजर और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें।
    3. इसके बाद, 514 एनएम लेजर को बंद करें और फ्लिम कंसोल पर जाएं।
      नोट: यदि एम-वाईएफपी डिमर सी-सीएफपी के साथ बातचीत करता है, तो किसी को सी-सीएफपी के जीवनकाल में कमी देखनी चाहिए जैसा कि एम-वाईएफपी के साथ बातचीत के दौरान मनाया गया था। हालांकि, अगर सी-सीएफपी एम-वाईएफपी डिमर के साथ बातचीत करने में विफल रहता है, तो इसका फ्लोरेसेंस लाइफटाइम 3.2 एनएस पर रहना चाहिए।
    4. ऊपर उल्लिखित समान सेटिंग्स का उपयोग करके, पुनर्गठित वाईएफपी की उपस्थिति में सीएफपी जीवनकाल को मापें। एन = 2 के साथ एन-एक्सपोनेंटियल टोमेंट्यूशन मॉडल का उपयोग करके प्राप्त ग्राफ को फिट करें, और FRET कंसोल में जाएं।
      नोट: सीएफपी जीवनकाल में 3.2 से 2.3 एनएस तक गिरावट आई है। ऊपर वर्णित FRET दक्षता की गणना करें। गणना की गई FRET दक्षता 55% है। दाता जीवनकाल में कमी और ५५% की अच्छी FRET दक्षता दो एम प्रोटीन और वीवो में सी प्रोटीन के बीच त्रिपक्षीय बातचीत की पुष्टि (चित्रा 5Bदेखें) ।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल पौधों में वीवो त्रिपक्षीय प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन में अध्ययन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का प्रतिनिधित्व करता है। प्रोटोकॉल का मूल सिद्धांत तीन प्रोटीन भागीदारों के बीच टर्नरी जटिल गठन को मापने के लिए एक परख बनाने के लिए दो फ्लोरेसेंस-टैग किए गए प्रोटीन-इंटरैक्शन तकनीकों यानी बीएफसी और FRET को जोड़ना है। यहां, हमने FRET स्वीकारकर्ता की उपस्थिति और अनुपस्थिति में FRET दाता साथी के फ्लोरेसेंस जीवनकाल को मापने के लिए FLIM का उपयोग किया है। यदि दोनों प्रोटीनों के बीच सकारात्मक बातचीत होती तो दाता के फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी की उम्मीद की गई थी । हम दाता के फ्लोरेसेंस जीवनकाल को मापने के साथ शुरू किया, यानी, सी-CFP प्रोटीन । हमने 'सभी फोटॉन काउंटिंग' माप मोड का उपयोग किया है, जो ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र में सभी फोटॉनों के साथ फ्लोरेसेंस क्षय वक्र बनाता है और पारंपरिक समय-सहसंबद्ध एकल-फोटॉन गिनती की तुलना में एक छोटी त्रुटि के साथ एक मापा जीवनकाल देता है। हाई-स्पीड फ्लिम फिल्टर दालों के बीच एकल-फोटॉन घटनाओं के उपयोग को सुनिश्चित करता है। इसके बाद पिक्सेल-बाय-पिक्सेल गणना औरक्षय वक्र 27की फिटिंग के लिए एक उपयुक्त गणितीय मॉडल चुना गया ।

यहां उपयोग किए जाने वाले सीएफपी संस्करण (और इसका सबसे अधिक उपयोग किया जाता है) में अनुरूप अनुकूलन होता है, जिसके परिणामस्वरूप दो फ्लोरेसेंस जीवनकाल होते हैं। इसलिए, हमने बहु-घातीय दाता के लिए एक मॉडल का उपयोग करके फ्लोरेसेंस क्षय वक्र को फिट करने का फैसला किया। इसके परिणामस्वरूप सीएफपी के दो जन्मों को अलग किया जाता है, जो हमारे मामले में 1.0 एनएस और 3.3 एनएस के रूप में देखे गए थे। FRET दक्षता की गणना के लिए, हमने उच्च सीएफपी जीवनकाल का उपयोग किया, यानी, 3.3 एनएस (औसत फ्लोरेसेंस लाइफटाइम, एन = 10)।

सकारात्मक नियंत्रण (सी-सीएफपी और एम-वाईएफपी) के मामले में, हम दाता (सी-सीएफपी) के फ्लोरेसेंस जीवनकाल में 3.3 एनएस से 2.5 एनएस(चित्रा 6)तक कमी का पालन करते हैं। और निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके FRET दक्षता 56% थी।

Equation 2
ई = FRET दक्षता
Dτ= अनकांचित दाता लाइफटाइम (दाता केवल नमूना, सी-CFP)
इसके बादाम्प = मतलब क्षय समय - आयाम भारित औसत जीवनकाल

दो एम मोनोमर और सी प्रोटीन के बीच बातचीत के परिणामस्वरूप पुनर्गठित वाईएफपी के साथ इसी तरह की एक अभ्यास के परिणामस्वरूप एक सकारात्मक बातचीत हुई जिससे स्वीकारकर्ता (सी-सीएफपी) के फ्लोरेसेंस लाइफटाइम को २.६ एनएस तक कम किया गया । गणना की गई FRET दक्षता इस मामले में लगभग 55% थी(चित्र 6)।

यदि सीएफपी संस्करण या किसी अन्य दाता फ्लोरोफोर में एक ही फ्लोरेसेंस जीवनकाल है, तो क्षय वक्र को मोनो-एक्सपोनेन्शियल डोनर मॉडल का उपयोग करके फिटिंग की आवश्यकता होगी। उस मामले में, फॉर्मूले का उपयोग करके वीआरटी की दक्षता की गणना की जा सकती है:

Equation 3
केवल दाता युक्त नमूने का फ्लोरेसेंस जीवनकाल है
αquench स्वीकारकर्ता की उपस्थिति में मापा जाता है (जबकि FRET जगह ले जा रहा है)

प्रत्येक प्रायोगिक सेटअप के लिए कम से कम 10 कोशिकाओं से कच्चे फ्लोरेसेंस लाइफटाइम रीडिंग को प्लॉट्सOfData ऑनलाइन टूल (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, चित्रा 6C)28का उपयोग करके एक तितर-बितर भूखंड के रूप में संकलित किया गया है। FRET दाता के फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी इन तीन प्रोटीन के बीच एक त्रिपक्षीय बातचीत के लिए मजबूत सबूत प्रदान करता है ।

Figure 1
चित्रा 1:BiFC और BiFC FRET-FLIM विधि के सिद्धांत का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। दो एम प्रोटीन के बीच बातचीत के परिणामस्वरूप वाईएफपी का पुनर्गठन होता है, और यह जोड़ी तब एक स्वीकार्य अणु के रूप में कार्य कर सकती है। तीसरा प्रोटीन सी-सीएफपी यहां एक FRET दाता के रूप में कार्य करता है । इस प्रकार, एक सकारात्मक FRET संकेत दो एम प्रोटीन और एक सी प्रोटीन के बीच त्रिपक्षीय बातचीत साबित होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अंतिम गंतव्य वैक्टर में एम और सी जीन कीक्लोनिंग। जीन के कोडिंग दृश्यों को प्रवर्धित किया जाता है और पहले PENTR/D-TOPO वेक्टर में क्लोन किया जाता है जिसके बाद अंतिम गंतव्य वैक्टर्स पसाइट-1सीए, पीएससाइट-3सीए, पीएसपीईएन-35एस और एलआर क्लोनेज II पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया द्वारा PSPYCE-35S में निर्माणों को जुटाने के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-इलेक्ट्रोपॉजेशन का उपयोग करके, एग्रोबैक्टीरियम टमेफैपियंस के GV33101 तनाव में वांछित वेक्टर संयोजन वितरित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4:निकोटियाना संयंत्रों की कृषि-घुसपैठ का आरेखीय चित्रण और प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले निर्माण संयोजन। (ए)एग्रोबैक्टीरियल कल्चर युक्त सी-सीएफपी दाता के रूप में कार्य करता है केवल नमूना(बी)सी-सीएफपी और एम-वाईएफपी सकारात्मक एफआरटी नियंत्रण,(सी)सी-सीएफपी और एम प्रोटीन बीएफसी संरचना में; एम-वाईएफपीएन और एम-वाईएफपीसी का उपयोग त्रिपक्षीय बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5-स्वीकारकर्ता की अनुपस्थिति और उपस्थिति में नमूनों के फ्लोरेसेंस जीवनकाल का प्रतिनिधित्व। (ए)एम-वाईएफपी की उपस्थिति में सी-सीएफपी का जीवनकाल 2.67 एनएस तक कम हो जाता है जैसा कि बार ग्राफ द्वारा दिखाया गया है। इसी प्रकार(बी)त्रिपक्षीय बातचीत के मामले में सी-सीएफपी के जीवनकाल में 23 एनएस की कमी को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:दो एम मोनोमर और एक सी प्रोटीन के बीच त्रिपक्षीय बातचीत BiFC आधारित FRET-FLIM परख का उपयोग कर विश्लेषण किया । (क)एक कोशिका जो संबंधित उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके दाता और स्वीकारकर्ता प्रोटीन से निकलने वाली या तो केवल सीएफपी (आई) या सीएफपी और वाईएफपी (ii और iii) से उत्पन्न होती है । (ख)i, ii, iii कोशिका में सीएफपी के फ्लोरेसेंस लाइफटाइम दिखाने वाली FLIM छवि का प्रतिनिधित्व करता है। रंग पैमाने पर बार जीवनकाल के अनुरूप छद्म रंग का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन (सी)स्कैटर प्लॉट सीएफपी के फ्लोरेसेंस जीवनकाल दिखाता है जब अकेले या बातचीत करने वाले भागीदारों के साथ मौजूद होता है जहां एन = 10। प्लॉट ऑनलाइन टूल प्लॉट्सऑफडेटा (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/) का उपयोग करके उत्पन्न होता है; मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम को नमूना बिंदुओं के बीच की रेखा के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: बीआईएफसी द्वारा प्रोटीन एम और सी के बीच बातचीत के सत्यापन के लिए नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग। एम प्रोटीन (MΤCBD) के उत्परिवर्तित रूप के बीच बातचीत, जिसमें सभी सी प्रोटीन बाध्यकारी क्षेत्रों का अभाव है, और सी प्रोटीन-वाईएफपीसी संलयन को बीएफसी विश्लेषण के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करने का प्रयास किया जाता है। ऊपरी पैनल प्याज के छिलके कोशिकाओं में MΤCBD-GFP की क्षणिक अभिव्यक्ति दिखाते हैं, और एमकेसीबीडी-वाईएफपीएन और सी-वाईएफपीसी के बीच प्रयासात्मक बातचीत के परिणाम निचले पैनलों में दिखाए जाते हैं। पुनर्गठित वाईएफपी से फ्लोरेसेंस का अभाव एमसीसीबीडी और सी प्रोटीन के बीच बातचीत की कमी का संकेत है। एन, नाभिक; सी, साइटोप्लाज्म; BF, उज्ज्वल क्षेत्र; FL, फ्लोरेसेंस; ओएल, डिजिटल ओवरले, साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र को सफेद तीर का उपयोग करके दिखाया गया है। स्केल बार = 10 माइक्रोन करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

S.No। सदिश एंटीबायोटिक चयन
एंट्री वेक्टर
1 PENTR/D-TOPO कानमाइसिन
डेस्टिनेशन वैक्टर
2 pSPYNE-35S कानमाइसिन
3 pSPYCE-35S कानमाइसिन
4 पसाइट-1सीए स्पेक्टिनोमाइसिन
5 पसाइट-3सीए स्पेक्टिनोमाइसिन

तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले वैक्टर।

S.No। बातचीत निर्माणों का संयोजन
1 त्रिपक्षीय बातचीत सी-सीएफपी + एम-वाईएफपीएन: एम-वाईएफपीसी + पी 19
2 सकारात्मक नियंत्रण सी-सीएफपी + एम-वाईएफपी + पी 19
3 नकारात्मक नियंत्रण सी-सीएफपी + खाली-वाईएफपी + p19
वैकल्पिक (विपरीत संरचनाएं)
4 त्रिपक्षीय बातचीत एम-सीएफपी + एम-वाईएफपीएन: सी-वाईएफपीसी + p19
5 सकारात्मक नियंत्रण एम-सीएफपी + सी-वाईएफपी + पी 19
6 नकारात्मक नियंत्रण 1 एम-सीएफपी + खाली-वाईएफपी + p19
7 नकारात्मक नियंत्रण 2 खाली -CFP + सी-वाईएफपी + p19
8 नकारात्मक नियंत्रण 3 खाली -CFP + एम-वाईएफपी + p19

तालिका 2: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले संयोजनों का निर्माण करें।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल एक MADS-बॉक्स प्रोटीन और एक कैल्शियम सेंसर प्रोटीन के दो मोनोमर के बीच एक टर्नरी परिसर के गठन का पता लगाने के लिए BiFC आधारित FRET-FLIM परख के उपयोग को दर्शाता है । प्रोटोकॉल को वाई जॉन श्यो एट अल की एक रिपोर्ट से अनुकूलित किया गया है, जहां उन्होंने संवेदनशील उत्सर्जन विधि7का उपयोग करके फोस-जून हेट्रोडिमर्स और एनएफएटी या पी65 के बीच गठित टर्नरी कॉम्प्लेक्स की कल्पना करने के लिए एक BiFC-आधारित FRET विधि विकसित की है। इससे पहले, वर्ष 2004 29 में गैल्पेरिन और सहकर्मियों द्वारा तीन फ्लोरोफोर फ्रीट सिस्टम विकसित किया गया था, लेकिनइसकेलिए छह फिल्टर की आवश्यकता होती है जिसमें एक परिष्कृत माइक्रोस्कोप सेटअप होता है। इसके अलावा, छवि अधिग्रहण के दौरान एंडोसोम्स जैसे ऑर्गेनेल्स की तेजी से आवाजाही ने प्रयोगात्मक कठिनाइयों को लागू किया। दूसरी ओर, बीएफसी आधारित FRET-FLIM केवल दो फ्लोरोफोरस के लिए फिल्टर का उपयोग करता है और एक सरलीकृत माइक्रोस्कोप सेटअप है। यह सेटअप 3-FRET सिस्टम के विपरीत टर्नरी कॉम्प्लेक्स के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है। यह भी संवेदनशील उत्सर्जन7शामिल FRET माप की तुलना में अधिक मजबूत और मात्रात्मक होने में BiFC-FRET प्रणाली पर एक लाभ है । इस परख में, व्यक्तिगत फोटॉनों के फ्लोरेसेंस जीवन काल को दाता और स्वीकार्य अणुओं की सापेक्ष फ्लोरेसेंस तीव्रता में समग्र परिवर्तन के बजाय, FRET क्षमता की गणना के लिए मापा जाता है। BiFC-FRET विधि पर FLIM आधारित विधि का एक और लाभ यह है कि केवल दाता के जीवनकाल को मापा जाना चाहिए; स्वीकारकर्ता के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन के गुण FRET माप के परिणाम को प्रभावित नहीं करते हैं। इस विधि के फायदे और सादगी बीएफसी-आधारित FRET-FLIM को त्रिपक्षीय बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक आसान, अधिक सरल और अधिक मात्रात्मक विधि बनाती है। हालांकि, किसी को पल्स लेजर, एक फोटॉन गिनती में सक्षम फास्ट डिटेक्टरों और एक संगत सॉफ्टवेयर के साथ एक कॉन्फोकल सेटअप तक पहुंच की आवश्यकता होती है।

इस प्रयोग की सफलता के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि BiFC संरचना में उपयोग किए जाने वाले दो प्रोटीन भागीदारों के बीच बातचीत को FRET स्वीकारकर्ता के रूप में उपयोग करने से पहले कई तरीकों और उचित नियंत्रणों का उपयोग करके मान्य किया जाता है। नकारात्मक नियंत्रणों जैसे बातचीत करने वाले साथी का उत्परिवर्तित रूप या नकारात्मक बातचीत करने वाले साथी के रूप में असंबंधित कोलोकैलाइजिंग प्रोटीन का उपयोग करने की सलाह दी जातीहै। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एम और सी प्रोटीन के बीच बीएफसी इंटरैक्शन को मान्य करने के लिए नकारात्मक नियंत्रणों में इन प्रोटीनों के ख्यात बाध्यकारी डोमेन में उत्परिवर्तन शामिल थे, जिसने बीएफसी सिग्नल(अनुपूरक चित्रा 1)को पूरी तरह से समाप्त कर दिया। इसके अलावा, इस बातचीत को विभिन्न प्रणालियों में Y2H और FRET विधियों द्वारा भी मान्य किया गया था।

इसके अलावा, निकोटियाना में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लौकिक अनुकूलन की सिफारिश की जाती है ताकि प्रोटीन के अधिक प्रयोग के प्रतिकूल प्रभाव, जो झूठे-सकारात्मक परिणाम दे सकते हैं, को कम किया जा सके। पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन को मुंह से रोकने के लिए निर्माण युक्त एग्रोबैक्टीरियल उपभेदों के साथ पी19 तनाव को शामिल करना भी आवश्यक है। p19 टमाटर जंगली स्टंट वायरस से जीन मुंह का एक दमन है और 90%30तक परिवर्तन दक्षता को बढ़ाता है . हाल ही में, फ्लोरोफोरस के बेहतर संस्करण, अर्थात्, एम-फ़िरोज़ा-SYFP2, SYFP2-mRFP, और SCFP3a-SYFP2 विकसित किए गए हैं। इनका उपयोग लक्ष्य प्रणाली और सेल टाइप11के लिए उनकी उपयुक्तता के आधार पर FRET जोड़े के रूप में किया जा सकता है । FRET-FLIM माप सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डेटा प्राप्त करने के लिए कम से कम दस कोशिकाओं में किया जाना चाहिए। जहां भी संभव हो, माप में नमूनों की एक बड़ी संख्या जोड़ने से डेटा की गुणवत्ता और विश्वसनीयता में और सुधार होगा । दाता फ्लोरोफोर के आधार पर, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम क्षय वक्र के साथ डेटा को फिट करने के लिए गणितीय मॉडल चुना जाना चाहिए।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में त्रिपक्षीय बातचीत निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह बातचीत परिसर के इंट्रासेलुलर स्थान को निर्धारित करने में मदद करता है, जो किसी भी प्रोटीन परिसर के कार्य और शारीरिक महत्व को समझने में महत्वपूर्ण है। यह FRET-FLIM डेटा के आधार पर बातचीत करने वाले साथी की सापेक्ष सांद्रता को भी हल कर सकता है, जिसे अकेले तीव्रता माप विधियों द्वारा स्पष्ट नहीं किया जा सकता है10। निर्णायक रूप से, बीएफसी आधारित FRET-FLIM परख त्रिपक्षीय प्रोटीन इंटरैक्शन के महत्वपूर्ण पहलुओं का अध्ययन और विशेषता देने का अवसर प्रदान करता है, जिसका उपयोग पशु के साथ-साथ पौधों की प्रणालियों में किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

एनबी, जीजी, एसबी, केसी ने अपनी रिसर्च फेलोशिप के लिए यूनिवर्सिटी ग्रांट कमीशन (यूजीसी), यूजीसी-बीएसआर, डीबीटी-इंस्पायर और काउंसिल फॉर साइंटिफिक एंड इंडस्ट्रियल रिसर्च (सीएसआईआर) को ईमानदारी से धन्यवाद दिया । हम शुक्र है कि वित्तीय सहायता के लिए भारत सरकार के जैव प्रौद्योगिकी विभाग (डीबीटी), विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी विभाग (डीएसटी-मुट्ठी), भारत सरकार को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml Syringes without needles Dispovan  -
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
Gateway  LR Clonase II Enzyme mix Thermo Fischer Scientific 11791020 The vectors used in the study are Gateway based
Gentamycin Sulphate Himedia CMS461
Kanamycin Sulphate Himedia MB105
MES hydrate Sigma-Aldrich M2933
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Thermo Fischer Scientific K240020 The vectors used in the study are Gateway based
Phusion high fidelity Taq DNA polymerase Thermo Fischer Scientific F530-S Any High fidelity Polymerase can work
Rifampicin Himedia CMS1889
SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope Leica SP8 FALCON Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Himedia TC034

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References

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Boora, N., Verma, V., Khurana, R., Gawande, G., Bhimrajka, S., Chaprana, K., Kapoor, M., Kapoor, S. Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay. J. Vis. Exp. (178), e62791, doi:10.3791/62791 (2021).

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