Summary
Her presenterer vi en metode for å visualisere ternær kompleks formasjon mellom tre proteinpartnere ved hjelp av fluorescerende merkede proteiner av BiFC-basert FRET-FLIM-analyse. Denne metoden er verdifull for å studere proteinproteininteraksjonskomplekser in vivo.
Abstract
Proteinproteininteraksjoner er en integrert del av alle biologiske prosesser i cellene, da de spiller en avgjørende rolle i å regulere, vedlikeholde og endre cellulære funksjoner. Disse interaksjonene er involvert i et bredt spekter av fenomener som signaltransduksjon, patogenrespons, cellecelleinteraksjoner, metabolske og utviklingsmessige prosesser. Når det gjelder transkripsjonsfaktorer, kan disse interaksjonene føre til oligomerisering av underenheter, sequestering i spesifikke subcellulære sammenhenger som kjernen, cytoplasma, etc., som igjen kan ha en dypere effekt på uttrykket av nedstrømsgenene. Her demonstrerer vi en metodikk for å visualisere in vivo treparts interaksjon ved hjelp av Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) basert Förster Resonance Energy Transfer (FRET) som involverer Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). To av proteinene som er valgt for denne demonstrasjonen samhandler som BiFC-partnere, og deres rekonstituerte fluorescensaktivitet brukes til å analyse FRET-FLIM med den tredje partneren. Fire til fem uker gamle vekstkammerdyrkede Nicotiana benthamiana-anlegg har blitt brukt som modellanleggssystem for denne demonstrasjonen.
Introduction
Proteinproteininteraksjoner (PPIer) danner grunnlaget for riktig funksjon av eukaryote celler ved å regulere ulike metabolske og utviklingsmessige prosesser. Noen PPIer er stabile, mens andre er forbigående i naturen. Interaksjonene kan kategoriseres basert på antall og type medlemmer i interaksjonen, for eksempel dimerisk, trimerisk, tetramerisk homomerisk og hetermerisk1. Identifisering og karakterisering av proteininteraksjoner kan føre til en bedre forståelse av proteinfunksjoner og regulatoriske nettverk.
Transkripsjonsfaktorer er proteiner som er involvert i regulatoriske funksjoner. De regulerer transkripsjonshastigheten av nedstrømsgenene sine ved å binde seg til DNA-et. Noen ganger er oligomerisering eller dannelse av høyere ordens komplekser av proteiner en forutsetning for å utføre sine funksjoner2. Plante MADS-boks transkripsjonsfaktorer er homøotiske gener som regulerer ulike prosesser som blomsterovergang, blomsterorganutvikling, befruktning, frøutvikling, senescence og vegetativ utvikling. De er kjent for å danne høyere ordenskomplekser som binder seg til DNA3,4. Å studere PPI-nettverk blant transkripsjonsfaktorer og deres interagere gir innsikt i kompleksiteten som ligger til grunn for transkripsjonsreguleringen.
Forbigående proteinuttrykk i Nikotiana benthamiana har vært en populær tilnærming for å studere proteinlokalisering eller proteinproteininteraksjoner i vivo5. BiFC og FRET er metoder for å studere proteinproteininteraksjoner in vivo ved hjelp av fluorescerende reportersystemer6. En kombinasjon av disse to teknikkene har vist seg å avsløre samspillet mellom tre proteiner7. FRET måles ved hjelp av akseptabel fotobleaching, sensibilisert utslipp og Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM)-teknikk. FLIM-basert FRET-analyse har dukket opp som et verktøy som gir nøyaktig kvantifisering og romlig spesifisitet til energioverføringsmålinger mellom to molekyler basert på deres fluorescenslevetid8. FLIM måler tiden en fluorofor forblir i en spent tilstand før den avgir en foton og er bedre enn teknikker som bruker intensitetsmålinger alene9,10. Foruten heteroologe systemer som Nicotiana benthamiana og løk epidermal peeling, nyere rapporter har vist bruk av Arabidopsis røtter og unge risplanter, etc., for in vivo analyse av protein-protein interaksjoner under innfødte forhold11,12.
Bortsett fra et egnet uttrykkssystem, er valg av interagerende partnere for BiFC- og FRET-analyser også avgjørende for suksessen til dette eksperimentet. PPI blant partnere som brukes i BiFC-konfigurasjon, bør valideres ved hjelp av passende kontroller før bruk som en konjugert partner i FRET-eksperimentet13. BiFC benytter strukturell komplementering av N- og C-terminaldeler av fluorescerende protein. En vanlig begrensning i de fleste, om ikke alle fluorescerende proteiner som brukes i BiFC-analyser, har vært selvmonteringen mellom de to avledede ikke-fluorescerende fragmentene, noe som bidrar til falsk-positiv fluorescens og reduserer signal-til-støy (S / N) forholdet14. Nylige utviklinger, inkludert punktmutasjoner eller posisjon for å dele det fluorescerende proteinet, har gitt opphav til BiFC-par med økt intensitet, høyere spesifisitet, høyt S / N-forhold15,16. Disse fluorescerende proteinene kan også brukes til å utføre BiFC avhengig av eksperimentets egnethet.
Tradisjonelt har CFP og YFP blitt brukt som donor og akseptorpar i FRET-eksperimenter17. Imidlertid ble YFP eller m-Citrine funnet å være bedre FRET-givere (når de brukes med RFP som akseptor) på grunn av det høye kvanteutbyttet (QY) under det opprinnelige uttrykket av målproteiner i Arabidopsis rotsystem. Utvalget av promotører (konstituerende versus innfødt/ endogen) og fluorofor spiller også en avgjørende rolle i utformingen av et vellykket BiFC-FRET-FLIM-eksperiment. Det er viktig å merke seg at effektiviteten til FRET-givere og egnethet av FRET-par har en tendens til å endres med endringen i promotoren og det biologiske systemet som brukes til uttrykk. Fluoroforens QY, som er relatert til lysstyrken, avhenger av pH, temperatur og det biologiske systemet som er i bruk. Vi foreslår at disse kriteriene vurderes grundig før du velger fluoroforparet til FRET-eksperimentet. Det biologiske systemet, promotorene og proteinene som brukes til denne protokollen fungerte bra med CFP-YFP fluoroforer for BiFC FRET-FLIM-eksperimentet.
I den nåværende studien inkorporerer vi funksjonen til FLIM for å visualisere samspillet mellom tre proteinmolekyler ved hjelp av BiFC-basert FRET. I denne teknikken er to proteiner merket med delt YFP-protein og det tredje proteinet med CFP. Siden vi var interessert i å studere samspillet mellom et MADS-boksprotein (M) homodimer med et kalsiumsensorprotein (C), ble disse proteinene merket med fluorescerende proteiner i pSITE-1CA og pSITE-3CA vektorer18. To av de interagerende partnerne, i denne analysen, ble merket med N- og C-terminaldeler av YFP i pSPYNE-35S- og pSPYCE-35S-vektorene19, og deres interaksjon resulterer i rekonstituering av den funksjonelle YFP som fungerer som en FRET-akseptor til den tredje samhandlende partneren, som er merket med CFP (fungerer som FRET-donor) (Figur 1 ). I dette spesielle tilfellet har PPI mellom to M-monomerer og mellom M og C blitt validert ved å utføre BiFC i tre forskjellige systemer sammen med gjær-to-hybrid-systemet. Disse vektorene ble mobilisert til Agrobacterium tumifaciens GV3101 stamme ved elektroporasjon. GV3101-stammen har en avvæpnet Ti plasmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) med gentamicinresistens20. En p19 Agrobacterium stamme ble tilsatt sammen med alle infiltrasjoner for å forhindre transgene silencing21. Vi anbefaler at de tre proteinene også brukes i motsatte konformasjoner for å validere trepartsinteraksjonene.
I denne teknikken har vi ansatt FLIM, hvor først donorens fluorescenslevetid (uuttalt donorlevetid) måles i fravær av en akseptor. Deretter måles levetiden i nærvær av akseptoren (slukket donorlevetid). Denne forskjellen i donorfluorescenslevetid brukes til å beregne FRET-effektivitet, som avhenger av antall fotoner som viser en reduksjon i fluorescenslevetiden. Nedenfor er en detaljert protokoll for å bestemme dannelsen av et ternært kompleks mellom tre proteiner ved å transient uttrykke fluorescerende merkede proteiner i Nikotiana benthamiana og analyse av deres interaksjon av BiFC-FRET-FLIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning av gener i inngangs- og destinasjonsvektorer (Figur 2)
- Forsterke kodesekvensen (CDS) av genene av interesse (M- og C-gener i vårt tilfelle) av PCR og klone dem i passende inngangsvektorer (f.eks. pENTR / D-TOPO vektor; se tabell 1 for vektorer som brukes i dette eksperimentet).
- Vokse klonene på plater som inneholder antibiotika. Valider kloner som er valgt på antibiotika ved begrensning fordøyelse og DNA sekvensering22,23.
- Mobiliser de rekonstituerte CDS-ene fra inngangskloner til destinasjonsvektorene (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA og pSITE-3CA) og bekreft overføringen av sekvenser fra oppføringen til destinasjonsvektorene ved begrensning av enzymfordøyelse.
MERK: Alle vektorer som brukes i dette eksperimentet, er oppført i tabell 1. - Til slutt transformerer du Agrobacterium GV3101 (pMP90 (Gent R)))-celler med destinasjonsvektorene ved elektroporasjon (figur 3)24.
2. Vekstforhold for Nicotiana benthamiana planter
MERK: Dyrk Nikotiana planter til 4-6 bladtrinn under kontrollforhold.
- For å dyrke Nicotiana planter, lag jordblandingen ved å blande kommersielt tilgjengelige jordblandinger med kokos og kompost i forholdet 2:1:1.
- Spred et 1-tommers tykt lag av denne jordblandingen i en plastbrett for å gjøre jordsengen og mette den med deionisert vann. Dryss ca 200 frø i denne jordsengen.
- Overfør den til et større brett som inneholder 1 cm stående vann. Dekk denne skuffen med plastfolie for å skape et fuktighetskammer.
- Overfør dette settet opp til et vekstkammer satt til 23 °C med 16 timers lys og 8 timers mørk syklus med 150-170 μmol/m2s lysintensitet.
- Etter to uker, overfør unge frøplanter til små, 3-4-tommers potter som inneholder vannmettet jordblanding.
- Legg disse pottene i plastbrett og overfør dem til vekstkammeret i fire uker til.
3. Forbered bakteriestammer for agroinfiltrasjon
MERK: For agroinfiltrasjon må bakteriestammer subkultureres og blandes ferskt sammen med p19-stammen av Agrobacterium i passende forhold.
- Forbered 2xYT agarplater som inneholder rifampicin (100 μg/ml), gentamicin (25 μg/ml) og kanamycin (50 μg/ml) for Agrobacterium som huser pSPYNE-35S og pSPYCE-35S vektor. For pSITE-vektor som inneholder stamme, bruk rifampicin (100 μg/ml), gentamicin (25 μg/ml) og spectinomycin (50 μg/ml).
- Strekk Agrobacteriumstammene som inneholder plasmidene på disse platene ved hjelp av sterile inokulasjonsløkker i en laminær strømningshette.
- Inkuber disse ved 28 °C i 48 timer i mørket.
- Start denne prosedyren ved å inokulere Agrobacterium GV3101-stammen som huser BiFC- og FRET-konstruksjoner (fremstilt i pSPYNE-35S, pSPYCE-35S- og pSITE-vektorer) fra stripete plater i 10 ml 2xYT-buljong som inneholder passende antibiotika (Rifampicin (100 μg/ml), gentamicin (25 μg/ml), kanamycin (50 μg/ml) eller spectinomycin (50 μg/ml)).
- I tillegg initiere en kultur av p19 stamme av Agrobacteria ved å inokulere 10 ml 2xYT buljong som inneholder rifampicin (100 μg/ml) og kanamycin (50 μg/ml).
MERK: p19-stammen tilsetts for å forhindre transgenemper. - Dekk kolben med en aluminiumsfolie og hold dem i inkubator shaker satt til 28 °C og 170 o/min i 16 timer i mørket.
- Etter nattveksten overfører du 1 ml av denne kulturen til en engangs cuvette for å måle den optiske tettheten (O.D.) til kulturene ved 600 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
- Bland kulturene til passende BiFC- og FRET-partner som inneholder stammer, slik at den endelige O.D. av hver kultur er 0,5 og p19 er 0,3 i et totalt volum på 2 ml.
- For å oppnå disse forholdene, bruk formelen nevnt nedenfor:
ODoppnådd = O.D. av kulturen målt til 600 nm
V-kultur = Volumet av kulturen som kreves
OD-slutt = 0,5 for konstruksjoner og 0,3 for p19
V-finalen = Endelig volum for infiltrasjonen, som er 2 ml
MERK: Konstruksjonskombinasjonene som brukes i denne studien er spesifisert i tabell 2. - Sentrifuger de blandede Agrobacterium-kulturene på 3000 x g i 5 minutter ved romtemperatur og kast forsiktig supernatanten. Resuspend pellet i 2 ml nytilberedt infiltrasjonsbuffer (10 mM MES, 100 μM acetosyringon og 10 mM MgCl2). Bruk en virvelblander til å lage en homogen celleoppheng.
- Inkuber rørene som inneholder resuspenderte celler i mørket ved romtemperatur i 3 timer.
- I mellomtiden merker du hver plantepotte med konstruksjonsblandingen den kommer til å bli infiltrert med. Bruk to planter for hver infiltrasjonsblanding.
- Fyll en 1 ml nål sprøyte med agrobakteriell blanding. Trykk sprøyten forsiktig, men fast på abaxialsiden av det fullt utvidede bladet mens du støtter bladet fra den andre siden. Skyv stempelet forsiktig til oppløsningene fylles opp i bladområdet tilsvarende 2-3 ganger sprøytespissen.
- Infiltrer opptil fire flekker på et blad og 3-4 blader per plante, som vist i figur 4.
MERK: Skift hansker eller tørk hansker med 70 % alkohol mellom prøvene for å unngå krysskontaminering. - Overfør alle grytene til et brett og inkuber i et vekstkammer under de samme forholdene som nevnt i trinn 2.
- Kontroller en liten del av det agroinfilterte bladet på forskjellige tidspunkter ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Når fluorescensen fra både YFP og CFP kan påvises i celler, går du videre til det konfiske mikroskopet for BiFC-FRET FLIM-analysen. I dette eksperimentet ble analysen utført 3 dager etter agroinfiltrasjon.
MERK: Still inn post-agroinfiltrasjonsperioden for inkubasjon individuelt for hver promotor og genkombinasjon for å unngå overekspressering av chimeriske proteiner som brukes i BiFC-FRET FLIM-analysen. Overekspressjonen av partnerproteinene kan føre til falske positive interaksjoner.
4. Forbered lysbilder for fluorescensvisualisering
- Når planter er klare for visualisering, kutt firkantede bladprøver, 5-8 mm fra infiltrasjonssåret, og monter dem i destillert vann på rene lysbilder.
MERK: For å minimere fluorescens i bakgrunnen, rengjør lysbildene med 80 % etanol etterfulgt av destillert vann 3-4 ganger, lufttørk dem og hold dem på et absorberende ark. - Dekk bladprøven med en ren deksleslip og tetning ved hjelp av en negleemalje.
- Visualiser disse prøvene under et konfokalt laserskanningsmikroskop.
5. FRET-FLIM-analyse ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop
MERK: I denne prosedyren er grunnlaget for å bestemme og kvantifisere interaksjon mellom to proteiner reduksjonen i fluorescenslevetiden til FRET-donorpartneren ved interaksjon med akseptoren, som brukes til å beregne effektiviteten til FRET. Kompleksiteten i tilfelle av trepartsinteraksjon øker ytterligere fordi FRET-akseptoren i dette tilfellet ikke er et enkelt molekyl, men et delt YFP-BiFC-par, som først skal bli rekonstituert in vivo for å bli en funksjonell FRET-akseptor fluorofor. For å utføre FRET-FLIM må man bestemme donormolekylets fluorescens levetid- først alene og deretter i nærvær av en FRET-partner.
- Åpne FLIM-applikasjonen i det kondolerende laserskanningsmikroskopet, start konsollen og bruk fotontelling med mønstergjenkjenning for å måle fluorescenslevetiden. Velg standard målemodus for 'All photon counting'.
- Analyser prøver fra to typer agro-infiltrerte planter: den ene med donor bare (C-CFP) og den andre med donoren og akseptoren (C-CFP, sammen med M-YFP) begge.
MERK: Fordi samspillet mellom M-protein allerede er validert med C-protein ved hjelp av BiFC og Y2H, forventes god FRET-effektivitet med dette interagerende paret. - Deretter skanner du det C-CFP agro-infiltrerte bladet og fokuserer på en celle som viser god CFP-fluorescens. Start laserskanningsmodus og still inn systemet for CFP-visualisering og FLIM-målinger (λex 440 nm pulslaser, λem 480-520 nm av hybriddetektorer, skannehastighet 512 x 512 piksler ved 400 Hz).
- Juster fokus, zoom og smart forsterkning for å fokusere på området som må fanges opp.
- Belys prøven med tilstrekkelig lasereffekt for å oppnå opptak av ca. 0,1 fotoner per puls. For prøver med variabel fluorescensintensitet, ta 50 bilder for å samle tilstrekkelige fotoner som kreves for levetidsmålingen. CFP viser to fluorescenslevetider på grunn av dens konformasjonstilpasning; Pass derfor på dataene ved hjelp av den n-eksponentielle rekonvolusjonsmodellen, samtidig som verdien på n er lik 2.
- Med disse innstillingene viser CFP to levetider på 1,0 og 3,2 ns. Her brukes den høyeste levetiden på 3,2 ns for alle etterfølgendeberegninger 25,26.
- For å beregne FRET-effektivitet ved hjelp av FLIM, som er målet på graden av interaksjon mellom to proteiner, ta en bladprøve som har blitt infiltrert med C-CFP og M-YFP. Se etter en celle som uttrykker både C-CFP og M-YFP og bekreft deres respektive utslippsmønstre ved å spennende dem ved hjelp av λex 440 nm pulslaser, λem 480-520 nm og λex 514 nm hvitt lys laser med λem 526-550 nm. Skann sekvensielt og identifiser en celle som viser både CFP- og YFP-fluorescens.
- Etter å ha bekreftet fluorescensen fra begge proteinene, bytt til FLIM-konsollen for å måle levetiden til CFP ved hjelp av de samme innstillingene som vi brukte tidligere for å måle levetiden til C-CFP (trinn 5.5).
MERK: Denne cellen uttrykker også M-YFP som potensielt kan samhandle med C-CFP og forårsake en reduksjon i levetiden til C-CFP. - Tilpass grafen som er oppnådd ved hjelp av den n-eksponentielle rekonvolusjonsmodellen, med n = 2. En reduksjon i CFP-levetiden fra 3,2 til 2,6 ns ble observert, noe som indikerer Förster-resonansenergioverføring mellom CFP og YFP (figur 5A).
- Start nå FRET-konsollen i programvaren og beregn FRET-effektiviteten ved å manuelt legge inn uuttalt donorlevetid i ligningen som er gitt i programvaren. Og den observerte FRET-effektiviteten er: 56%.
- Treparts interaksjon
- Til slutt, for å visualisere interaksjonene mellom tre partnere, ta bladprøven fra en plante som ble infiltrert med C-CFP, M-YFPn og M-YFPc.
- Skann bladets utvisning for en celle som viser både CFP og rekonstituert YFP-fluorescens som kommer fra BiFC-interaksjon mellom to M-proteiner. Bruk de samme laser- og utslippsbølgelengdene som ble brukt tidligere.
- Slå deretter av 514 nm-laseren og flytt til FLIM-konsollen.
MERK: Hvis M-YFP-dimmeren samhandler med C-CFP, bør man se en reduksjon i levetiden til C-CFP som observert under interaksjonen med M-YFP. Imidlertid, hvis C-CFP ikke klarer å samhandle med M-YFP-dimmeren, bør fluorescenslevetiden forbli på 3,2 ns. - Bruk lignende innstillinger som nevnt ovenfor, mål CFP-levetiden i nærvær av rekonstituert YFP. Tilpass grafen som er oppnådd ved hjelp av den n-eksponentielle rekonvolusjonsmodellen, med n = 2, og flytt til FRET-konsollen.
MERK: Det er en nedgang i CFP-levetiden fra 3,2 til 2,3 ns. Beregn FRET-effektiviteten som beskrevet ovenfor. Den beregnede FRET-effektiviteten er 55%. Reduksjonen i donorlevetid og god FRET-effektivitet på 55 % bekrefter trepartsinteraksjon mellom to M-proteiner og C-proteinet in vivo (se figur 5B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen representerer en optimalisert metode for å studere in vivo tripartit protein-protein interaksjoner i planter. Det grunnleggende prinsippet i protokollen er å kombinere to fluorescensmerkede proteininteraksjonsteknikker, det vil si BiFC og FRET, for å skape en analyse for å måle ternær kompleks formasjon mellom tre proteinpartnere. Her har vi brukt FLIM til å måle fluorescenslevetiden til FRET-giverpartneren i nærvær og fravær av FRET-akseptoren. En reduksjon i donorens fluorescenslevetid var forventet hvis det var en positiv interaksjon mellom de to proteinene. Vi begynte med å måle donorens fluorescenslevetid, det vil si C-CFP-proteinet. Vi har brukt målemodusen 'All photons counting', som skaper en fluorescensforfallskurve med alle fotonene i interesseområdet (ROI) og gir en målt levetid med en mindre feil enn den tradisjonelle tidskorrelerte enkeltfotontellingen. Høyhastighets FLIM-filteret sikrer bruk av enkeltfotonhendelser mellom pulsene. En passende matematisk modell ble deretter valgt for piksel-for-piksel-beregninger og montering av forfallskurven27.
CFP-varianten som brukes her (og er også den mest brukte) har konformasjonstilpasning, noe som resulterer i to fluorescenslevetider. Derfor valgte vi å passe til fluorescensforfallskurven ved hjelp av en modell for den multieksponentielle donoren. Dette resulterer i separasjon av de to levetidene til CFP, som i vårt tilfelle ble observert som 1,0 ns og 3,3 ns. For å beregne FRET-effektiviteten brukte vi den høyere CFP-levetiden, det vil si 3,3 ns (gjennomsnittlig fluorescenslevetid, n = 10).
Ved positiv kontroll (C-CFP og M-YFP) observerer vi en reduksjon i donorens fluorescenslevetid (C-CFP) fra 3,3 ns til 2,5 ns (figur 6). Og FRET-effektiviteten ved hjelp av følgende ligning var 56%.
E = FRET Effektivitet
τD = Unquenched donor Lifetime (kun donorprøve, C-CFP)
τ AvAmp = Gjennomsnittlig forfallstid - Amplitude vektet gjennomsnittlig levetid
En lignende øvelse med rekonstituert YFP som følge av samspillet mellom to M-monomerer og C-protein resulterte også i en positiv interaksjon som førte til reduksjon av fluorescenslevetiden til akseptoren (C-CFP) til 2,6 ns. Den beregnede FRET-effektiviteten var omtrent 55% i dette tilfellet (Figur 6).
Hvis en CFP-variant eller en annen donorfluofor har en enkelt fluorescenslevetid, må forfallskurven passe ved hjelp av den monoeksponentielle donormodellen. I så fall kan effektiviteten til FRET beregnes ved hjelp av formelen:
τ er fluorescenslevetiden for prøven som bare inneholder
τ slukkes i nærvær av akseptoren (mens FRET finner sted)
De rå fluorescenslevetidsavlesningene fra minst 10 celler for hvert eksperimentelt oppsett har blitt samlet som en scatter-tomt ved hjelp av PlotsOfData online verktøy (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, figur 6C)28. Reduksjonen i fluorescenslevetiden til FRET-donoren gir sterke bevis for en trepartsinteraksjon mellom disse tre proteinene.
Figur 1: Skjematisk representasjon av prinsippet om BiFC- og BiFC FRET-FLIM-metode. Interaksjon mellom to M-proteiner resulterer i rekonstituering av YFP, og dette paret kan da fungere som et akseptormolekyl. Det tredje proteinet C-CFP fungerer som en FRET-donor her. Dermed viser et positivt FRET-signal trepartsinteraksjon mellom to M-proteiner og ett C-protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kloning av M- og C-gener i endelige destinasjonsvektorer. Genenes kodesekvenser forsterkes og klones først i pENTR/D-TOPO-vektor etterfulgt av mobilisering av konstruksjonene i endelige destinasjonsvektorer pSITE-1CA, pSITE-3CA, pSPYNE-35S og pSPYCE-35S av LR Clonase II rekombinasjonsreaksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ved hjelp av elektroporasjon leveres de ønskede vektorkombinasjonene i GV3101-stammen av Agrobacterium tumefaciens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Diagrammatisk illustrasjon av agroinfiltrasjon av Nikotiana-planter og konstruksjonskombinasjonene som brukes til eksperimentet. (A) C-CFP som inneholder agrobakteriell kultur fungerer som donor bare prøve (B) C-CFP og M-YFP tjener som positiv FRET-kontroll, (C) C-CFP og M protein i BiFC-konformasjon; M-YFPn og M-YFPc brukes til å studere trepartsinteraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representasjon av fluorescenslevetiden for prøvene i fravær og tilstedeværelse av akseptoren. (A) Levetiden til C-CFP i nærvær av M-YFP reduseres til 2,67 ns som vist av stolpegrafen. Tilsvarende (B) viser reduksjonen i levetiden til C-CFP til 2,3 ns ved trepartsinteraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Trepartsinteraksjon mellom to M-monomerer og et C-protein analysert ved hjelp av BiFC-basert FRET-FLIM-analyse. (A) En celle som viser enten bare CFP (i) eller både CFP og YFP (ii og iii) som kommer fra donor- og akseptorproteiner ved hjelp av respektive eksitasjons- og utslippsbølgelengder. (B) i, ii, iii representerer FLIM-bilde som viser fluorescenslevetid for CFP i cellen. Fargeskalalinjen representerer pseudofargen som tilsvarer levetiden. Skalastang = 50 μm. (C) Scatter Plot som viser fluorescenslevetid for CFP når den er til stede alene eller med de interagerende partnerne der n = 10. Plottet genereres ved hjelp av det elektroniske verktøyet PlotsOfdata (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/); gjennomsnittlig fluorescenslevetid er representert som linjen mellom prøve prikkene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Negativt kontrolleksperiment for validering av interaksjon mellom protein M og C av BiFC. Interaksjon mellom mutert form for M Protein (MΔCBD), som mangler alle C protein binding regioner, og C protein-YFPc fusjon er forsøkt å tjene som en negativ kontroll for BiFC analyse. Øvre paneler viser forbigående uttrykk for MΔCBD-GFP i løkskallceller, og resultatene av forsøk på interaksjon mellom MΔCBD-YFPn og C-YFPc vises i de nedre panelene. Fraværet av fluorescens fra rekonstituert YFP indikerer mangelen på interaksjon mellom MΔCBD og C-protein. N, kjerne; C, cytoplasma; BF, lyst felt; FL, fluorescens; OL, digitalt overlegg, den cytoplasmatiske regionen vises ved hjelp av hvite piler. Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
| S.No. | Vektor | Antibiotisk seleksjon |
| Inngangsvektor | ||
| 1 | pENTR/D-TOPO | Kanamycin |
| Målvektorer | ||
| 2 | pSPYNE-35S | Kanamycin |
| 3 | pSPYCE-35S | Kanamycin |
| 4 | pSITE-1CA | Spectinomycin |
| 5 | pSITE-3CA | Spectinomycin |
Tabell 1: Vektorer som brukes i studien.
| S.No. | Interaksjon | Kombinasjon av konstruksjoner |
| 1 | Tredelt samhandling | C-CFP + M-YFPn:M-YFPc + p19 |
| 2 | Positiv kontroll | C-CFP + M-YFP + p19 |
| 3 | Negativ kontroll | C-CFP + Tom-YFP + p19 |
| Valgfritt (motsatte konformasjoner) | ||
| 4 | Tredelt samhandling | M-CFP + M-YFPn:C-YFPc + p19 |
| 5 | Positiv kontroll | M-CFP + C-YFP + p19 |
| 6 | Negativ kontroll 1 | M-CFP + Tom-YFP + p19 |
| 7 | Negativ kontroll 2 | Tom -CFP + C-YFP + p19 |
| 8 | Negativ kontroll 3 | Tom -CFP + M-YFP + p19 |
Tabell 2: Konstruere kombinasjoner som brukes i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen demonstrerer bruken av BiFC-basert FRET-FLIM-analyse for å fastslå dannelsen av et ternært kompleks mellom to monomerer av et MADS-boksprotein og et kalsiumsensorprotein. Protokollen er tilpasset fra en rapport fra Y. John Shyu et al. hvor de har utviklet en BiFC-basert FRET-metode for å visualisere ternærkompleks dannet mellom Fos-Jun heterodimers og NFAT eller p65 ved hjelp av den sensibiliserte utslippsmetoden7. Tidligere ble et tre-fluorophore FRET-system utviklet av Galperin og medarbeidere i år 200429, men det krever seks filtre som inneholder et sofistikert mikroskopoppsett. Også rask bevegelse av organeller, som endosomer, under bildeoppkjøp påla eksperimentelle vanskeligheter. På den annen side bruker BiFC-basert FRET-FLIM filtre for bare to fluoroforer og har et forenklet mikroskopoppsett. Dette oppsettet tillater direkte visualisering av det ternære komplekset, i motsetning til 3-FRET-systemet. Dette har også en fordel i forhold til BiFC-FRET-systemet i å være mer robust og kvantitativ enn FRET-målingene som involverer sensibilisert utslipp7. I denne analysen måles fluorescenslevetider for individuelle fotoner for beregning av FRET-effektiviteten, i stedet for generelle endringer i de relative fluorescensintensitetene til donor- og akseptormolekyler. En annen fordel med den FLIM-baserte metoden over BiFC-FRET-metoden er at bare donorens levetid må måles; egenskapene til fluorescensutslipp av akseptoren påvirker ikke utfallet av FRET-målingene. Fordelene og enkelheten ved denne metoden gjør BiFC-basert FRET-FLIM til en enklere, enklere og mer kvantitativ metode for å studere trepartsinteraksjoner. Imidlertid må man ha tilgang til et konfokalt oppsett med pulslasere, raske detektorer som er i stand til enkelt fotontelling og en kompatibel programvare.
For å lykkes med dette eksperimentet er det viktig at samspillet mellom de to proteinpartnerne som brukes i BiFC-konformasjon valideres ved hjelp av flere metoder og passende kontroller før du bruker dem som FRET-akseptor. Det anbefales å bruke negative kontroller som en mutert form for interagerende partner eller et ikke-relatert colokaliserende protein som en negativ interagerende partner16. De negative kontrollene for validering av BiFC-interaksjonene mellom M- og C-proteiner som brukes i denne protokollen inkluderte mutasjoner i det putative bindingsdomenet til disse proteinene, som fullstendig avskaffet BiFC-signalet (Tilleggsfigur 1). Videre ble denne interaksjonen også validert av Y2H- og FRET-metoder i forskjellige systemer.
Også temporal optimalisering av uttrykket av proteiner i Nikotiana anbefales slik at bivirkningene av overekspressering av proteiner, noe som kan føre til falske positive resultater, kan minimeres. Det er også nødvendig å inkludere p19-stammen sammen med de agrobakterielle stammene som inneholder konstruksjoner for å forhindre posttranskripsjonell genaktivering. p19 er en undertrykker av genaktivering fra tomat bushy stunt virus og forbedrer transformasjonseffektiviteten opptil 90%30. Nylig har bedre versjoner av fluoroforene, nemlig m-turkis-SYFP2, SYFP2-mRFP og SCFP3a-SYFP2 blitt utviklet. Disse kan brukes som FRET-par, avhengig av egnetheten til målsystemet og celletypen11. FRET-FLIM-målingene bør utføres i minst ti celler for å oppnå statistisk signifikante data. Der det er mulig, vil det å legge til et større antall prøver i målingene ytterligere forbedre kvaliteten og påliteligheten til dataene. Avhengig av donorfluofor, bør den matematiske modellen som passer til dataene med fluorescensens levetid forfallskurve velges.
Protokollen beskrevet her er et kraftig verktøy for å bestemme trepartsinteraksjonene i levende celler. Det bidrar til å bestemme den intracellulære plasseringen av det interagerende komplekset, noe som er viktig for å dechiffrere funksjonen og fysiologisk betydning av ethvert proteinkompleks. Det kan også løse den interagerende partnerens relative konsentrasjoner basert på FRET-FLIM-dataene, som ikke kan belyses av intensitetsmålingsmetoder alene10. Endelig gir BiFC-basert FRET-FLIM-analyse en mulighet til å studere og karakterisere viktige aspekter ved treparts proteininteraksjoner, som kan brukes i dyr så vel som plantesystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
NB, GG, SB, KC takker oppriktig University Grants Commission (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE og Council for Scientific and Industrial Research (CSIR) for sine stipendiatstillinger. Vi anerkjenner heldigvis Institutt for bioteknologi (DBT), Indias regjering, Institutt for vitenskap og teknologi (DST-FIST), Indias regjering for økonomisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
References
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
