Summary
Här presenterar vi, en metod för att visualisera ternary komplex bildning mellan tre proteinpartners med fluorescerande-märkta proteiner av BiFC-baserade FRET-FLIM analys. Denna metod är värdefull för att studera protein-protein interaktionskomplex in vivo.
Abstract
Protein-protein interaktioner är en integrerad del av alla biologiska processer i cellerna eftersom de spelar en avgörande roll för att reglera, underhålla och ändra cellulära funktioner. Dessa interaktioner är involverade i ett brett spektrum av fenomen som signaltransduktion, patogenrespons, cell-cellinteraktioner, metaboliska och utvecklingsmässiga processer. När det gäller transkriptionsfaktorer kan dessa interaktioner leda till oligomerisering av underenheter, bindning i specifika subcellulära sammanhang som kärnan, cytoplasma etc., vilket i sin tur kan ha en mer djupgående effekt på uttrycket av de nedströms generna. Här demonstrerar vi en metodik för att visualisera in vivo trepartsinteraktion med bimolekulär fluorescenskompletering (BiFC) baserad Förster Resonance Energy Transfer (FRET) som involverar Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Två av de proteiner som valts ut för denna demonstration samverkar som BiFC-partners, och deras rekonstituerade fluorescensaktivitet används för att analysera FRET-FLIM med den tredje partnern. Fyra till fem veckor gamla tillväxtkammare odlade Nicotiana benthamiana växter har använts som modell växtsystem för denna demonstration.
Introduction
Protein-proteininteraktioner (PPIs) utgör grunden för att eukaryota celler fungerar korrekt genom att reglera olika metaboliska och utvecklingsmässiga processer. Vissa protonpumpshämmare är stabila, medan andra är övergående till sin natur. Interaktionerna kan kategoriseras baserat på antalet och typen av medlemmar i interaktionen, till exempel dimeriska, trimeriska, tetrameriska homomeriska och heteromeriska1. Identifiering och karakterisering av proteininteraktioner kan leda till en bättre förståelse av proteinfunktioner och regulatoriska nätverk.
Transkriptionsfaktorer är proteiner som är involverade i regulatoriska funktioner. De reglerar transkriptionen av deras nedströmsgener genom att binda till DNA. Ibland oligomerisering eller bildning av högre ordningskomplex av proteiner är en förutsättning för att utföra sina funktioner2. Växt MADS-box transkriptionsfaktorer är homeotiska gener som reglerar olika processer som blomövergång, blommig organutveckling, befruktning, fröutveckling, senescens och vegetativ utveckling. De är kända för att bilda högre ordningens komplex som binder till DNA3,4. Att studera PPI-nätverk bland transkriptionsfaktorer och deras interactorer ger insikter om komplexiteten bakom transkriptionsreglering.
Övergående proteinuttryck i Nicotiana benthamiana har varit ett populärt tillvägagångssätt för att studera proteinlokalisering eller protein-proteininteraktioner in vivo5. BiFC och FRET är metoder för att studera protein-protein interaktioner in vivo med fluorescerande reportersystem6. En kombination av dessa två tekniker har visat sig avslöja interaktionen mellan tre proteiner7. FRET mäts med hjälp av acceptor photobleaching, sensibiliserad emission och Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) teknik. FLIM-baserad FRET-analys har dykt upp som ett verktyg som ger exakt kvantifiering och spatiotemporal specificitet till energiöverföringsmätningar mellan två molekyler baserat på deras fluorescenslivslängd8. FLIM mäter den tid då en fluorofor stannar i ett upphetsad tillstånd innan den avger en foton och är bättre än tekniker som använder intensitetsmätningar ensam9,10. Förutom heterologa system som Nicotiana benthamiana och lök epidermal peeling, nyare rapporter har visat användningen av Arabidopsis rötter och unga risplantor, etc., för in vivo analys av protein-protein interaktioner under inhemska förhållanden11,12.
Förutom ett lämpligt uttryckssystem är valet av samverkande partner för BiFC- och FRET-analyser också avgörande för att detta experiment ska lyckas. PPI bland partner som används i BiFC-konfigurationen bör valideras med lämpliga kontroller innan de används som konjugerad partner i FRET-experimentet13. BiFC använder den strukturella komplementeringen av N- och C-terminaldelar av det fluorescerande proteinet. En vanlig begränsning i de flesta om inte alla fluorescerande proteiner som används i BiFC-analyser har varit självmonteringen mellan de två derivata ickefluorescensfragmenten, vilket bidrar till falskt positiv fluorescens och minskar förhållandet mellan signal och brus (S/N)14. Den senaste utvecklingen, inklusive punktmutationer eller position för att dela upp det fluorescerande proteinet, har gett upphov till BiFC-par med ökad intensitet, högre specificitet, högt S/N-förhållande15,16. Dessa fluorescerande proteiner kan också användas för att utföra BiFC beroende på experimentets lämplighet.
Traditionellt har den gemensamma fiskeripolitiken och YFP använts som donatorpar och acceptorpar i FRET-experiment17. YFP eller m-Citrine befanns dock vara bättre FRET-givare (när de används med RFP som acceptor) på grund av det höga kvantutbytet (QY) under det inhemska uttrycket av målproteiner i Arabidopsis rotsystem. Valet av promotorer (konstituerande kontra infödda/endogena) och fluorofor spelar också en avgörande roll vid utformningen av ett framgångsrikt BiFC-FRET-FLIM-experiment. Det är viktigt att notera att fret-donatorernas effektivitet och fret-parens lämplighet tenderar att förändras i och med förändringen i promotorn och det biologiska system som används för uttryck. Fluoroforens QY, som relaterar till dess ljusstyrka, beror på pH, temperatur och det biologiska system som används. Vi föreslår att dessa kriterier noggrant övervägs innan du väljer fluorophore paret för FRET experiment. Det biologiska systemet, promotorerna och de proteiner som används för detta protokoll fungerade bra med CFP-YFP fluorophores för BiFC FRET-FLIM-experimentet.
I den aktuella studien införlivar vi funktionen hos FLIM för att visualisera interaktionen mellan tre proteinmolekyler med BiFC-baserad FRET. I denna teknik är två proteiner taggade med delat YFP-protein och det tredje proteinet med CFP. Eftersom vi var intresserade av att studera interaktionen mellan en MADS-box protein (M) homodimer med ett kalciumsensorprotein (C), var dessa proteiner taggade med fluorescerande proteiner i pSITE-1CA och pSITE-3CA vektorer18. Två av de samverkande partnerna, i denna analys, taggades med N- och C-terminaldelar av YFP i pSPYNE-35S och pSPYCE-35S vektorer19,och deras interaktion resulterar i rekonstitution av den funktionella YFP som fungerar som fret-acceptor till den tredje samverkande partnern, som är märkt med CFP (fungerar som FRET-givare) (figur 1 ). I detta särskilda fall har PPI mellan två M-monomerer och mellan M och C validerats genom att bifc utförs i tre olika system tillsammans med jäst-två-hybridsystemet. Dessa vektorer mobiliserades till Agrobacterium tumifaciens GV3101 stam genom elektroporation. GV3101-stammen har en avväpnad Ti plasmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) med gentamicinresistens20. En p19 Agrobacterium stam tillsattes tillsammans med alla infiltrationer för att förhindra transgene ljuddämpning21. Vi rekommenderar att de tre proteinerna också används i motsatta konformationer för att validera trepartsinteraktionerna.
I denna teknik har vi använt FLIM, där först givarens fluorescenslivslängd (unquenched donor lifetime) mäts i avsaknad av en acceptor. Därefter mäts dess livslängd i närvaro av acceptorn (släckt donatorlivslängd). Denna skillnad i donatorfluorescenslivslängder används för att beräkna FRET-effektiviteten, vilket beror på antalet fotoner som uppvisar en minskning av fluorescenslivslängden. Nedan nämns ett detaljerat protokoll för att bestämma bildandet av ett ternary komplex mellan tre proteiner genom att tillfälligt uttrycka fluorescerande-taggade proteiner i Nicotiana benthamiana och analysera deras interaktion av BiFC-FRET-FLIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning av gener i inmatnings- och destinationsvektorer (figur2)
- Förstärka kodningssekvensen (CDS) av de gener av intresse (M- och C-gener i vårt fall) med PCR och klona dem i lämpliga inmatningsvektorer (t.ex. pENTR/D-TOPO vektor; Se tabell 1 för vektorer som används i det här experimentet).
- Odla klonerna på tallrikar som innehåller antibiotika. Validera kloner som väljs på antibiotika genom att begränsa matsmältningen ochDNA-sekvenseringen 22,23.
- Mobilisera de rekonstituerade CDS:erna från inmatningskloner till destinationsvektorerna (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA och pSITE-3CA) och bekräfta överföringen av sekvenser från ingången till destinationsvektorerna genom begränsning av enzymrötning.
Alla vektorer som används i det här experimentet visas i tabell 1. - Slutligen omvandlar du Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR))celler med destinationsvektorerna genom elektroporation (figur 3)24.
2. Tillväxtförhållanden för Nicotiana benthamiana växter
OBS: Odla Nicotiana växter till 4-6 blad steg i kontrollförhållanden.
- För att odla Nicotiana växter, förbered jordblandningen genom att blanda kommersiellt tillgängliga jordblandningar med kokong och kompost i ett förhållande av 2:1:1.
- Sprid ett 1-tums tjockt lager av denna jordblandning i en plastbricka för att göra jordbädden och mätta den med avjoniserat vatten. Strö ca 200 frön i denna jordbädd.
- Överför den till en större bricka som innehåller 1 cm stående vatten. Täck denna bricka med plastfolie för att skapa en fuktkammare.
- Överför denna uppsättning till en tillväxtkammare inställd på 23 °C med 16 h ljus och 8 h mörk cykel med 150-170 μmol/m2s ljusintensitet.
- Efter två veckor överför unga plantor till små, 3-4-tums krukor som innehåller vattenmättad jordblandning.
- Placera dessa krukor i plastbrickor och överför dem till tillväxtkammaren i fyra veckor till.
3. Förbered bakteriestammar för agroinfiltration
OBS: För agroinfiltration måste bakteriestammar vara nysubkulturerade och blandade tillsammans med p19 stam av Agrobacterium i lämpliga förhållanden.
- Förbered 2xYT agarplattor innehållande rifampicin (100 μg/mL), gentamicin (25 μg/mL) och kanamycin (50 μg/mL) för Agrobacterium som hyser pSPYNE-35S och pSPYCE-35S vektor. För pSITE-vektor som innehåller stam, använd rifampicin (100 μg/mL), gentamicin (25 μg/mL) och spectinomycin (50 μg/mL).
- Strimla Agrobacterium-stammarna som innehåller plasmiderna på dessa plattor med sterila inokuleringsöglor i en laminär flödeshuv.
- Inkubera dessa vid 28 °C i 48 timmar i mörker.
- Starta denna procedur genom att inokurera Agrobacterium GV3101 stam som hyser BiFC- och FRET-konstruktioner (beredda i pSPYNE-35S, pSPYCE-35S och pSITE-vektorer) från streckade plattor i 10 ml 2xYT-buljong som innehåller lämplig antibiotika (Rifampicin (100 μg/mL), gentamicin (25 μg/mL).
- Dessutom initiera en odling av p19 stam av Agrobacteria genom att inokurera 10 ml 2xYT buljong innehållande rifampicin (100 μg/mL) och kanamycin (50 μg/mL).
OBS: p19 stam tillsätts för att förhindra transgene ljuddämpning. - Täck kolven med en aluminiumfolie och håll dem i inkubatorskakapparaten inställd på 28 °C och 170 rpm i 16 timmar i mörker.
- Efter den över natten tillväxten, överför 1 mL av denna kultur till en engångs cuvette för att mäta den optiska densiteten (O.D.) av kulturerna vid 600 nm med hjälp av en spektrofotometer.
- Blanda kulturerna hos lämplig BiFC- och FRET-partner som innehåller stammar så att den slutliga O.D. för varje kultur är 0,5 och p19 är 0,3 i en total volym på 2 ml.
- För att uppnå dessa nyckeltal använder du formeln som nämns nedan:
ODerhållen = O.D. av kulturen uppmätt vid 600 nm
Vkultur = Volym av den kultur som krävs
OD-final = 0,5 för konstruktioner och 0,3 för p19
Vfinal = Slutlig volym för infiltrationen, som är 2 ml
OBS: De konstruktionskombinationer som används i denna studie anges i tabell 2. - Centrifugera de blandade agrobakteriekulturerna vid 3 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och kassera försiktigt supernatanten. Återanvänd pelleten i 2 ml nyberedd infiltrationsbuffert (10 mM MES, 100 μM Acetosyringone och 10 mM MgCl2). Använd en virvelblandare för att göra en homogen cellfjädring.
- Inkubera rören som innehåller omsuspenderade celler i mörkret vid rumstemperatur i 3 timmar.
- Under tiden, märka varje växtkruka med konstruktionsblandningen som den kommer att infiltreras med. Använd två växter för varje infiltrationsblandning.
- Fyll en 1 ml nållös spruta med den agrobakteriella blandningen. Tryck försiktigt men bestämt sprutan på den abaxiala sidan av det helt expanderade bladet samtidigt som du stöder bladet från andra sidan. Tryck försiktigt kolven tills lösningarna fylls i bladområdet motsvarande 2-3 gånger sprutans spets.
- Infiltrera upp till fyra fläckar på ett blad och 3-4 blad per växt, som visas i figur 4.
OBS: Byt handskar eller torka av handskar med 70% alkohol mellan proverna för att förhindra korskontaminering. - Överför alla krukor till en bricka och inkubera i en tillväxtkammare under samma förhållanden som nämns i steg 2.
- Kontrollera en liten del av det agroinfiltrerade bladet vid olika tidpunkter med hjälp av ett fluorescensmikroskop. När fluorescensen från både YFP och CFP kan detekteras i celler, fortsätt till det konfokala mikroskopet för BiFC-FRET FLIM-analys. I detta experiment utfördes analysen 3 dagar efter agro-infiltration.
OBS: Ställ in inkubationstiden efter agroinfiltration individuellt för varje promotor och genkombination för att undvika överuttryck av chimerproteiner som används i BiFC-FRET FLIM-analysen. Överuttryck av partnerproteinerna kan leda till falskt positiva interaktioner.
4. Förbered bilder för fluorescensvisualisering
- När växter är redo för visualisering, skär fyrkantiga bladprover, 5-8 mm från infiltrationssåret, och montera dem i destillerat vatten på rena bilder.
OBS: För att minimera bakgrundfluorescens, rengör bilderna med 80% etanol följt av destillerat vatten 3-4 gånger, lufttorka dem och håll dem på ett absorberande ark. - Täck bladprovet med ett rent täckslip och försegla med en nagelemalj.
- Visualisera dessa prover under ett konfokal laserskanningsmikroskop.
5. FRET-FLIM-analys med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop
OBS: I detta förfarande är grunden för att bestämma och kvantifiera interaktionen mellan två proteiner minskningen av FRET-donatorpartnerns fluorescenslivslängd vid dess interaktion med acceptorn, som används för att beräkna effektiviteten hos FRET. Komplexiteten i fallet med trepartsinteraktion ökar ytterligare eftersom FRET-acceptor, i detta fall, inte är en enda molekyl utan ett delat YFP-BiFC-par, som först bör rekonstitueras in vivo för att bli en funktionell FRET-acceptor fluorofor. För att utföra FRET-FLIM måste man bestämma donatormolekylens fluorescenslivsliv först och sedan i närvaro av en FRET-partner.
- Öppna FLIM-applikationen i det konfokala laserskanningsmikroskopet, starta konsolen och använd fotoräkning av mönsterigenkänning för att mäta fluorescenslivslängden. Välj standardmåttläget "All fotonräkning".
- Analysera prover från två typer av agroinfiltrerade växter: en med endast givaren (CFP) och den andra med givaren och acceptorn (C-CFP, tillsammans med M-YFP) båda.
OBS: Eftersom interaktionen mellan M-protein redan har validerats med C-protein med BiFC och Y2H, förväntas god FRET-effektivitet med detta interagerande par. - Skanna sedan den C-CFP agro-infiltrerade bladet och fokusera på en cell som visar god CFP fluorescens. Initiera laserskanningsläget och ställ in systemet för CFP-visualisering och FLIM-mätningar (λex 440 nm pulslaser, λem 480-520 nm med hybriddetektorer, Skanningshastighet 512 x 512 pixlar vid 400 Hz).
- Justera fokus, zoom och smart förstärkning för att fokusera på det område som behöver fångas.
- Belys provet med tillräcklig lasereffekt för att uppnå fångst av cirka 0,1 fotoner per puls. För prover med varierande fluorescensintensitet, fånga 50 ramar för att samla in lämpliga fotoner som krävs för livstidsmätningen. Den gemensamma fiskeripolitiken uppvisar två fluorescenslivslängder på grund av dess konformationella anpassning. Anpassa därför data med hjälp av den n-exponentiella rekonvolutionsmodellen samtidigt som värdet på n är lika med 2.
- Vid dessa inställningar visar den gemensamma fiskeripolitiken två livstider på 1,0 och 3,2 ns. Här används den högre, 3,2 ns, livslängden för alla efterföljande beräkningar25,26.
- För att beräkna FRET-effektiviteten med HJÄLP AV FLIM, som är måttet på graden av interaktion mellan två proteiner, ta ett bladprov som har saminfiltrerats med C-CFP och M-YFP. Leta efter en cell som uttrycker både C-CFP och M-YFP och bekräfta deras respektive emissionsmönster genom att spännande dem med λex 440 nm pulslaser, λem 480-520 nm och λex 514 nm vit ljuslaser med λem 526-550 nm. Sequentially skanna och identifiera en cell som visar både CFP och YFP fluorescens.
- Efter att ha bekräftat fluorescensen från båda proteinerna, byt till FLIM-konsolen för att mäta livslängden för CFP med samma inställningar som vi använde tidigare för att mäta livslängden för C-CFP (steg 5.5).
OBS: Denna cell uttrycker också M-YFP som potentiellt kan interagera med C-CFP och orsaka en minskning av livslängden för C-CFP. - Passa diagrammet som erhålls med hjälp av den n-exponentiella rekonvolutionsmodellen, med n = 2. En minskning av den gemensamma fiskeripolitikens livslängd från 3,2 till 2,6 ns observerades, vilket indikerar försterresonansenergiöverföring mellan den gemensamma fiskeripolitiken och YFP (figur 5A).
- Starta nu FRET-konsolen i programvaran och beräkna FRET-effektiviteten genom att manuellt ange den osläckade donatorlivslängden i ekvationen som tillhandahålls i programvaran. Och den observerade FRET-effektiviteten är: 56%.
- Trepartsinteraktion
- Slutligen, för att visualisera interaktionerna mellan tre partners, ta bladprovet från en växt som var saminfiltrerad med C-CFP, M-YFPn och M-YFPc.
- Skanna bladexplanten efter en cell som visar både CFP och rekonstituerad YFP-fluorescens som härrör från BiFC-interaktion mellan två M-proteiner. Använd samma laser- och emissionsvåglängder som tidigare.
- Stäng sedan av 514 nm-lasern och flytta till FLIM-konsolen.
OBS: Om M-YFP-dimern interagerar med den gemensamma fiskeripolitiken bör man se en minskning av den gemensamma fiskeripolitikens livslängd, vilket observeras under dess interaktion med M-YFP. Om den gemensamma fiskeripolitiken inte interagerar med M-YFP-dimern bör dess fluorescenslivslängd dock ligga kvar på 3,2 n. - Använd liknande inställningar som nämnts ovan och mät den gemensamma fiskeripolitikens livslängd i närvaro av rekonstituerad YFP. Montera diagrammet som erhålls med hjälp av den n-exponentiella rekonvolutionsmodellen, med n = 2, och flytta till FRET-konsolen.
OBS: Den gemensamma fiskeripolitikens livslängd minskar från 3,2 till 2,3 n. Beräkna FRET-effektiviteten enligt beskrivningen ovan. Den beräknade FRET-effektiviteten är 55%. Minskningen av donatorns livslängd och god FRET-effektivitet på 55 % bekräftar trepartsinteraktion mellan två M-proteiner och C-proteinet in vivo (se figur 5B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll representerar en optimerad metod för att studera in vivo trepartsprotein-protein interaktioner i växter. Grundprincipen i protokollet är att kombinera två fluorescensmärkta proteininteraktionstekniker, det vill säga BiFC och FRET, för att skapa en analys för att mäta ternarykomplex bildning mellan tre proteinpartners. Här har vi använt FLIM för att mäta FRET-givarpartnerns fluorescenslivslängd i närvaro och frånvaro av FRET-acceptorn. En minskning av fluorescensens livslängd för givaren förväntades om det fanns en positiv interaktion mellan de två proteinerna. Vi började med att mäta donatorns fluorescenslivslängd, dvs. Vi har använt mätläget "All photons counting", som skapar en fluorescensförfallskurva med alla fotoner i intresseområdet (ROI) och ger en uppmätt livslängd med ett mindre fel än den traditionella tidskorrerade enfotonräkningen. Det snabba FLIM-filtret säkerställer användningen av enstaka fotonhändelser mellan pulserna. En lämplig matematisk modell valdes sedan för pixel-för-pixel-beräkningar och montering av sönderfallskurvan27.
Den CFP-variant som används här (och är också den vanligaste) har konformationsanpassning, vilket resulterar i två fluorescenslivslängder. Därför valde vi att passa fluorescensförfallskurvan med hjälp av en modell för den multi-exponentiella givaren. Detta resulterar i separationen av de två livstiderna för den gemensamma fiskeripolitiken, som i vårt fall observerades som 1,0 n och 3,3 ns. För att beräkna FRET-effektiviteten använde vi den högre CFP-livslängden, dvs. 3,3 ns (genomsnittlig fluorescenslivslängd, n = 10).
När det gäller positiv kontroll (CFP och M-YFP) ser vi en minskning av givarens fluorescenslivslängd från 3,3 n till 2,5 ns(figur 6). Och FRET-effektiviteten med följande ekvation var 56%.
E = FRET-effektivitet
τD = Oslät donator livstid (endast givarprov, C-CFP)
τ AvAmp = Genomsnittlig sönderfallstid - Amplitud viktad genomsnittlig livstid
En liknande övning med rekonstituerad YFP till följd av interaktionen mellan två M monomerer och C-protein resulterade också i en positiv interaktion som ledde till minskning av fluorescenslivslängden för acceptorn (C-CFP) till 2,6 ns. Den beräknade FRET-effektiviteten var i detta fall cirka 55 %(figur 6).
Om en CFP-variant eller någon annan donatorfluofor har en enda fluorescenslivslängd, kommer sönderfallskurvan att behöva anpassas med hjälp av den mono-exponentiella givarmodellen. I så fall kan FRET:s effektivitet beräknas med hjälp av formeln:
τ är fluorescenslivslängden för det prov som endast innehåller donatorn
τ släckningen mäts i närvaro av acceptorn (medan FRET äger rum)
De råa fluorescenslivslängdsavläsningarna från minst 10 celler för varje experimentell installation har samlats in som ett spridningsdiagram med onlineverktyget PlotsOfData (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, figur 6C)28. Minskningen av fret-givarens fluorescenslivslängd ger starka bevis för en trepartsinteraktion mellan dessa tre proteiner.
Figur 1: Schematisk framställning av principen om BiFC- och BiFC FRET-FLIM-metod. Interaktion mellan två M-proteiner resulterar i rekonstitution av YFP, och detta par kan sedan fungera som en acceptormolekyl. Den tredje C-CFP-fiskeripolitiken fungerar som fret-givare här. Således bevisar en positiv FRET-signal trepartsinteraktion mellan två M-proteiner och ett C-protein. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Kloning av M- och C-gener i slutdestinationsvektorer. Kodningssekvenserna av generna förstärks och klonas först i pENTR/D-TOPO vektor följt av mobilisering av konstruktionerna i slutdestination vektorer pSITE-1CA, pSITE-3CA, pSPYNE-35S och pSPYCE-35S av LR Clonase II rekombination reaktion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Med hjälp av elektroporation levereras önskade vektorkombinationer i GV3101 stam av Agrobacterium tumefaciens. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Diagrammatisk illustration av agroinfiltration av Nicotiana-växter och de konstruktionskombinationer som används för försöket. M-YFPn och M-YFPc används för att studera trepartsinteraktion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Provernas fluorescenslivslängd i avsaknad och närvaro av acceptorn. På samma sätt (B) visas en minskning av den gemensamma fiskeripolitikens livslängd till 2,3 ns vid trepartsinteraktion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Trepartsinteraktion mellan två M-monomerer och ett C-protein analyserat med biFC-baserad FRET-FLIM-analys. a)En cell som antingen endast visar den gemensamma fiskeripolitiken i eller både den gemensamma fiskeripolitiken och YFP (ii och iii) som härrör från donator- och acceptorproteiner med hjälp av respektive excitations- och emissionsvåglängder. b) i, ii, iii representerar FLIM-bild som visar den gemensamma fiskeripolitikens fluorescenslivslängd i cellen. Färgskalefältet representerar den pseudofärg som motsvarar livstiden. Skalstång = 50 μm. (C) Spridningsdiagram som visar CFP:s fluorescenslivslängd när den är ensam eller med de interagerande partnerna där n = 10. Tomten genereras med hjälp av onlineverktyget PlotsOfdata (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/); fluorescenslivslängden representeras som linjen mellan provsp:erna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Negativt kontrollexperiment för validering av bifc-interaktion mellan proteinerna M och C. Interaktion mellan den muterade formen av M Protein (MΔCBD), som saknar alla C protein bindande regioner, och C protein-YFPc fusion försöker fungera som en negativ kontroll för BiFC analys. Övre paneler visar övergående uttryck av MΔCBD-GFP i lökskalceller, och resultaten av försök till interaktion mellan MΔCBD-YFPn och C-YFPc visas i de nedre panelerna. Frånvaron av fluorescens från rekonstituerad YFP tyder på bristen på interaktion mellan MΔCBD och C protein. N, kärna; C, cytoplasma; BF, ljust fält; FL, fluorescens; OL, digitalt överlägg, den cytoplasmiska regionen visas med vita pilar. Skalningsfält = 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| S.No. | Vektor | Val av antibiotika |
| Ingång Vektor | ||
| 1 | pENTR/D-TOPO | Kanamycin |
| Målvektorer | ||
| 2 | pSPYNE-35S | Kanamycin |
| 3 | pSPYCE-35S | Kanamycin |
| 4 | pSITE-1CA | Spectinomycin |
| 5 | pSITE-3CA | Spectinomycin |
Tabell 1: Vektorer som används i studien.
| S.No. | Interaktion | Kombination av konstruktioner |
| 1 | Trepartsinteraktion | C-CFP + M-YFPn:M-YFPc + p19 |
| 2 | Positiv kontroll | C-CFP + M-YFP + p19 |
| 3 | Negativ kontroll | CFP + Tom-YFP + p19 |
| Valfritt (motsatta konformationer) | ||
| 4 | Trepartsinteraktion | M-CFP + M-YFPn:C-YFPc + p19 |
| 5 | Positiv kontroll | M-CFP + C-YFP + p19 |
| 6 | Negativ kontroll 1 | M-CFP + Tom-YFP + p19 |
| 7 | Negativ kontroll 2 | Tom -CFP + C-YFP + p19 |
| 8 | Negativ kontroll 3 | Tom -CFP + M-YFP + p19 |
Tabell 2: Konstruera kombinationer som används i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visar användningen av BiFC-baserade FRET-FLIM analys för att fastställa bildandet av ett ternary komplex mellan två monomerer av en MADS-box protein och en kalciumsensor protein. Protokollet är anpassat från en rapport av Y. John Shyu et al. där de har utvecklat en BiFC-baserad FRET-metod för att visualisera ternarykomplex som bildas mellan Fos-Jun heterodimers och NFAT eller p65 med hjälp av den sensibiliserade utsläppsmetoden7. Tidigare utvecklades ett trefluofor FRET-system av Galperin och medarbetare år 200429, men det kräver sex filter som innehåller en sofistikerad mikroskopinställning. Också, snabb rörelse av organeller, såsom endosomes, under bildförvärv pålade experimentella svårigheter. Å andra sidan använder BiFC-baserade FRET-FLIM filter för endast två fluoroforer och har en förenklad mikroskopinställning. Den här inställningen möjliggör direkt visualisering av ternary-komplexet, till skillnad från 3-FRET-systemet. Detta har också en fördel jämfört med BiFC-FRET-systemet genom att vara mer robust och kvantitativ än FRET-mätningarna med sensibiliserade utsläpp7. I denna analys mäts fluorescenslivslängder för enskilda fotoner för beräkning av FRET-effektivitet, snarare än övergripande förändringar i donator- och acceptormolekylernas relativa fluorescensintensiteter. En annan fördel med den FLIM-baserade metoden jämfört med BiFC-FRET-metoden är att endast givarens livslängd behöver mätas. Acceptansens fluorescensemissionsegenskaper påverkar inte resultatet av FRET-mätningarna. Fördelarna och enkelheten med denna metod gör BiFC-baserade FRET-FLIM till en enklare, enklare och mer kvantitativ metod för att studera trepartsinteraktioner. Man måste dock ha tillgång till en konfokal inställning med pulslasrar, snabba detektorer som kan räkna en foton och en kompatibel programvara.
För att detta experiment ska lyckas är det viktigt att interaktionen mellan de två proteinpartnerna som används i BiFC-konformation valideras med hjälp av flera metoder och lämpliga kontroller innan de används som FRET-acceptor. Det är lämpligt att använda negativa kontroller som en muterad form av interagerande partner eller ett icke-relaterat colocalizing protein som en negativ interagerande partner16. De negativa kontrollerna för validering av BiFC-interaktionerna mellan M- och C-proteiner som används i detta protokoll inkluderade mutationer i dessa proteiners förmodade bindningsområde, som helt avskaffade BiFC-signalen (kompletterande figur 1). Dessutom validerades denna interaktion också med Y2H- och FRET-metoder i olika system.
Temporal optimering av uttrycket av proteiner i Nicotiana rekommenderas också så att de negativa effekterna av överuttryck av proteiner, vilket kan leda till falskt positiva resultat, kan minimeras. Det är också nödvändigt att inkludera p19-stammen tillsammans med de agrobacteriella stammarna som innehåller konstruktioner för att förhindra efter-transkriptionell gendämpning. p19 är en suppressor av gendämpning från tomatbuskigt stuntvirus och förbättrar omvandlingseffektiviteten upp till 90%30. Nyligen har bättre versioner av fluoroforerna, nämligen m-turkos-SYFP2, SYFP2-mRFP och SCFP3a-SYFP2 utvecklats. Dessa kan användas som FRET-par beroende på deras lämplighet för målsystemet och celltyp11. FRET-FLIM-mätningarna bör utföras i minst tio celler för att erhålla statistiskt signifikanta data. Om möjligt kommer ett större antal prover i mätningarna att ytterligare förbättra uppgifternas kvalitet och tillförlitlighet. Beroende på donatorfluofor bör den matematiska modellen för att passa data med fluorescenslivslängdens sönderfallskurva väljas.
Protokollet som beskrivs här är ett kraftfullt verktyg för att bestämma trepartsinteraktioner i levande celler. Det hjälper till att bestämma det intracellulära läget för det interagerande komplexet, vilket är viktigt för att dechiffrera funktionen och fysiologiska betydelsen av något proteinkomplex. Det kan också lösa den interagerande partnerns relativa koncentrationer baserat på FRET-FLIM-data, som inte kan förklaras enbart av intensitetsmätningsmetoder10. Slutgiltigt ger BiFC-baserade FRET-FLIM-analyser en möjlighet att studera och karakterisera viktiga aspekter av trepartsproteininteraktioner, som kan användas i djur- och växtsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
OBS, GG, SB, KC tackar uppriktigt University Grants Commission (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE och Council for Scientific and Industrial Research (CSIR) för deras forskarstipendier. Vi erkänner tack och lov departementet för bioteknik (DBT), Indiens regering, Department of Science and Technology (DST-FIST), Indiens regering för ekonomiskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
References
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
