Summary
Her præsenterer vi, en metode til at visualisere ternary kompleks dannelse mellem tre proteinpartnere ved hjælp af fluorescerende-tagged proteiner ved BiFC baseret FRET-FLIM assay. Denne metode er værdifuld til undersøgelse af protein-protein interaktion komplekser in vivo.
Abstract
Protein-protein interaktioner er en integreret del af alle biologiske processer i cellerne, da de spiller en afgørende rolle i regulering, vedligeholdelse og ændring af cellulære funktioner. Disse interaktioner er involveret i en bred vifte af fænomener såsom signaltransduktion, patogenrespons, cellecelleinteraktioner, metaboliske og udviklingsmæssige processer. I tilfælde af transskriptionsfaktorer kan disse interaktioner føre til oligomerisering af underenheder, binding i specifikke subcellulære sammenhænge som kernen, cytoplasmaet osv., som igen kan have en dybere virkning på ekspressionen af downstream-generne. Her demonstrerer vi en metode til at visualisere in vivo trepartsinteraktion ved hjælp af Bimolekulær Fluorescens Complementation (BiFC) baseret Förster Resonance Energy Transfer (FRET), der involverer Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM). To af de proteiner, der er udvalgt til denne demonstration, interagerer som BiFC-partnere, og deres rekonstituerede fluorescensaktivitet bruges til at analysere FRET-FLIM med den tredje partner. Fire til fem uger gamle vækstkammerdyrkede Nicotiana benthamiana planter er blevet brugt som model plantesystem til denne demonstration.
Introduction
Protein-protein interaktioner (PPI) danner grundlag for en velfungerende eukaryote celler ved at regulere forskellige metaboliske og udviklingsmæssige processer. Nogle PPI er stabile, mens andre er forbigående. Interaktionerne kan kategoriseres ud fra antallet og typen af medlemmer i interaktionen, f.eks. Identifikation og karakterisering af proteininteraktioner kan føre til en bedre forståelse af proteinfunktioner og reguleringsmæssige netværk.
Transskriptionsfaktorer er proteiner, der er involveret i regulatoriske funktioner. De regulerer hastigheden af transskription af deres downstream gener ved at binde sig til DNA. Sommetider oligomerisering eller dannelse af højere orden komplekser af proteiner er en forudsætning for at udføre deres funktioner2. Plant MADS-box transskription faktorer er homeotiske gener, der regulerer forskellige processer såsom blomster overgang, blomster organ udvikling, befrugtning, frø udvikling, senescence, og vegetativ udvikling. De er kendt for at danne højere orden komplekser, der binder sig til DNA3,4. Undersøgelse ppi netværk blandt transskription faktorer og deres interactors giver indsigt i kompleksiteten underliggende transskription regulering.
Forbigående protein udtryk i Nicotiana benthamiana har været en populær tilgang til at studere protein lokalisering eller protein-protein interaktioner in vivo5. BiFC og FRET er metoder til at studere protein-protein interaktioner in vivo ved hjælp af fluorescerende reporter systemer6. En kombination af disse to teknikker har vist sig at afsløre samspillet mellem tre proteiner7. FRET måles ved hjælp af acceptor photobleaching, sensibiliseret emission, og Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM) teknik. FLIM-baserede FRET assay har vist sig som et værktøj, der giver præcis kvantificering og spatiotemporal specificitet til energioverførsel målinger mellem to molekyler baseret på deres fluorescens levetid8. FLIM måler den tid, en fluorophore forbliver i en ophidset tilstand, før udsender en foton og er bedre end teknikker, der bruger intensitet målinger alene9,10. Ud over heterologe systemer som Nicotiana benthamiana og løg epidermal peelinger, nyere rapporter har vist brugen af Arabidopsis rødder og unge risplanter, osv., for in vivo analyse af protein-protein interaktioner under indfødte forhold11,12.
Bortset fra et passende udtrykssystem er udvælgelsen af interagerende partnere til BiFC- og FRET-analyser også afgørende for succesen af dette eksperiment. PPI blandt partnere , der anvendes i BiFC-konfigurationen , bør valideres ved hjælp af passende kontrolelementer, før de anvendes som konjugeret partner i FRET-eksperimentet13. BiFC anvender den strukturelle komplementering af N- og C-terminal dele af fluorescerende protein. En fælles begrænsning i de fleste, hvis ikke alle fluorescerende proteiner, der anvendes i BiFC-analyser, har været selvmonteringen mellem de to afledte ikkefluorescent fragmenter, der bidrager til falsk-positiv fluorescens og reducerer signal-til-støj (S /N) forholdet14. Den seneste udvikling, herunder punktmutationer eller position til opdeling af fluorescerende protein, har givet anledning til BiFC-par med øget intensitet, højere specificitet, højt S /N-forhold15,16. Disse fluorescerende proteiner kan også bruges til at udføre BiFC afhængigt af eksperimentets egnethed.
Traditionelt er den fælles fiskeripolitik og YFP blevet brugt som donor og acceptorpar i FRET-eksperimenter17. Men, YFP eller m-Citrine viste sig at være bedre FRET donorer (når de anvendes med RFP som acceptor) på grund af det høje kvanteudbytte (QY) under den indfødte udtryk for mål proteiner i Arabidopsis rodsystemet. Udvælgelsen af initiativtagere (konstituerende versus indfødte / endogene) og fluorophore spiller også en afgørende rolle i udformningen af en vellykket BiFC-FRET-FLIM eksperiment. Det er vigtigt at bemærke, at FRET-donorernes effektivitet og FRET-pars egnethed har tendens til at ændre sig med ændringen i initiativtageren og det biologiske system, der anvendes til udtryk. QY af fluorophore, som vedrører dens lysstyrke, afhænger af pH, temperatur, og det biologiske system i brug. Vi foreslår, at disse kriterier overvejes grundigt, før du vælger fluorophoreparret til FRET-eksperimentet. Det biologiske system, initiativtagerne og de proteiner, der anvendes til denne protokol, fungerede godt med CFP-YFP fluorophorer til BiFC FRET-FLIM eksperimentet.
I denne undersøgelse inkorporerer vi funktionen af FLIM for at visualisere samspillet mellem tre proteinmolekyler ved hjælp af BiFC-baseret FRET. I denne teknik er to proteiner mærket med split YFP-protein og det tredje protein med cfp. Da vi var interesseret i at studere samspillet mellem en MADS-box protein (M) homodimer med en Calcium sensor protein (C), disse proteiner blev mærket med fluorescerende proteiner i pSITE-1CA og pSITE-3CA vektorer18. To af de interagerende partnere, i denne analyse, blev mærket med N- og C-terminal dele af YFP i pSPYNE-35S og pSPYCE-35S vektorer19, og deres interaktion resulterer i rekonstitution af den funktionelle YFP, der fungerer som en FRET acceptor til den tredje interagerende partner, som er mærket med den fælles fiskeripolitik (fungerer som FRET donor) (Figur 1 ). I dette særlige tilfælde er PPI mellem to M-monomerer og mellem M og C blevet valideret ved at udføre BiFC i tre forskellige systemer sammen med gær-to-hybrid-systemet. Disse vektorer blev mobiliseret i Agrobacterium tumifaciens GV3101 stamme ved elektroporation. GV3101-stammen har en afvæbnet Ti plasmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) med gentamicinresistens20. En p19 Agrobacterium stamme blev tilføjet sammen med alle infiltrationer for at forhindre transgene lyddæmpning21. Vi anbefaler, at de tre proteiner også anvendes i modsatte konformationer for at validere trepartsinteraktionerne.
I denne teknik har vi anvendt FLIM, hvor donorens fluorescenslevetid (uudslukket donorlevetid) for det første måles i mangel af en acceptor. Derefter måles dens levetid i acceptorens tilstedeværelse (slukket donorlevetid). Denne forskel i donor fluorescens levetid bruges til at beregne FRET effektivitet, som afhænger af antallet af fotoner udviser en reduktion i fluorescens levetid. Nedenfor er en detaljeret protokol til bestemmelse af dannelsen af etternært kompleks mellem tre proteiner ved forbigående at udtrykke fluorescerende-taggede proteiner i Nicotiana benthamiana og analysere deres interaktion med BiFC-FRET-FLIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning af gener i ind- og destinationsvektorer (figur 2)
- Forstærke kodning sekvens (CDS) af de gener af interesse (M og C gener i vores tilfælde) af PCR og klone dem i passende indrejse vektorer (f.eks pENTR/D-TOPO vektor; se tabel 1 for vektorer, der bruges i dette eksperiment).
- Dyrk klonerne på plader, der indeholder antibiotika. Valider kloner, der er udvalgt på antibiotika ved at begrænse fordøjelsen og DNA sekventering22,23.
- Mobilisere de rekonstituerede CDS'er fra indgangskloner til destinationsvektorerne (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA og pSITE-3CA) og bekræft overførslen af sekvenser fra indgangen til destinationsvektorerne ved at begrænse fordøjelsen af etzym.
BEMÆRK: Alle vektorer, der bruges i dette eksperiment, er angivet i tabel 1. - Endelig omdannes Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR)) celler med destinationsvektorerne ved elektroporation (Figur 3)24.
2. Vækstbetingelser for Nicotiana benthamiana planter
BEMÆRK: Dyrk Nicotiana planter indtil 4-6 blad fase i kontrolforhold.
- For at dyrke Nicotiana planter, forberede jorden mix ved at blande kommercielt tilgængelige jord blander med cocopeat og kompost i et forhold på 2:1:1.
- Spred et 1-tommer tykt lag af denne jordblanding i en plastikbakke for at gøre jordbunden og mætte den med deioniseret vand. Drys omkring 200 frø i denne jord seng.
- Overfør den til en større bakke, der indeholder 1 cm stående vand. Dæk denne bakke med plastfolie for at skabe et fugtkammer.
- Dette sæt op til et vækstkammer, der er indstillet til 23 °C med 16 timers lys og 8 timers mørk cyklus med 150-170 μmol/m2s lysintensitet.
- Efter to uger overføres unge frøplanter til små 3-4-tommer potter, der indeholder vandmættede jordblandinger.
- Placer disse potter i plastbakker og overfør dem til vækstkammeret i yderligere fire uger.
3. Forbered bakteriestammer til agroinfiltration
BEMÆRK: For agroinfiltration skal bakteriestammer være frisk subkulturerede og blandes sammen med p19-stamme af Agrobacterium i passende nøgletal.
- 2xYT agarplader indeholdende rifampicin (100 μg/mL), gentamicin (25 μg/mL) og kanamycin (50 μg/mL) til Agrobacterium, der huser pSPYNE-35S og pSPYCE-35S vektor. For pSITE-vektor, der indeholder stamme, anvendes rifampicin (100 μg/mL), gentamicin (25 μg/mL) og spectinomycin (50 μg/mL).
- Streak Agrobacterium stammer, der indeholder plasmider på disse plader ved hjælp af sterile podning sløjfer i en laminar flow hætte.
- Inkuberes ved 28 °C i 48 timer i mørke.
- Start denne procedure ved at pode Agrobacterium GV3101-stamme, der huser BiFC- og FRET-konstruktioner (fremstillet i pSPYNE-35S, pSPYCE-35S- og pSITE-vektorer) fra stribede plader i 10 mL 2xYT bouillon, der indeholder passende antibiotika (Rifampicin (100 μg/mL), gentamicin (25 μg/mL), kanamycin (50 μg/mL) eller spectinomycin (50 μg/mL)).
- Derudover skal du starte en kultur af p19 stamme af Agrobacteria ved at pode 10 mL af 2xYT bouillon indeholdende rifampicin (100 μg/mL) og kanamycin (50 μg/mL).
BEMÆRK: P19-stammen tilsættes for at forhindre transgenesydning. - Kolben skal med en aluminiumsfolie med aluminiumsfolie og opbevares i inkubatoren, der er indstillet til 28 °C og 170 omdr./min i 16 timer i mørke.
- Efter natten vækst, overføre 1 mL af denne kultur til en engangs-cuvette til at måle den optiske tæthed (O.D.) af kulturer på 600 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
- Bland kulturer passende BiFC og FRET partner, der indeholder stammer, således at den endelige OK af hver kultur er 0,5, og at p19 er 0,3 i et samlet volumen på 2 mL.
- For at opnå disse nøgletal skal du bruge nedenstående formel:
ODopnået = O.D. af kulturen målt ved 600 nm
Vkultur = Volumen af den kultur, der kræves
ODendelig = 0,5 for konstruktioner og 0,3 for p19
Vendelig = Sidste bind for infiltrationen, som er 2 mL
BEMÆRK: De konstruktionskombinationer, der anvendes i denne undersøgelse, er angivet i tabel 2. - Centrifugere de blandede Agrobacterium kulturer på 3.000 x g i 5 min ved stuetemperatur og forsigtigt kassere supernatant. Resuspend pellet i 2 ml frisklavet infiltration buffer (10 mM MES, 100 μM acetosyringone, og 10 mM MgCl2). Brug en vortex mixer til at gøre en homogen celle suspension.
- Inkuber rørene, der indeholder ophængte celler i mørket ved stuetemperatur i 3 timer.
- I mellemtiden mærke hver plante pot med konstruere blandingen det vil blive infiltreret med. Brug to planter til hver infiltration blanding.
- Fyld en 1 mL nåleløs sprøjte med agrobakteriel blanding. Tryk forsigtigt, men fast sprøjten på abaxialsiden af det fuldt udvidede blad, mens du støtter bladet fra den anden side. Skub forsigtigt stemplet, indtil opløsningerne fyldes op i bladområdet svarende til 2-3 gange sprøjtespidsen.
- Infiltrere op til fire pletter på et blad og 3-4 blade pr plante, som vist i figur 4.
BEMÆRK: Skift handsker eller tør handsker af med 70 % alkohol mellem prøverne for at forhindre krydskontaminering. - Overfør alle potterne til en bakke og inkuber i et vækstkammer under de samme forhold som nævnt i trin 2.
- Kontroller en lille del af det agroinfiltrerede blad på forskellige tidspunkter ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Når fluorescensen fra både YFP og den fælles fiskeripolitik kan påvises i celler, skal du gå videre til det konfokale mikroskop til BiFC-FRET FLIM-analyse. I dette eksperiment blev analysen udført 3 dage efter agroinfiltration.
BEMÆRK: Indstil inkubationsperioden efter agroinfiltrationen individuelt for hver promotor- og genkombination for at undgå overekspression af kimærproteiner, der anvendes i BiFC-FRET FLIM-analysen. Overekspressionen af partnerproteinerne kan føre til falsk-positive interaktioner.
4. Forbered dias til fluorescensvisualisering
- Når planter er klar til visualisering, skære firkantede blade prøver, 5-8 mm væk fra infiltration sår, og montere dem i destilleret vand på rene dias.
BEMÆRK: For at minimere baggrundslyscens skal du rengøre diasene med 80% ethanol efterfulgt af destilleret vand 3-4 gange, lufttørre dem og holde dem på et absorberende ark. - Dæk bladprøven med en ren coverlip og forsegling ved hjælp af en negle emalje.
- Visualiser disse prøver under et konfokalt laserscanningsmikroskop.
5. FRET-FLIM analyse ved hjælp af en konfokal laser scanning mikroskop
BEMÆRK: I denne procedure er grundlaget for at bestemme og kvantificere interaktion mellem to proteiner reduktionen i FRET-donorpartnerens fluorescenslevtid ved dets interaktion med acceptoren, som bruges til at beregne FRET's effektivitet. Kompleksiteten i tilfælde af trepartsinteraktion øges yderligere, fordi FRET-acceptoren i dette tilfælde ikke er et enkelt molekyle, men et split YFP-BiFC-par, som først skal rekonstitueres in vivo for at blive en funktionel FRET-acceptor fluorophore. For at udføre FRET-FLIM skal man bestemme donormolekylets fluorescens levetid først alene og derefter i nærværelse af en FRET-partner.
- Åbn FLIM-applikationen i det konfokale laserscanningsmikroskop, start konsollen, og brug fotontælling med mønstergenkendelse til at måle fluorescenslevetiden. Vælg standardmåletilstanden 'Alle fotontællinger'.
- Analyser prøver fra to typer agroinfiltrerede planter: den ene kun med donoren (C-CFP) og den anden med donoren og acceptoren (C-CFP sammen med M-YFP) begge.
BEMÆRK: Da samspillet mellem M-protein allerede er blevet valideret med C-protein ved hjælp af BiFC og Y2H, forventes god FRET-effektivitet med dette interagerende par. - Dernæst scanne C-CFP agro-infiltreret blad og fokusere på en celle, der viser god cfp fluorescens. Start laserscanningstilstanden, og indstil systemet til visualisering af den fælles fiskeripolitik og FLIM-målinger (λex 440 nm pulslaser, λem 480-520 nm ved hybriddetektorer, scanningshastighed 512 x 512 pixels ved 400 Hz).
- Juster fokus, zoom og smart gain for at fokusere på det område, der skal fanges.
- Belys prøven ved tilstrækkelig lasereffekt til at opnå opsamling af ca. 0,1 fotoner pr. puls. For prøver med variabel fluorescensintensitet skal du fange 50 billeder for at indsamle passende fotoner, der er nødvendige for levetidsmålingen. Den fælles fiskeripolitik udviser to fluorescens levetider på grund af dens kropsbygning; derfor passer til de data, der bruger n-eksponentiel rekonvolutionsmodel, samtidig med at værdien af n er lig med 2.
- Ved disse indstillinger viser den fælles fiskeripolitik to levetider på 1,0 og 3,2 ns. Her bruges den højere, 3,2 ns, levetid til alle efterfølgende beregninger25,26.
- For at beregne FRET-effektivitet ved hjælp af FLIM, som er målingen af graden af interaktion mellem to proteiner, skal du tage en bladprøve, der er blevet infiltreret med C-CFP og M-YFP. Kig efter en celle, der udtrykker både C-CFP og M-YFP og bekræfte deres respektive emissionsmønstre ved at spændende dem ved hjælp af λex 440 nm puls laser, λem 480-520 nm og λex 514 nm hvidt lys laser med λem 526-550 nm. Sekventielt scanne og identificere en celle, der viser både CFP og YFP fluorescens.
- Efter at have bekræftet fluorescensen fra begge proteiner skal du skifte til FLIM-konsollen for at måle den fælles fiskeripolitiks levetid ved hjælp af de samme indstillinger, som vi brugte tidligere til måling af C-CFP's levetid (trin 5.5).
BEMÆRK: Denne celle udtrykker også M-YFP, der potentielt kan interagere med C-CFP og forårsage en reduktion i C-CFP's levetid. - Sæt grafen opnået ved hjælp af n-eksponentiel rekonvolutionsmodel, med n = 2. Der blev observeret et fald i den fælles fiskeripolitiks levetid fra 3,2 til 2,6 ns, hvilket indikerer Förster resonansenergioverførsel mellem den fælles fiskeripolitik og YFP (figur 5A).
- Start nu FRET-konsollen i softwaren, og beregn FRET-effektiviteten ved manuelt at indtaste uudslukket donorlevetid i den ligning, der leveres i softwaren. Og den observerede FRET effektivitet er: 56%.
- Trepartsinteraktion
- Endelig, for at visualisere samspillet mellem tre partnere, tage bladprøven fra en plante, der blev co-infiltreret med C-CFP, M-YFPn og M-YFPc.
- Scan bladeksplanten for en celle, der viser både den fælles fiskeripolitik og rekonstituerede YFP-fluorescens, der stammer fra BiFC-interaktion mellem to M-proteiner. Brug de samme laser- og emissionsbølgelængder som tidligere anvendt.
- Derefter skal du slukke for 514 nm laseren og flytte til FLIM-konsollen.
BEMÆRK: Hvis M-YFP-dimeren interagerer med C-CFP, bør man se en reduktion i C-CFP's levetid som observeret under dens interaktion med M-YFP. Men hvis C-cfp undlader at interagere med M-YFP dimer, dens fluorescens levetid bør bo på 3,2 ns. - Ved hjælp af lignende indstillinger som nævnt ovenfor måles den fælles fiskeripolitiks levetid i nærværelse af rekonstitueret YFP. Sæt den graf, der er opnået ved hjælp af den n-eksponentielle rekonvolutionsmodel, med n = 2, og flyt til FRET-konsollen.
BEMÆRK: Der er et fald i den fælles fiskeripolitiks levetid fra 3,2 til 2,3 ns. Beregn FRET-effektiviteten som beskrevet ovenfor. Den beregnede FRET-effektivitet er 55%. Reduktionen i donorlevetiden og en god FRET-effektivitet på 55 % bekræfter trepartsinteraktionen mellem to M-proteiner og C-protein in vivo (se figur 5B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol repræsenterer en optimeret metode til at studere in vivo trepartsprotein-protein interaktioner i planter. Det grundlæggende princip i protokollen er at kombinere to fluorescens-tagged protein-interaktion teknikker, dvs BiFC og FRET, at skabe en analyse til måling af ternary kompleks dannelse mellem tre protein partnere. Her har vi brugt FLIM til at måle FRET-donorpartnerens fluorescenslevetid i FRET-acceptens tilstedeværelse og fravær. En reduktion i donorens fluorescenslevetid var forventet, hvis der var en positiv interaktion mellem de to proteiner. Vi startede med at måle donorens fluorescenslevetid, dvs. Vi har brugt målingstilstanden 'All photons counting', som skaber en fluorescens henfaldskurve med alle fotoner i interesseområdet (ROI) og giver en målt levetid med en mindre fejl end den traditionelle tidskorrelerede enkeltfotontælling. Det hurtige FLIM-filter sikrer brugen af enkeltfoton-hændelser mellem pulserne. En passende matematisk model blev derefter valgt til pixel-for-pixel beregninger og montering af henfaldskurven27.
Den fælles fiskeripolitik variant, der anvendes her (og er også den mest almindeligt anvendte) har kropsbygning tilpasning, hvilket resulterer i to fluorescens levetid. Derfor valgte vi at montere fluorescens henfaldskurven ved hjælp af en model til den multi eksponentielle donor. Dette resulterer i adskillelsen af de to levetider for den fælles fiskeripolitik, som i vores tilfælde blev observeret som 1,0 ns og 3,3 ns. Til beregning af FRET-effektiviteten brugte vi den højere fælles fiskeripolitiks levetid, dvs. 3,3 ns (gennemsnitlig fluorescenslevetid, n = 10).
I tilfælde af positiv kontrol (C-CFP og M-YFP) observerer vi en reduktion i donorens fluorescenslevetid (C-FFP) fra 3,3 n til 2,5 ns (figur 6). Og FRET-effektiviteten ved hjælp af følgende ligning var 56%.
E = FRET-effektivitet
τD = Uudslukket donor lifetime (donor kun prøve, C-FFP)
τ AvAmp = Mean Decay tid - Amplitude vægtet gennemsnitlig levetid
En lignende øvelse med rekonstitueret YFP som følge af samspillet mellem to M-monomerer og C-protein resulterede også i en positiv interaktion, der førte til reduktion af acceptorens fluorescenslevetid (C-CFP) til 2,6 ns. Den beregnede FRET-effektivitet var ca. 55 % i dette tilfælde (figur 6).
Hvis en cfp-variant eller en anden donorfluoriphe har en enkelt fluorescenslevetid, skal henfaldskurven passe ved hjælp af den mono eksponentielle donormodel. I så fald kan FRET's effektivitet beregnes ved hjælp af formlen:
τ er fluorescenslevetiden for den prøve, der kun indeholder donor
τ quench måles i nærværelse af acceptoren (mens FRET finder sted)
De rå fluorescens levetid aflæsninger fra mindst 10 celler for hver eksperimentel opsætning er blevet samlet som et scatter plot ved hjælp af PlotsOfData online værktøj (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, Figur 6C)28. Reduktionen i FRET-donorens fluorescenslevetid giver stærke beviser for en trepartsinteraktion mellem disse tre proteiner.
Figur 1: Skematisk repræsentation af princippet om BiFC- og BiFC FRET-FLIM-metoden. Interaktion mellem to M proteiner resulterer i rekonstitution af YFP, og dette par kan derefter fungere som en acceptor molekyle. Det tredje protein C-CFP fungerer som FRET donor her. Således viser et positivt FRET-signal trepartsinteraktion mellem to M-proteiner og et C-protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kloning af M- og C-gener i endelige destinationsvektorer. Kodningssekvenserne af generne forstærkes og klones først i pENTR/D-TOPO vektor efterfulgt af mobilisering af konstruktionerne i de endelige destinationsvektorer pSITE-1CA, pSITE-3CA, pSPYNE-35S og pSPYCE-35S af LR Clonase II rekombinationsreaktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ved hjælp af elektroporation leveres de ønskede vektorkombinationer i GV3101 stamme af Agrobacterium tumefaciens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Diagrammatisk illustration af agroinfiltration af Nicotiana-planter og de konstruktionskombinationer, der anvendes til forsøget. M-YFPn og M-YFPc bruges til at studere trepartsinteraktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentation af eksescensenslevighedslevetiden for prøverne i acceptorens fravær og tilstedeværelse. På samme måde (B) viser reduktionen i C-den fælles fiskeripolitiks levetid til 2,3 ns i tilfælde af trepartsinteraktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Trepartsinteraktion mellem to M-monomerer og et C-protein analyseret ved hjælp af BiFC-baseret FRET-FLIM-analyse. (A) En celle, der enten kun viser den fælles fiskeripolitik (i) eller både den fælles fiskeripolitik og YFP (ii og iii), der stammer fra donor- og acceptorproteiner, der anvender respektive excitations- og emissionsbølgelængder. (B) i, ii, iii repræsenterer FLIM billede, der viser fluorescens levetid af den fælles fiskeripolitik i cellen. Farveskalalinjen repræsenterer den pseudofarve, der svarer til levetiden. Skalastang = 50 μm. (C) Scatter Plot, der viser den fælles fiskeripolitiks fluorescenslevetid, når den er til stede alene eller hos de interagerende partnere, hvor n = 10. Plottet genereres ved hjælp af onlineværktøjet PlotsOfdata (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/); den gennemsnitlige fluorescenslevetid er repræsenteret som linjen mellem prøveprikkerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Negativt kontroleksperiment til validering af interaktion mellem proteiner M og C ved BiFC. Interaktion mellem den muterede form af M Protein (MΔCBD), som mangler alle C protein bindende regioner, og C protein-YFPc fusion er forsøgt at tjene som en negativ kontrol for BiFC analyse. Øverste paneler viser forbigående udtryk for MΔCBD-GFP i løgskrælceller, og resultaterne af forsøg på interaktion mellem MΔCBD-YFPn og C-YFPc vises i de nederste paneler. Fraværet af fluorescens fra rekonstitueret YFP er tegn på den manglende interaktion mellem MΔCBD og C-protein. N, kerne; C, cytoplasma; BF, lyst felt; FL, fluorescens; OL, digital overlejring, den cytoplasmatiske region er vist ved hjælp af hvide pile. Skalalinje = 10 μm. Klik her for at downloade denne fil.
| S.No. | Vektor | Valg af antibiotika |
| Indgangsvektor | ||
| 1 | pENTR/D-TOPO | Kanamycin |
| Destinationsvektorer | ||
| 2 | pSPYNE-35S | Kanamycin |
| 3 | pSPYCE-35S | Kanamycin |
| 4 | pSITE-1CA | Spectinomycin |
| 5 | pSITE-3CA | Spectinomycin |
Tabel 1: Vektorer, der anvendes i undersøgelsen.
| S.No. | Vekselvirkning | Kombination af konstruktioner |
| 1 | Trepartsinteraktion | C-CFP + M-YFPn:M-YFPc + p19 |
| 2 | Positiv kontrol | C-CFP + M-YFP + p19 |
| 3 | Negativ kontrol | C-CFP + Empty-YFP + p19 |
| Valgfri (modsate konformationer) | ||
| 4 | Trepartsinteraktion | M-CFP + M-YFPn:C-YFPc + p19 |
| 5 | Positiv kontrol | M-CFP + C-YFP + p19 |
| 6 | Negativ kontrol 1 | M-CFP + Tom-YFP + p19 |
| 7 | Negativ kontrol 2 | Tom -CFP + C-YFP + p19 |
| 8 | Negativ kontrol 3 | Tom -CFP + M-YFP + p19 |
Tabel 2: Konstruktionskombinationer, der anvendes i undersøgelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol viser brugen af BiFC-baseret FRET-FLIM-analyse til at fastslå dannelsen af etternært kompleks mellem to monomerer af et MADS-box protein og et calciumsensorprotein. Protokollen er tilpasset fra en rapport fra Y. John Shyu et al., hvor de har udviklet en BiFC-baseret FRET-metode til at visualisere ternary kompleks dannet mellem Fos-Jun heterodimers og NFAT eller p65 ved hjælp af den sensibiliserede emissionsmetode7. Tidligere, en tre-fluorophore FRET system blev udviklet af Galperin og kolleger i år 200429, men det kræver seks filtre, der indeholder en sofistikeret mikroskop setup. Også hurtig bevægelse af organeller, såsom endosomes, under billedopsamling pålagt eksperimentelle vanskeligheder. På den anden side bruger BiFC-baseret FRET-FLIM filtre til kun to fluorophorer og har en forenklet mikroskopopsætning. Denne opsætning giver mulighed for direkte visualisering af ternary komplekset, i modsætning til 3-FRET-systemet. Dette har også en fordel i forhold til BiFC-FRET-systemet ved at være mere robust og kvantitativ end FRET-målingerne, der involverer sensibiliseret emission7. I denne analyse måles fluorescens levetiden for individuelle fotoner til beregning af FRET effektivitetsgevinster, snarere end generelle ændringer i den relative fluorescens intensiteter af donor og acceptor molekyler. En anden fordel ved den FLIM-baserede metode i forhold til BiFC-FRET-metoden er, at kun donorens levetid skal måles. acceptens fluorescensemissions kvaliteter påvirker ikke resultatet af FRET-målingerne. Fordelene og enkelheden ved denne metode gør BiFC-baseret FRET-FLIM til en lettere, mere ligetil og mere kvantitativ metode til at studere trepartsinteraktioner. Men man skal have adgang til en confocal setup med puls lasere, hurtige detektorer i stand til enkelt foton optælling og en kompatibel software.
For at dette eksperiment kan lykkes, er det vigtigt, at samspillet mellem de to proteinpartnere, der anvendes i BiFC-kropsbygning, valideres ved hjælp af flere metoder og passende kontroller, før de bruges som FRET-acceptor. Det er tilrådeligt at bruge negative kontroller såsom en muteret form for interagerende partner eller et ikke-relateret colocalizing protein som en negativ interagerende partner16. De negative kontroller til validering af BiFC-interaktionerne mellem M- og C-proteiner, der anvendes i denne protokol, omfattede mutationer i disse proteiners putative bindingsdomæne, som helt afskaffede BiFC-signalet (supplerende figur 1). Desuden blev denne interaktion også valideret af Y2H- og FRET-metoder i forskellige systemer.
Også, tidsmæssig optimering af ekspression af proteiner i Nicotiana anbefales, således at de negative virkninger af overekspression af proteiner, som kan føre til falsk-positive resultater, kan minimeres. Det er også nødvendigt at medtage p19-stammen sammen med de agrobakterielle stammer, der indeholder konstruktioner for at forhindre post-transskriptionel genhæmning. p19 er en suppressor af genhæmning fra tomat busket stunt virus og øger transformation effektivitet op til 90%30. For nylig er der udviklet bedre versioner af fluorophorerne, nemlig m-turkis-SYFP2, SYFP2-mRFP og SCFP3a-SYFP2. Disse kan bruges som FRET-par afhængigt af deres egnethed til målsystemet og celletype11. FRET-FLIM-målingerne skal udføres i mindst ti celler for at opnå statistisk signifikante data. Hvor det er muligt, vil tilføjelsen af et større antal prøver i målingerne yderligere forbedre dataenes kvalitet og pålidelighed. Afhængigt af donorfluoriphe bør den matematiske model, der passer til dataene med fluorescensens levetidsforfaldskurven, vælges.
Den protokol, der er beskrevet her, er et kraftfuldt værktøj til at bestemme trepartsinteraktionerne i levende celler. Det hjælper med at bestemme den intracellulære placering af det interagerende kompleks, hvilket er vigtigt for at dechifrere funktionen og fysiologisk betydning af ethvert proteinkompleks. Det kan også løse den interagerende partners relative koncentrationer baseret på FRET-FLIM-dataene, der ikke kan belyses ved intensitetsmålingsmetoder alene10. Endeligt, BiFC baseret FRET-FLIM assay giver mulighed for at studere og karakterisere vigtige aspekter af trepartsprotein interaktioner, som kan udnyttes i dyr såvel som plantesystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
NB, GG, SB, KC oprigtigt takke University Grants Kommissionen (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE, og Rådet for Videnskabelig og Industriel Forskning (CSIR) for deres forskning stipendier. Vi anerkender heldigvis Department of Biotechnology (DBT), Government of India, Department of Science and Technology (DST-FIST), Indiens regering for finansiel støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
References
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
