Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatisert mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon ved hjelp av mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC)

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/62800
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 4, 1,2,6, 1,2,5, 3, 1,2,5
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan du bruker det mikrobielle mikrodropletkultursystemet (MMC) til å utføre automatisert mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon. MMC kan dyrke og underdyrke mikroorganismer automatisk og kontinuerlig og overvåke veksten på nettet med relativt høy gjennomstrømning og god parallellisering, noe som reduserer arbeids- og reagensforbruket.

Abstract

Konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetoder har vanligvis tungvinte operasjoner, lav gjennomstrømning, lav effektivitet og stort forbruk av arbeidskraft og reagenser. Videre har mikroplatebaserte dyrkingsmetoder med høy gjennomstrømning utviklet de siste årene dårlig mikrobiell vekststatus og eksperimenter parallellisering på grunn av lavt oppløst oksygen, dårlig blanding og alvorlig fordampning og termisk effekt. På grunn av mange fordeler med mikrodråper, for eksempel lite volum, høy gjennomstrømning og sterk kontrollerbarhet, kan den dråpebaserte mikrofluidiske teknologien overvinne disse problemene, som har blitt brukt i mange typer forskning på mikrobiell dyrking, screening og evolusjon med høy gjennomstrømning. Imidlertid forblir de fleste tidligere studier på scenen for laboratoriekonstruksjon og anvendelse. Noen sentrale problemstillinger, for eksempel høye operasjonelle krav, høy byggevansker og mangel på automatisert integrasjonsteknologi, begrenser den brede anvendelsen av mikrofluidisk dråpeteknologi i mikrobiell forskning. Her ble et automatisert Mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC) vellykket utviklet basert på mikrofluidisk dråpeteknologi, og oppnådde integrasjon av funksjoner som inokulasjon, dyrking, online overvåking, sub-dyrking, sortering og prøvetaking som kreves av prosessen med mikrobiell dråpekultivering. I denne protokollen ble wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 og en metanol-essensiell E. coli-stamme (MeSV2.2) tatt som eksempler for å introdusere hvordan du bruker MMC til å gjennomføre automatisert og relativt høy gjennomstrømning mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon i detalj. Denne metoden er enkel å betjene, bruker mindre arbeidskraft og reagenser, og har høy eksperimentell gjennomstrømning og god data parallellitet, som har store fordeler sammenlignet med konvensjonelle dyrkingsmetoder. Det gir en rimelig, driftsvennlig og resultatsikker eksperimentell plattform for vitenskapelige forskere å utføre relatert mikrobiell forskning.

Introduction

Mikrobiell dyrking er et viktig grunnlag for mikrobiologisk vitenskapelig forskning og industrielle anvendelser, som er mye brukt i isolasjon, identifisering, rekonstruksjon, screening og utvikling av mikroorganismer 1,2,3. Konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetoder bruker hovedsakelig reagensrør, risteflasker og faste plater som dyrkingsbeholdere, kombinert med ristende inkubatorer, spektrofotometere, mikroplatelesere og annet utstyr for mikrobiell dyrking, deteksjon og screening. Imidlertid har disse metodene mange problemer, for eksempel tungvinte operasjoner, lav gjennomstrømning, lav effektivitet og stort forbruk av arbeidskraft og reagenser. Dyrkingsmetodene for høy gjennomstrømning utviklet de siste årene er hovedsakelig basert på mikroplaten. Men mikroplaten har et lavt nivå av oppløst oksygen, dårlig blandingsegenskap og alvorlig fordampning og termisk effekt, noe som ofte fører til dårlig vekststatus og eksperimenter parallellisering av mikroorganismer 4,5,6,7; På den annen side må den være utstyrt med dyrt utstyr, for eksempel væskehåndteringsarbeidsstasjoner og mikroplatelesere, for å oppnå automatisert dyrking og prosessdeteksjon 8,9.

Som en viktig gren av mikrofluidisk teknologi har dråpemikrofluidikk blitt utviklet de siste årene basert på tradisjonelle mikrofluidiske systemer med kontinuerlig strømning. Det er en diskret strømningsmikrofluid teknologi som bruker to umiskjennelige væskefaser (vanligvis oljevann) for å generere dispergerte mikrodråper og operere på dem10. Fordi mikrodråper har egenskapene til lite volum, stort spesifikt overflateareal, høy intern masseoverføringshastighet og ingen krysskontaminering forårsaket av oppdeling, og fordelene ved sterk kontrollerbarhet og høy gjennomstrømning av dråper, har det vært mange typer forskning som bruker dråpemikrofluidisk teknologi i høygjennomstrømningsdyrking, screening og utvikling av mikroorganismer11 . Imidlertid er det fortsatt en rekke viktige problemer for å gjøre dråpemikrofluidisk teknologi popularisert og mye anvendt. For det første er driften av dråpemikrofluidikk tungvint og intrikat, noe som resulterer i høye tekniske krav til operatører. For det andre kombinerer mikrofluidisk dråpeteknologi optiske, mekaniske og elektriske komponenter og må assosieres med bioteknologiske applikasjonsscenarier. Det er vanskelig for et enkelt laboratorium eller team å bygge effektive mikrofluidiske dråpekontrollsystemer hvis det ikke er noe tverrfaglig samarbeid. For det tredje, på grunn av det lille volumet av mikrodråpe (fra picoliter (pL) til mikroliter (μL)), tar det mye vanskelig å realisere presis automatisert kontroll og sanntids online deteksjon av dråper for noen grunnleggende mikrobielle operasjoner som sub-dyrking, sortering og prøvetaking, og det er også vanskelig å konstruere et integrert utstyrssystem12.

For å løse problemene ovenfor ble et automatisk mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC) vellykket utviklet basert på dråpemikrofluidisk teknologi13. MMC består av fire funksjonelle moduler: en dråpegjenkjenningsmodul, en dråpespektrumdeteksjonsmodul, en mikrofluidisk brikkemodul og en prøvetakingsmodul. Gjennom systemintegrasjon og kontroll av alle modulene er automatisert operativsystem inkludert generering, dyrking, måling (optisk tetthet (OD) og fluorescens), splitting, fusjon, sortering av dråper nøyaktig etablert, og oppnår integrasjon av funksjoner som inokulasjon, dyrking, overvåking, sub-dyrking, sortering og prøvetaking som kreves av prosessen med mikrobiell dråpekultivering. MMC kan romme opptil 200 replikere dråpekultiveringsenheter med 2-3 μL volum, noe som tilsvarer 200 risteflaske dyrking enheter. Mikrodråpekultiveringssystemet kan tilfredsstille kravene til ikke-forurensning, oppløst oksygen, blanding og masseenergiutveksling under veksten av mikroorganismer, og møte de ulike behovene til mikrobiell forskning gjennom flere integrerte funksjoner, for eksempel vekstkurvemåling, adaptiv evolusjon, enkeltfaktoranalyse på flere nivåer og metabolittforskning og analyse (basert på fluorescensdeteksjon)13,14.

Her introduserer protokollen hvordan du bruker MMC til å utføre automatisert og mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon i detalj (figur 1). Vi tok wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 som et eksempel for å demonstrere vekstkurvemålingen og en metanol-essensiell E. coli-stamme MeSV2.215 for å demonstrere den adaptive utviklingen i MMC. En operasjonsprogramvare for MMC ble utviklet, noe som gjør operasjonen veldig enkel og tydelig. I hele prosessen må brukeren forberede den første bakterieløsningen, angi forholdene i MMC, og deretter injisere bakterieløsningen og relaterte reagenser i MMC. Deretter utfører MMC automatisk operasjoner som dråpegenerering, anerkjennelse og nummerering, dyrking og adaptiv evolusjon. Den vil også utføre online deteksjon (OD og fluorescens) av dråpene med høy tidsoppløsning og vise relaterte data (som kan eksporteres) i programvaren. Operatøren kan stoppe dyrkingsprosessen når som helst i henhold til resultatene og trekke ut måldråpene for etterfølgende eksperimenter. MMC er enkel å betjene, bruker mindre arbeidskraft og reagenser, og har relativt høy eksperimentell gjennomstrømning og god data parallellitet, som har betydelige fordeler sammenlignet med konvensjonelle dyrkingsmetoder. Det gir en rimelig, driftsvennlig og robust eksperimentell plattform for forskere å utføre relatert mikrobiell forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Instrument- og programvareinstallasjon

  1. Velg et rent og sterilt miljø (for eksempel en ren benk) som et dedikert permanent område for MMC. Installer MMC jevnt i rommet.
    MERK: Hold MMC unna forstyrrelser fra sterke elektriske felt, magnetfelt og sterke varmestrålingskilder. Unngå alvorlig vibrasjon fra å påvirke komponentene for optisk deteksjon. Gi strømforsyningen til AC220 V, 50 HZ til MMC. Hvis du vil ha mer informasjon om MMC, kan du se Innholdsfortegnelsen og webområdet for MMC16.
  2. Installere operasjonsprogramvaren fra MMC.zip filen
    MERK: Kontakt forfatterne av MMC.zip filen.
    1. Opprett en dedikert mappe og lagre ZIP-filen i den.
    2. Opprett en annen dedikert mappe som installasjonskatalogen. Pakk ut MMC.zip og lagre filene i den nye mappen.
      MERK: Datamaskinkonfigurasjonen er best å møte: (1) Windows 7 64-biters operativsystem eller nyere; (2) CPU: i5 eller over; (3) minne: 4 GB eller over; (4) harddisk: 300 GB eller høyere (rotasjonshastighet større enn 7200 rpm eller solid state-disk).

2. Forberedelser

  1. Koble sprøytenålen (indre diameter er 0,41 mm og ytre diameter er 0,71 mm), hurtigkobling A og reagensflaske (figur 2C), og autoklaver dem ved 121 °C i 15 minutter.
    MERK: Skru av lokket på reagensflasken litt under sterilisering. Noen flere reagensflasker kan tilberedes hver gang for bruk.
  2. Bruk et 0,22 μm polyvinyllidfluoridfilter (PVDF) til å filtrere MMC-olje. Sett den mikrofluidiske brikken (figur 2B) og MMC-oljen inn i den rene benken på forhånd og steriliser dem ved ultrafiolett bestråling i 30 minutter før bruk.
    MERK: For detaljer om hurtigkobling A, reagensflaske, MMC-olje og mikrofluidisk brikke, se materialtabellen.
  3. Installer mikrofluidisk brikke
    1. Åpne døren til betjeningskammeret (figur 2A) og løft den optiske fibersonden.
    2. Juster de elektriske felthullene etter de elektriske feltnålene og plasser brikken forsiktig på spon sokkelen. Sett deretter de to posisjoneringskolonnene inn i posisjoneringshullene og legg ned den optiske fibersonden (figur 2D).
    3. Koble hurtigkoblingen A på brikken til den tilsvarende porten i MMC i henhold til posisjonsnummeret (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Lukk deretter døren til operasjonskammeret.
  4. Etterfyll MMC-oljen (til ca. 80 ml) i oljeflasken og tøm avfallsvæsken i avfallsflasken før bruk.
    MERK: Avfallsvæsken er vanligvis organisk avfall. Se regional lov og forskrift ved avhending, med forbehold om endring basert på eksperimentelt oppsett.

3. Måling av vekstkurve i MMC

  1. Forberedelse for innledende bakteriell løsning
    1. Følg de relaterte standardforskriftene for å klargjøre Luria-Bertani (LB) medium og autoklav ved 121 °C i 15 minutter.
      MERK: Komponenter av LB medium: NaCl (10 g/L), gjærekstrakt (5 g/l) og trypton (10 g/l).
    2. Ta ut E. coli MG1655-stammen fra glyserolbestanden og dyrk den i en 50 ml risteflaske med 10 ml LB-medium i en ristende inkubator (200 rpm) ved 37 °C i 5-8 timer.
      MERK: Dyrkingstiden avhenger av de spesifikke stammene. Det er optimalt å dyrke stammen til den logaritmiske perioden/ fasen.
    3. Fortynn den kultiverte E. coli MG1655-løsningen med friskt medium til en OD600 på 0,05-0,1 for å oppnå en innledende bakterieløsning (lag ca. 10 ml).
  2. Klikk Initialisering for å initialisere MMC. Når initialiseringsgrensesnittet vises, angir du dyrkingstemperaturen som 37 °C og den fotoelektriske signalverdien som 0,6 (figur 3A). Initialisering vil ta ca 20 min.
  3. Slå på UV-lampen (bølgelengde 254 nm) under initialisering.
  4. Injiser den første bakterieløsningen og MMC-oljen i reagensflasken.
    1. Ta ut en sterilisert reagensflaske på den rene benken og stram hetten.
    2. Bruk en 10 ml steril sprøyte til å injisere 3-5 ml MMC-olje fra sprøytenålen på siderøret. Vipp og roter reagensflasken sakte for å få oljen til å infiltrere den indre veggen fullt ut.
    3. Injiser ca. 5 ml innledende bakterieoppløsning, og fyll deretter reagensflasken ved å injisere 5-7 ml olje igjen.
    4. Trekk ut den uavhengige hurtigkoblingen A, og sett hurtigkoblingen A på reagensflasken inn i hurtigkoblingen B for å fullføre prøveinjeksjonsoperasjonen (figur 4A).
  5. Vent til initialiseringen er avsluttet, og slå deretter av UV-lampen (bølgelengde 254 nm).
  6. Åpne døren til operasjonskammeret, og legg reagensflasken i metallbadet.
  7. Trekk ut C2-kontakten på brikken og hurtigkoblingen A på reagensflasken. Koble siderørkontakten på reagensflasken til C2-kontakten og den øverste rørkontakten til O2-kontakten. Lukk deretter døren til operasjonskammeret.
  8. Klikk på Vekstkurve for å velge funksjonen til vekstkurvemåling (figur 3A). I parameterinnstillingsgrensesnittet skriver du inn tallet som 15, slår på OD-deteksjonsbryteren og angir bølgelengden som 600 nm. Klikk på Start for å starte dråpegenerering. Det tar ca 10 min.
    MERK: Her refererer Tall til antall dråper som skal genereres. Bølgelengde refererer til bølgelengden til OD som skal oppdages. Still inn tall (maksimum 200) og bølgelengde (350-800 nm) i henhold til eksperimentkravene.
  9. Når et popup-vindu vises på hovedgrensesnittet som ber "Fjern reagensflasken mellom C2 og O2, klikk deretter på OK-knappen etter ferdigstillelse", åpne døren til operasjonskammeret for å ta ut reagensflasken og koble til C2- og O2-kontaktene.
  10. Lukk døren, og klikk på OK-knappen i popup-vinduet for å dyrke dråpene automatisk og oppdage OD-verdiene.
    MERK: MMC oppdager OD-verdien når dråpen passerer den optiske fibersonden. Derfor avhenger deteksjonsperioden av antall dråper som genereres.
  11. Når vekstkurven når den stasjonære fasen, klikker du dataeksportknappen for å eksportere OD-dataene. Velg datalagringsbanen og eksporter OD-verdien som er registrert under dyrkingsperioden i .csv format, som kan åpnes av passende programvare (f.eks. Bruk deretter en kartprogramvare (f.eks. EXCEL og Origin 9.0) til å tegne inn vekstkurven.
    MERK: Under dyrkingsprosessen er det mulig å klikke på dataeksporten når som helst for å eksportere OD-dataene til alle gjeldende dråper.

4. Adaptiv evolusjon i MMC

  1. Forberedelse for innledende bakteriell løsning
    1. Følg de relaterte standardforskriftene for å klargjøre de spesielle flytende medium og faste plater for MeSV2.2 og autoklaven ved 121 °C i 15 minutter.
      MERK: For komponentene i spesialmediet se tabell 1 og materialtabellen.
    2. Dyrk MeSV2.2 ved hjelp av den faste platen (diameter = 90 mm) i en 37 °C konstant temperaturinkubator i 72 timer. Velg deretter en uavhengig koloni og dyrk den i en 50 ml risteflaske med 10 ml av det spesielle flytende mediet i en ristende inkubator (200 rpm) ved 37 °C i 72 timer.
    3. Fortynn den kultiverte MeSV2.2-løsningen med mediet til en OD600 på 0,1-0,2 (sørg for at det totale volumet ikke er mindre enn 10 ml) og fortsett å dyrke det i risteflasken i 5 timer for å oppnå den første bakterieløsningen.
      MERK: MeSV2.2 er en metanol-essensiell E. coli-stamme . Det spesielle flytende mediet inneholder 500 mmol/l metanol, noe som er et sterkt stress for MeSV2.2, noe som resulterer i svært langsom vekst. Vær oppmerksom på at det å oppnå den første bakterieløsningen her er forskjellig fra det som er beskrevet i trinn 3.1.
  2. Initialiser MMC som forklart i trinn 3.2, 3.3 og 3.5.
  3. Ta ut to steriliserte reagensflasker, hvorav den ene er for den første bakterieløsningen, og den andre er for det friske mediet. Injiser den første bakterieløsningen (5 ml), friskt medium (12-15 ml) og MMC-olje i reagensflaskene som forklart i trinn 3.4.
    MERK: Ettersom adaptiv evolusjon er en langsiktig prosess som involverer flere sub-dyrkinger, lagre så mye friskt medium som mulig i MMC. Mediet kan ikke etterfylles under eksperimentet som kjører.
  4. Installer de to reagensflaskene i MMC som forklart i trinn 3.6. Installer den for den første bakterieløsningen mellom C2- og O2-kontakten og den andre for det friske mediet mellom C4- og O4-kontakten.
  5. Klikk på ALE for å velge funksjonen til adaptiv evolusjon (figur 3B). Slå på OD Detection-bryteren i grensesnittet for parameterinnstilling.
  6. Angi tallet som 50, bølgelengde som 600 nm, konsentrasjon som 0 %, type som tid, parameter som 30 t og repetisjoner som 99. Klikk på Start for å starte dråpegenerering. Det vil ta ca 25 min.
    MERK: Her refererer "Konsentrasjon" til maksimal konsentrasjon av kjemiske faktorer for adaptiv evolusjon. For forskjellige dråper er det realiserbart i MMC å introdusere forskjellige konsentrasjoner av kjemiske faktorer for å gi forskjellige vekstforhold. Beregn de introduserte konsentrasjonene ved hjelp av følgende ligning:
    Equation 1
    Her refererer "C" til konsentrasjonen av kjemiske faktorer introdusert i dråper; "a" refererer til konsentrasjonen av kjemiske faktorer i reagensflaskene mellom C4- og O4-kontakten; "b" refererer til konsentrasjonen av kjemiske faktorer i reagensflaskene mellom C6- og O6-kontakten; og "i" refererer til den tilgjengelige konsentrasjonen. Det er åtte konsentrasjoner tilgjengelig i MMC. Siden den kjemiske faktoren her har en enkelt konsentrasjon (500 mmol / l metanol) og det er en av ingrediensene i mediet, er bare en reagensflaske som inneholder den kjemiske faktoren installert her, og konsentrasjonen er satt til 0%. Type refererer til modusen for sub-dyrking, som er delt inn i tre typer: tidsmodus, OD-verdimodus og fluorescensmodus. Førstnevnte betyr å dyrke dråpene i en fast tid og deretter underdyrke, mens de to sistnevnte betyr å dyrke dråpene til forhåndsdefinert OD-verdi / fluorescensintensitet og deretter underdyrke. Parameter refererer til den relaterte parameteren som kreves når du velger en modus for underdyrking. Repetisjoner refererer til antall underdyrkinger.
  7. Fjern reagensflasken som er plassert mellom C2- og O2-kontakten, som forklart i trinn 3.8.
  8. Vær oppmerksom på om de maksimale OD-verdiene til dråpene i hver underdyrkingsperiode har økt betydelig. Hvis økningen skjer og oppfyller eksperimentkravene, klikker du på Dataeksport-knappen for å eksportere OD-dataene som forklart i trinn 3.9.
    MERK: Her avhenger underdyrkingsperioden av parameteren. Når du for eksempel angir Skriv som tid og parameter som 30 timer, er deldyrkingsperioden 30 timer. I løpet av hver underdyrkingsperiode er det de maksimale OD-verdiene til dråpene. Beregn om den adaptive utviklingen oppfyller eksperimentkravene ved å øke maksimale OD-verdier (Økningen avhenger av den faktiske dyrkingsprosessen av stammen, for eksempel økt med mer enn 20%).
    FORSIKTIG: Vær oppmerksom på om det lagrede friske mediet er oppbrukt. Hvis den betydelige økningen ikke har skjedd selv etter at mediet er utmattet, trekker du ut de bedre voksende dråpene og utfører en ny runde med adaptiv evolusjon.
  9. Pakk ut måldråpene fra MMC.
    1. Klikk på Screening-knappen for å velge funksjonen til dråpeuttrekking (figur 3C). Velg Samle alternativet , klikk på antall måldråper, og klikk deretter på OK.
      MERK: Dråpescreening inkluderer "Samle", "Kast" og "Trekk ut frøløsning". "Ekstraktfrøløsning" betyr å samle de resterende dråpene13 etter underdyrkingsoperasjonen.
    2. Vent til popup-vinduet spør: "Trekk ut CF-hurtigkontakten og sett den inn i EP-røret". Sett CF-hurtigkontakten inn i mikrosenterrøret for innsamling i henhold til programvareledeteksten, og klikk deretter på OK (figur 4D).
    3. Etter 1-2 min vil programvaregrensesnittet dukke opp et nytt vindu som spør: "Sett kontakten tilbake og klikk OK hvis du er ferdig". Sett deretter CF-hurtigkoblingen tilbake og klikk OK for å få MMC til å fortsette å kjøre (figur 4D). Når neste måldråpe når slippverktøygjenkjenningsstedet, gjentar du 4.9.2-4.9.3 for å hente det.
      MERK: Når alle måldråpene er samlet inn, vil MMC fortsette å dyrke de gjenværende dråpene. Hvis dyrkingen ikke er nødvendig, klikker du på Stopp for å avslutte operasjonen direkte.
    4. Trekk ut dråpen ved hjelp av en 2,5 μL pipette, slipp den på 90 mm agaroseplaten, og spre den jevnt med en trekantet glassspredningsstang med en sidelengde på 3 cm. Dyrk den deretter i en 37 °C konstant temperaturinkubator i 72 timer.
    5. Velg 3-5 uavhengige kolonier og dyrk dem separat i 50 ml risteflasker med 10 ml friskt medium i en ristende inkubator (200 rpm) ved 37 °C i 48-72 timer. Følg de relaterte standardforskriftene for å lagre den dyrkede bakterieløsningen i glyserolrøret for etterfølgende eksperimenter.

5. Rens MMC

  1. Etter at eksperimentet er fullført, klikker du på Stopp for å stoppe alle operasjonene. Klikk deretter på Rengjør for å rengjøre brikken og rørene. Det tar ca 15 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen bruker E. coli MG1655 og en MeSV2.2-stamme som eksempler for å demonstrere mikrobiell dyrking og metanol-essensiell adaptiv evolusjon med en automatisert og relativt høy gjennomstrømningsstrategi i MMC. Vekstkurvemålingen ble hovedsakelig brukt til å karakterisere mikrobiell dyrking. Den adaptive utviklingen ble utført av automatisert kontinuerlig sub-dyrking og legge til en høy konsentrasjon av metanol som selektivt trykk under hver sub-dyrking. Hvorvidt adaptiv evolusjon hadde blitt realisert ble estimert gjennom variasjonstrenden for maksimal OD-verdi av dråpene i hver underdyrkingsperiode. De justerbare parameterne og nøyaktighetsparameterne for MMC vises i tabell 2.

Resultater av vekstkurvemåling
OD600-verdiene til de 15 dråpene som ble oppdaget under dyrkingsprosessen, ble eksportert fra MMC etter dyrking i ca. 20 timer (figur 5A). Det kan observeres at deteksjonen ble utført omtrent hvert 14. Denne deteksjonsperioden avhenger av antall dråper som genereres fordi dråpene er syklet frem og tilbake i rørene for dyrking, og deteksjonsmodulen oppdager bare OD-verdiene (deteksjon og beregning av OD-verdi vises i Supplerende figur 1) når dråpene passerer den optiske fibersonden. Derfor er 14 min en svært kort deteksjonsperiode, noe som gir en høy tidsoppløsningsdeteksjonsprosess for å gjenspeile veksten av mikroorganismer mer nøyaktig.

Ifølge de eksporterte dataene ble gjennomsnittlig OD600-verdier og standardavvik (SD) på 15 dråper ved hvert tidspunkt beregnet, og vekstkurven til E. coli MG1655 ble plottet inn (figur 5B). Resultatene viser at vekstkurven presenterer en "S" -form, inkludert lagfase, logaritmisk fase og stasjonær fase, som er svært i samsvar med den klassiske mikrobielle vekstmodellen. Samtidig er standardavvikene på 15 dråper svært små, noe som indikerer god vekstkonsistens og parallellitet. Dermed demonstrerer den fullt ut den gode mikrobielle dyrkings- og deteksjonsytelsen til MMC. Videre ble det også bekreftet at det er liten krysstale mellom dråper under dyrking (Supplerende figur 2 og supplerende tabell 1).

Resultater av adaptiv evolusjon
Vi har utført en langsiktig adaptiv utvikling av MeSV2.2 i MMC. på den 18dagen , i henhold til den økende trenden med de maksimale OD600-verdiene til dråpene i hver sub-dyrkingsperiode fra vekstkurvene som vises på programvaregrensesnittet, trodde vi at en god adaptiv evolusjon ble oppnådd i de 50 dråpene. OD600-dataene ble eksportert og 8 dråper (inkludert dråpe 6) med relativt god vekstytelse ble hentet ut13. Figur 6A viser vekstkurvene til 50 dråper i hele den adaptive utviklingsprosessen. På 18 dager har MMC automatisk utført 13 underdyrkingsoperasjoner. Det kan sees fra figur 6A at MeSV2.2 vokser sakte først og raskt etterpå, noe som indikerer sporet av adaptiv evolusjon i MeSV2.2. For å levere et utvalgstrykk ble metanol lagt til MeSV2.2-mediet. I utgangspunktet hemmet metanol cellevekst. Etter den adaptive utviklingen hadde de berikede cellene tilpasset metanol en høyere vekstrate. Vekstkurven for dråpe 6 i hele den adaptive utviklingsprosessen ble plottet separat (figur 6B). De maksimale OD600-verdiene i første generasjon og siste underdyrkingsperiode var henholdsvis 0,37 og 0,58, økt med 56,8 %. Det indikerer at belastningen i dråpe 6 har realisert en åpenbar adaptiv evolusjon.

Deretter ble dråpe 6-stammen og den første belastningen i risteflasker dyrket, og vekstkurvene ble sammenlignet (figur 6C). I henhold til metodene gitt i litteraturen 17,18 ble de maksimale spesifikke vekstratene (μmaks) av dråpe 6-stammen og den første stammen beregnet, som var henholdsvis 0,096 h-1 og 0,072 h-1. Figur 6C viser at dråpe 6-stammen viste en høyere maksimal spesifikk vekstrate (økende med 54,8%) og hadde en høyere cellekonsentrasjon i den stasjonære fasen (økende med 20,0%) enn den første stammen når den ble dyrket i risteflasker, noe som ytterligere antydet at den adaptive utviklingen i MeSV2.2 har blitt realisert.

Figure 1
Figur 1: Total arbeidsflyt for vekstkurvemåling og adaptiv utvikling i MMC. (A) Måling av vekstkurve i MMC. For det første, dyrk belastningen i risteflaske for å forberede den første bakterielle løsningen. Injiser deretter den første bakterieoppløsningen i reagensflasken. Deretter genererer du slippverktøyene i MMC. MMC får dråpene til å sykle frem og tilbake i mikrofluidisk brikke og rør for å dyrke dem. Når dråper passerer deteksjonsstedet, blir OD-dataene oppdaget og registrert. Til slutt eksporterer du dataene for analyse. (B) Adaptiv utvikling i MMC. Velg en enkelt koloni fra agaroseplaten og dyrk den i en risteflaske for å forberede den første bakterielle løsningen. Etter å ha injisert den første bakterieløsningen i reagensflasken, utfør den adaptive utviklingen i MMC. Adaptiv evolusjon innebærer kontinuerlig sub-dyrking, som automatisk kan betjenes gjennom dråpesplitting og fusjon. Etter den adaptive utviklingen eksporterer du dataene for analyse. Måldråper kan ekstraheres og deretter spres på platen for å oppnå enkle kolonier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Struktur og viktige verktøy i MMC. (A) Eksternt og operasjonskammer i MMC. (B) Den mikrofluidiske brikken til MMC. Brikken har syv kanaler (C1-C6 og CF). (C) Reagensflaske. Den har et topprør og et siderør. Før du injiserer prøven i reagensflasken, må den koble en sprøytekanyle til en hurtigkontakt A først og deretter koble hurtigkontakten A til siderøret. (D) Installasjon av mikrofluidisk brikke. Den mikrofluidiske brikken er installert på sokkelen. Deretter er de syv kanalene (C1-C6 og CF) henholdsvis koblet til de tilsvarende portene i MMC (O1-O6 og OF).

1 - Operasjonskammeret i MMC.
2 - Oljeflaske som inneholder MMC-oljen.
3 - Avfallsflaske for innsamling av avfallsvæske.
4 - UV-lampe (bølgelengde 254 nm) for sterilisering. Denne lampen kan slås på på forhånd for å sterilisere brikken og rørene.
5 - Laser (620 nm) for dråpegjenkjenning. Punktet der laseren bestråles på brikken er dråpegjenkjenningsstedet.
6 - Temperatursonde for å måle temperaturen inne i betjeningskammeret.
7 - Varmeapparat for betjeningskammeret. Den kan brukes til å opprettholde temperaturen i mikrobiell dyrking. Temperaturområdet som kan stilles inn er 25 ± 0,5 °C til 40 ± 0,5 °C.
8 - Optisk fibersonde for å måle OD eller fluorescens av dråper.
9 - Chip pidestall for å installere mikrofluidisk brikke.
10 - Metallbad for å fikse reagensflaskene og varme dem for raskt å øke temperaturen på et reagens til temperaturen på mikrobiell dyrking.
11 - Porter for mikrofluidisk brikke (O1-O6 og OF). Den mikrofluidiske brikken er koblet til MMC gjennom disse portene.
12 - Rør for dråpelagring og dyrking.
13 - Magnetblokker for raskt å finne mikrofluidisk brikke under installasjonen.
14 - Sprøytenålen for å injisere prøvene i reagensflaskene. Den indre diameteren er 0, 41 mm, og den ytre diameteren er 0, 71 mm.
15 - Hurtigkobling A. Koble til med hurtigkobling B.
16 - Hurtigkobling B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Grensesnittet for operasjonsprogramvare i MMC. (A) Hovedgrensesnittet til programvaren. (1) Temperatur i betjeningskammeret. (2) Fotoelektrisk signalverdi for dråpegjenkjenning. Når dråpen passerer, er signalverdien høy (>2 V). Når oljen passerer, er signalverdien lav (<1 V). (3) Funksjonsvalg. Det er fire funksjoner å velge mellom: vekstkurvemåling (Vekstkurve), adaptiv laboratorieutvikling (ALE), enkeltfaktoranalyse på flere nivåer (enfaktor) og tilpasning av operasjonene i henhold til eksperimentelle behov (Tilpasning). (4) Grensesnitt for parameterinnstilling. Angi de tilsvarende eksperimentelle parametrene her etter at du har valgt en funksjon. (5) Kommandokjøringsområde. (6) Bryter av kamera. Kameraet er installert rett over brikken, som kan brukes til å observere dråpene i brikken online. (7) Prosess visningsområde. Viser kjøretid, overvåking av data og operasjonen som utføres. (B) Parameterinnstillingsgrensesnittet for adaptiv evolusjon. (C) Grensesnittet for dråpescreening. MMC kan nummerere slippverktøyene automatisk. Her kan måldråpene velges og trekkes ut fra MMC. (D) Kameraobservasjonsgrensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Prøveinjeksjon, dråpegenerering og dråpeutvinning. (A) Reagensflasken etter injeksjon av bakterieoppløsning og MMC-olje. Både bakterieløsningen og MMC-oljen injiseres fra siderøret. Oljefasen er i det øvre laget og bakterieoppløsningen er i underlaget. Etter injeksjonen kobler du hurtigkontakten A og B, og deretter installerer du den i MMC. (B) Dråpegenerering i mikrofluidisk brikke. For å forbedre synligheten av dråper ble en rød pigmentløsning brukt til å demonstrere prosessen med dråpegenerering. (C) Dråpe lagret i røret observert av mikroskop. Skalalinje: 400 μm. (D) Popup-vindusmeldinger og de tilsvarende operasjonene. Når ledeteksten "Trekk ut CF-hurtigkoblingen og sett den inn i EP-røret" vises, trekk ut CF-kontakten og sett den inn i EP-røret for å samle måldråpen; Når ledeteksten " Sett kontakten tilbake" vises, er dråpesamlingen fullført, sett CF-kontakten tilbake i OF-porten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Dataeksport og figurtegning av vekstkurve. (A) Skjermbilde av en del av de eksporterte dataene. De eksporterte dataene inkluderer hvert deteksjonstidspunkt for de 15 genererte slippverktøyene og de tilsvarende OD600-verdiene. (B) Vekstkurven til E. coli MG1655 plottet basert på de eksporterte dataene. Beregn gjennomsnittlig OD600-verdier og standardavvik (SD) på 15 dråper ved hvert tidspunkt, og tegn inn vekstkurven. Det er klart å se at denne vekstkurven inkluderer oppholdsfasen, logaritmisk fase og stasjonær fase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Resultater av den adaptive utviklingen av MeSV2.2 i MMC. (A) Vekstkurver på 50 dråper i hele den adaptive utviklingsprosessen. OD600-deteksjonsdataene for 50 dråper i løpet av den 18-dagers adaptive utviklingsprosessen ble eksportert fra MMC og plottet inn. dagen ble 8 dråper, inkludert dråpe 6, ekstrahert. (B) Vekstkurven til dråpe 6 i hele den adaptive utviklingsprosessen. De maksimale OD600-verdiene i første generasjon og siste underdyrkingsperiode var henholdsvis 0,37 og 0,58, økt med 56,8 %. (C) Sammenligning av dråpe 6 belastning og den første belastningen i risteflasken. Belastningen av dråpe 6 og den første stammen ble dyrket i risteflasker, og vekstkurvene (inkludert SD, n = 3) ble målt. Denne figuren er endret fra Jian X. J. et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Komponenter Konsentrasjon
Na2HPO4·12H2O 6,78 g/l
KH2Po4 3 g/l
NaCl 0,5 g/l
NH4Cl 1 g/l
vitamin B1 (sterilisert ved filtrering) 0,34 g/l
MgSO4·7H2O 0,049 g/l
CaCl2·2H2O 1,5 mg/l
Mikroelementer:
FeCl3·6H2O 0,5 mg/l
ZnSO4·7H2O 0,09 mg/l
CuSO4·5H2O 0,088 mg/l
MnCl2 0,045 mg/l
CoCl2·6H2O 0,09 mg/l
glukonat 1,09 g/l
metanol 500 mmol/l
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside 0,1 mmol/l
streptomycinsulfat 20 μg/ml
kanamycinsulfat 50 μg/ml
Tilsett ekstra 15 g/l agarose for å forberede et fast medium.

Tabell 1: Komponenter i spesialmediet for MeSV2.2.

Justerbare parametere
Parameter Rekkevidde
Dyrkingstemperatur 25–40 °C ± 0,5 °C
Antall dråper 0–200
Konsentrasjon av inokulum 13.3–86.7 %
Konsentrasjon av kjemisk faktor 8 forskjellige konsentrasjoner, opp til maksimal konsentrasjon av lagret kjemisk faktor
Tidspunktet for sub-dyrking Opp til brukeren
Antall underdyrkinger Opp til brukeren
Bølgelengde for OD-deteksjon 350–800 nm
Bølgelengde av fluorescensdeteksjon Eksitasjon: 470, 528 nm
Utslipp: 350–800 nm
Parametere for nøyaktighet
Parameter C.V
Volum av dråper 1.88%
Konsentrasjon av inokulum < 5,0 %

Tabell 2: Justerbare parametere og nøyaktighetsparametere for MMC. Justerbare parametere refererer til parametrene som kan justeres i henhold til brukernes spesifikke krav; nøyaktighetsparametere refererer til parametrene som gjenspeiler nøyaktigheten og reproduserbarheten til de forskjellige fluidiske operasjonene.

Supplerende figur 1: Gjenkjenning og påvisning av dråper i MMC. (A) Bølgeformen til et slippverktøy i MMC. Denne bølgeformen kommer fra de rå spektraldataene til MMC-spektrometeret. Etter å ha behandlet rå spektraldata i bakgrunnen, vil MMC gi den målte OD-verdien. (B) OD-beregning av dråper i MMC. I bølgeformen til dråpen representerer 'a' maksimal lengde på dråpen, 'c' representerer det bueformede grensesnittet dannet av oljefase og vannfase, og 'b' representerer hoveddelen av dråpen. Basert på Lambert-Beer-loven beregnes OD-verdien av dråpen ved hjelp av følgende formel: OD-verdi = lg (E / D) × 10. "E" refererer til den gjennomsnittlige spektralsignalverdien av oljefasen; 'D' refererer til den gjennomsnittlige spektralsignalverdien til hoveddelen b av dråpen. Det skal bemerkes at OD-verdien målt ved MMC er forskjellig fra den som måles av et spektrofotometer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Test av krysstale mellom dråpene. For å verifisere om det er krysstale mellom dråpene under langvarig dyrking, ble E. coli MG1655-løsningen fortynnet til en svært lav konsentrasjon (ifølge Poisson-distribusjonen ble λ = 0,1), og deretter ble 200 dråper generert og dyrket i 5 dager. Etter måling av OD ble det funnet at E. coli MG1655 vokste i et lite antall dråper. Og det var nesten ingen bakterievekst i dråpene rundt disse dråpene. Resultatet viser også foreløpig at det er liten krysstale mellom dråper. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 1: Stabilitet for dråpegenerering i MMC. Som vist i supplerende figur 1, har dråpen en fast bølgeform. Spektrometeret i MMC genererer et visst antall datapunkt per sekund, slik at antall datapunkter i dråpebølgeformen kan gjenspeile størrelsen på slipplet. Den røde fargestoffløsningen ble brukt til å generere 397 dråper i MMC, og OD-verdien ble målt. De rå spektraldataene ble eksportert, datapunktene for hver dråpebølgeform ble talt, og variasjonskoeffisienten (C.V) for dråpedatapunktene ble beregnet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: Fordampning av dråpe i MMC. Her ble den røde fargeløsningen brukt til å generere dråper i MMC og dråpene ble lagret i dyrkingsrøret. Røret ble deretter plassert i en 37 °C konstant temperaturinkubator i 30 dager, og dråpelengden ble regelmessig målt (ta bilder under et mikroskop og mål lengden med en skalastang). Det viser at volumet av dråpen ble redusert med ca 12,3% etter 30 dager, noe som indikerer at fordampning av dråpen er svært liten i MMC. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen presenterer hvordan du bruker det mikrobielle mikrodropletkultursystemet (MMC) til å utføre automatisert mikrobiell dyrking og langsiktig adaptiv evolusjon. MMC er et miniatyrisert, automatisert og mikrobielt dyrkingssystem med høy gjennomstrømning. Sammenlignet med konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetoder og instrumenter med høy gjennomstrømning, har MMC mange fordeler som lavt arbeids- og reagensforbruk, enkel drift, online deteksjon (OD og fluorescens), datainnsamling med høy tidsoppløsning og overlegen parallellisering. MMC har også noen spesielle fordeler forskjellig fra den konvensjonelle mikrofluidiske dråpeteknologien, som vanligvis bruker pL- og nL-dråpene. De fleste tidligere rapporterte systemer som brukte pL- og nL-dråper har dårlig dyrkingsytelse og få påvisbare parametere (vanligvis bare fluorescens)18,19,20,21. Selv om det har vært noen plattformer som kan oppnå bedre dyrkingsytelse og flere parameterdeteksjon, er det vanskelig og krever mye innsats. For eksempel rapporterte noen forskere OD-deteksjon av pL-dråper. Den er basert på bildegjenkjenning, som ikke bare har falske positiver, men også trenger ytterligere verifisering av nøyaktighet22. MMC kan imidlertid utføre disse på en relativt enkel måte. MMC bruker mikroliterdråper (μL) som sjelden rapporteres. Den overlegne mikrobielle dyrkingsytelsen til MMC er verifisert, og den kan også direkte oppdage OD og fluorescens. På grunn av det store volumet av μL-dråpene er dråpegenereringen mindre utsatt for forstyrrelser, noe som har høyere stabilitet. I mellomtiden kan mer varierte operasjoner utføres i mikroliterdråpene, noe som bidrar til realisering av automatiserte operasjoner. Videre, fordi dråpene er kapslingsrom, kan innholdets volatilitet undertrykkes (Supplerende tabell 2), noe som bidrar til å utføre langsiktig mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon når flyktige stoffer eksisterer i mellom14. Dette er vanskelig å oppnå i risteflasker og mikroplater.

Imidlertid er visse kritiske punkter i protokollen verdt å understreke. For det første bør det bemerkes at OD-verdien målt ved MMC er forskjellig fra et spektrofotometer fordi deres optiske banelengder på OD-måling er forskjellige (henholdsvis 1 mm og 10 mm). Derfor, når du sammenligner OD-verdien til MMC med shake-kolben, er det nødvendig å måle kalibreringskurven13. Heldigvis krever ikke den adaptive utviklingsprosessen kalibreringskurver fordi vi fokuserer på de relative trendene blant vekstkurvene. Deretter er visse mikroorganismer ukulturerte i MMC. Dråpene er avhengige av overflatespenningen til olje-vann-grensesnittet for å opprettholde stabilitet23. Hvis mikroorganismer produserer visse stoffer som forstyrrer overflatespenningen i olje-vann-grensesnittet, for eksempel noen Bacillus subtilis stammer som produserer overflateaktive stoffer24, kan dråpene ikke opprettholde stabilitet. Videre, hvis mediet selv er et hinder for generering av dråper, er det ikke levedyktig å brukes i MMC, for eksempel veldig viskøs medium eller medium som inneholder store partikler. For tiden inkluderer arten vi har dyrket i MMC E. coli, Lactobacillus plantarum, Corynebacterium glutamicum, gjær, Methylobacterium extorquens, Aspergillus oryzae, mikroalger og så videre. Det anbefales å dyrke belastningen i MMC for foreløpig eksperiment. Til slutt må kontaktene og portene mellom brikken, reagensflasken og MMC kobles til i henhold til protokollen. Ellers kan bakterieløsningen strømme inn i MMC og forurense interiøret. I tillegg må det påpekes at den nåværende gjennomstrømningen av MMC er begrenset (0-200), på grunn av tiden det tar for driften av underdyrking. I fremtiden vil vi optimalisere kontrollprogramvaren og størrelsen på brikken for å forkorte tiden og forbedre gjennomstrømningen. Siden MMC er et modulært system, må bare relaterte deler eller programvare byttes ut uten krav til nytt utstyr.

For tiden kan MMC ikke bare utføre vekstkurvemåling, adaptiv laboratorieutvikling og enkeltfaktoranalyse på flere nivåer, men også brukes til å tilpasse forskjellige dråpeoperasjonsprosedyrer for å møte eksperimentelle behov. I fremtiden er det nødvendig å berike MMC-systemets applikasjonsfunksjoner ytterligere som svar på de forskjellige behovene til mikrobiell forskning, for eksempel å gjennomføre flerfaktors ortogonale eksperimenter på flere nivåer, multi-sample automatisk prøvetakingsteknologi for samtidig å måle vekstkurvene til flere bakteriearter, og nøyaktig oppdage og kontrollere flere parametere (f.eks. oppløst oksygen (DO) og pH). Samtidig er det også nødvendig å utvikle flere funksjoner innen mikrobiologi for å bruke MMC på mer praktiske scenarier, for eksempel optimalisering av middels komposisjoner, bestemmelse av minimum hemmende konsentrasjon (MIC), kokultivering av mikroorganismer25, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project of the National Natural Science Foundation of China (21627812) og Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi takker også prof. Julia A. Vorholt (Institutt for mikrobiologi, Institutt for biologi, ETH Zürich, Zürich 8093, Sveits) for levering av metanol-essensielle E. coli-stammen versjon 2.2 (MeSV2.2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PVDF filter membrane Merck Millipore Ltd. SLGPR33RB Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator Haier BCD-289BSW For reagent storage
Agar Becton, Dickinson and Company 214010 For solid plate preparation
CaCl2·2H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20011160 Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. DL-CJ-INDII For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10007216 Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer Lenovo E450 Software installation and MMC control
Constant temperature incubator Shanghai qixin scientific instrument co., LTD LRH 250 For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10008218 Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance OHAUS AR 3130 For reagent weighing
EP tube Thermo Fisher 1.5 mL For droplet collection
FeCl3·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10011928 Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube Thermo Fisher 2.0 mL For strain preservation
Gluconate Sigma-Aldrich S2054 Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol GENERAL-REAGENT G66258A For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot SANYO Electric MLS3020 For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) Biotopped 420322 Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate Solarbio K8020 Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4 MACKLIN P815661 Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol MACKLIN M813895 Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O BIOBYING 1305715 Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-I Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-ALE-OD For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-M/S-OD The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20026118 Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl GENERAL-REAGENT G81793J Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O GENERAL-REAGENT G10267B Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10001518 Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish Corning Incorporated 90 mm For the preparation of solid medium
Pipette eppendorf 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL For liquid handling
Quick connector A Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. — For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-PCB Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask Union-Biotech 50 mL For microbial cultivation
Shaking incubator Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. SKY-210 2B For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate Solarbio S8290 Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD 10 mL Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle OUBEL Hardware Store 22G Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone Oxoid Ltd. LP0042 Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator SANYO Ultra-low MDF-U4086S For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer General Electric Company Ultrospec 3100 pro For the measurement of OD values
Vitamin B1 Solarbio SV8080 Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract Oxoid Ltd. LP0021 Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10024018 Component of the special medium for MeSV2.2.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).

Tags

Bioengineering Utgave 180 mikrobielt mikrodropletkultursystem automatiserte operasjoner høy gjennomstrømning mikrobiell dyrking adaptiv laboratorieutvikling online deteksjon
Automatisert mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon ved hjelp av mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jian, X., Guo, X., Wang, J., Tan, Z. … More

Jian, X., Guo, X., Wang, J., Tan, Z. L., Xing, X. h., Wang, L., Zhang, C. Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC). J. Vis. Exp. (180), e62800, doi:10.3791/62800 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter