Summary
Denne protokol præsenterer en teknik til kortlægning i høj opløsning af replikationssteder i strukturelt bevaret kromatin in situ , der anvender en kombination af præindlejring af EdU-streptavidin-Nanogold-mærkning og ChromEMT.
Abstract
Principper for DNA-foldning i cellekernen og dens dynamiske transformationer, der forekommer under opfyldelsen af grundlæggende genetiske funktioner (transkription, replikation, adskillelse osv.), Forbliver dårligt forstået, delvis på grund af manglen på eksperimentelle tilgange til visualisering i høj opløsning af specifikke kromatinlodi i strukturelt bevarede kerner. Her præsenterer vi en protokol til visualisering af repliktive domæner i monolagscellekultur in situ ved at kombinere EdU-mærkning af nysyntetiseret DNA med efterfølgende etiketdetektion med Ag-amplifikation af Nanogold-partikler og ChromEM-farvning af kromatin. Denne protokol giver mulighed for høj kontrast, højeffektiv forindlejringsmærkning, kompatibel med traditionel glutaraldehydfiksering, der giver den bedste strukturelle bevarelse af kromatin til rumtemperaturprøvebehandling. En anden fordel ved forindlejring af mærkning er muligheden for at forudvælge celler af interesse for sektionering. Dette er især vigtigt for analysen af heterogene cellepopulationer samt kompatibilitet med elektrontomografimetoder til højopløselig 3D-analyse af kromatinorganisation på replikationssteder og analysen af postreplikativ kromatinomlejring og søsterkromatidsegregering i interfasen.
Introduction
DNA-replikation er en grundlæggende biologisk proces, der kræves for trofast kopiering og transmission af den genetiske information under celledeling. I højere eukaryoter udsættes DNA-replikation for tæt rumlig-tidsmæssig regulering, hvilket manifesteres i sekventiel aktivering af replikationsoprindelse1. Nabo replikation oprindelser affyring synkront danner klynger af replikoner2. På niveau med optisk mikroskopi detekteres steder med igangværende DNA-replikation som replikationsfokus af forskellig antal og størrelse. Replikationsfoci viser specifikke mønstre af rumlig fordeling i cellekernen afhængigt af replikationstidspunktet for det mærkede DNA 3,4, som igen er tæt korreleret med dets genaktivitet. Takket være veldefineret sekvens af DNA-replikation, strengt ordnet i rum og tid, er replikativ mærkning en kraftfuld metode til præcis DNA-mærkning ikke kun til undersøgelse af replikationsprocessen i sig selv, men også til at diskriminere en specifik DNA-underfraktion med defineret transkriptionsaktivitet og komprimeringsniveau. Visualisering af replikerende kromatin udføres normalt ved påvisning af vigtige proteinkomponenter i DNA-replikationsmaskiner (enten ved immunstainering eller ved ekspression af fluorescerende proteinmærker 5,6) eller ved inkorporering af modificerede DNA-synteseprækursorer 7,8,9,10 . Af disse er det kun metoder baseret på inkorporering af modificerede nukleotider i nyligt replikeret DNA, der muliggør indfangning af konformationsændringer i kromatin under replikation og sporer opførelsen af repliktive domæner, efter at deres replikation er afsluttet.
I højere eukaryoter tilføjer DNA-emballering i kromatin et andet niveau af kompleksitet til reguleringen af grundlæggende genetiske funktioner (transkription, replikation, reparation osv.). Kromatinfoldning påvirker DNA's tilgængelighed til regulatoriske transfaktorer og DNA-konformationsændringer (dobbelt helix-afvikling), der kræves til skabelonsyntesen. Derfor er det almindeligt accepteret, at DNA-afhængige syntetiske processer i cellekernen kræver en strukturel overgang af kromatin fra dets kondenserede, undertrykkende tilstand til en mere tilgængelig, åben konformation. Cytologisk defineres disse to kromatintilstande som heterochromatin og euchromatin. Der er dog stadig ingen konsensus om tilstanden af DNA-foldning i kernen. Hypoteserne spænder fra en "polymersmelte" model11, hvor nukleosomal fiber opfører sig som en tilfældig polymer, for hvilken pakningstætheden styres af faseseparationsmekanismer, til hierarkiske foldemodeller, der postulerer sekventiel dannelse af kromatinfiberlignende strukturer med stigende tykkelse12,13. Hierarkiske foldemodeller fik for nylig støtte fra molekylære tilgange baseret på analysen af in situ DNA-DNA-DNA-kontakter (kromosomkonformationsfangst, 3C), der demonstrerer eksistensen af hierarkiet af kromatinstrukturelle domæner14. Det er vigtigt at bemærke, at replikationsenheder korrelerer meget godt med disse kromatindomæner15. Den største kritik af disse modeller er baseret på potentiel kunstig kromatinaggregering forårsaget af prøveforberedelsesprocedurer, såsom permeabilisering af cellemembraner og fjernelse af ikke-kromatinkomponenter, for at forbedre kromatinkontrasten til ultrastrukturelle undersøgelser og samtidig forbedre kromatintilgængeligheden for forskellige sonder (f.eks. Antistoffer). Nylige tekniske fremskridt inden for selektiv DNA-farvning til elektronmikroskopi ved DNA-bindende fluorofor-medieret fotooxidation af diaminobenzidin (ChromEMT6) har gjort det muligt at fjerne denne hindring. De samme overvejelser gælder dog for elektronmikroskopivisualisering af replikerende DNA 17,18. Her beskriver vi en teknik, der muliggør samtidig ultrastrukturel kortlægning i høj opløsning af nysyntetiseret DNA og total kromatin i intakte aldehyd-tværbundne celler. Teknikken kombinerer påvisning af EdU-mærket DNA ved click-kemi med biotinylerede sonder og streptavidin-nanogold og ChromEMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er optimeret til klæbende celler og blev testet på HeLa-, HT1080- og CHO-cellelinjer.
1. Cellemærkning og fiksering
- Pladeceller på syrerengjorte dæksedler i en 3 cm petriskål. Dyrk cellerne i de medier, der anbefales til cellelinjen, der bruges til 70% sammenflyd.
- Der tilsættes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridin) fra 10 mM stam til 10 μM endelig koncentration, og cellerne anbrings i inkubatoren i 10 minutter eller længere (afhængigt af forsøgsmålet). For kortere impulser (op til 2 minutter) skal du forberede en petriskål med forvarmede friske kulturmedier suppleret med 10 μM EdU og overføre dæksler i den i stedet for at tilføje EdU direkte til cellerne.
BEMÆRK: Alle efterfølgende trin udføres ved stuetemperatur, hvis ikke andet er angivet. - Fastgør de mærkede celler med 2,5% glutaraldehyd, frisklavet ved fortynding af 25% lager i 100 mM cacodylatbuffer, i 1 time.
BEMÆRK: De efterfølgende EdU-detektionstrin er følsomme over for fikseringstidspunktet. Længere fikseringstider kan påvirke EdU-mærkningen negativt og forårsage lavere signal-støj-forhold. - Fjern glutaraldehyd ved at vaske prøverne med PBS suppleret med 5 mMMgCl2 (PBS* derefter). Vask tre gange med en 10 minutters inkubation for hver vask.
- Permeabilisere plasmamembraner med 1% Triton X-100 i PBS* (PBS*T derefter). Vask to gange med en 5 minutters inkubation for hver vask.
- Vask prøven grundigt med PBS*. Udfør fem ændringer og inkuber i 5 minutter i hver ændring.
- Sluk de resterende frie aldehydgrupper med 20 mM glycin i PBS*, to gange i 10 minutter hver.
- Bloker prøverne i 1% BSA i PBS* i 30 min.
2. Klik-reaktion
BEMÆRK: Denne procedure er ændret fra en tidligere offentliggjort protokol19.
- Umiddelbart før brug fremstilles klikreaktionsblanding til EdU-detektion: I et mikrocentrifugerør blandes 430 μL 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL 100 mM CuSO4, 1,2 μL biotinazid (10 mM i DMSO) og 50 μL 0,5 M ascorbinsyre. Til kvalitetskontrol af den repliktive mærkning og klikprocedure på niveau med fluorescerende mikroskopi kan biotinazid erstattes af AlexaFluor 488-azid.
BEMÆRK: Rækkefølgen af tilsætning af komponenter i ovenstående reaktion er vigtig. - Udfør klikreaktion i et fugtigt kammer for at minimere fordampnings- og koncentrationsforskydningerne i reaktionscocktailen. Forbered det fugtige kammer ved at placere et vådt ark filterpapir på bunden af petriskålen og dække det med en paraffinfilm. Placer dæksedlerne på filmens overflade med cellerne vendt op, og læg 50-100 μL af reaktionscocktailen på dækslippet. Reaktionen tager 30 minutter ved stuetemperatur.
- Stop reaktionen ved at vaske prøven i 0,1 % Triton X-100 i PBS* (PBS*T), fem gange i 5 minutter hver.
- Bloker i 1% BSA i PBS * T i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered streptavidin-Nanogold-opløsning med PBS*T indeholdende 1% BSA. Inkuber prøven med streptavidin, konjugeret med 1,4 nm Nanogold-partikler (Nanoprober) i 1% BSA + PBS*T natten over ved +4 °C i det nyfremstillede fugtige kammer.
- Stop reaktionen, og vask prøven i PBS*T, fem gange i 10 minutter hver.
- Stabiliser biotin streptavidinkomplekset ved at postfiksere 1% glutaraldehyd i PBS* i 30 min.
- Fjern glutaraldehyd ved intens vask med deioniseret vand og vask prøven i PBS*, fem gange i 20 minutter hver.
- Sluk frie aldehydgrupper med frisklavet 1 mg/ml NaBH4 i vand, to gange i 10 minutter hver. Under inkubation dannes bobler afH2 , som kan løfte dækslipsene. Skub dem forsigtigt ned med pincetten.
- Vask med deioniseret vand fem gange i 5 minutter hver.
BEMÆRK: Til kvalitetskontrol ved mærkningstrinnet anbefales det at udføre kontrolmærkning med fluorescerende mærket streptavidin (figur 2). Dette ville give et skøn over mærkningsintensitet og baggrundsniveau, inden der skiftes til kedelige og artefakt-tilbøjelige efterfølgende trin.
3. Ag-forstærkning
BEMÆRK: Denne procedure er ændret fra Gilerovitch et al., 1995 (se 20,21).
- Resuspend 50 g akaciepulver i 100 ml deioniseret vand. Opløs i 3 dage, afgas og filtrer gennem fire lag ostekloth. Opbevares frosset i 5 ml alikvoter i 50 ml rør. Optø umiddelbart før brug.
- Der tilsættes 2 ml 1 M MES (pH = 6,1) til 5 ml optøet alikvot akaciepulveropløsning for at fremstille 7 ml 0,28 M MES (pH = 6,1) i akaciepulveropløsning. Bland ved langsomt at vippe røret i 30 min. Pak røret med folie for at beskytte mod lys.
- Samtidig med trin 3.2. vaskes dæksler med vaskebuffer (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM saccharose), tre gange i 10 minutter hver.
- Forbered den friske opløsning af N-propylgallat (NPG). I et 15 ml rør opløses 10 mg NPG i 250 μL 96% ethanol og justeres til 5 ml med deioniseret vand.
- Kom 36 mg sølvlaktat i et folieindpakket 15 ml rør.
- Efter trin 3.2. er afsluttet, tilsættes 1,5 ml NPG-opløsning til akaciepulverblanding og sten i yderligere 3 minutter.
BEMÆRK: Alle de efterfølgende trin udføres i et mørkekammer. Brug ikke-aktinisk safelight (gul eller rød). - Ligevægt prøven med vaskebuffer og fortsæt til det mørke rum. Samtidig tilsættes 5 ml deioniseret vand til sølvlaktat og opløses ved kraftig omrystning i 1-2 minutter.
- Tilsæt 1,5 ml sølvlactatopløsning til akaciepulverblandingen, sten langsomt i 1 min. Undgå bobledannelse, da ilt i blandingen vil bremse reaktionen.
- Tøm opløsningen fra fadet med dæksedler og hæld 3 ml sølvlactat-akaciepulverblanding på cellerne. Rock skålen flere gange og inkuber i 2-5 minutter. Inkubationstiden afhænger af acacia pulver batch og temperaturen. Dette bør defineres eksperimentelt.
BEMÆRK: En længere inkubationstid kan resultere i uspecifik sølvbinding. - For at stoppe reaktionen skal du dræne reaktionsblandingen og vaske skålen i vid udstrækning med tre til fem ændringer af deioniseret vand efterfulgt af yderligere tre ændringer i 5 minutter hver.
- Kontroller farvningen under lysfeltmikroskopet. God farvning skal være lys til mørk brun med en meget svag gullig baggrund.
BEMÆRK: Hvis farvningen ikke udvikler sig, er det muligt at gentage straks med den allerede fremstillede blanding (blandingen er aktiv i ca. 15 minutter, hvis den opbevares i mørke). Farvningen i dette tilfælde kan dog udvikle sig for hurtigt.
4. Guld toning
BEMÆRK: For at beskytte sølvnanopartikler mod opløsning vedOsO4-oxidation i de efterfølgende procedurer anvendes en imprægnering med guld på dette trin (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Skyl dæksler med deioniseret vand.
- For at beskytte sølvnanopartikler mod opløsning vedOsO4-oxidation inkuberes prøverne i 0,05% tetrachloraurinsyre i 2 minutter i mørke.
- Vask grundigt med deioniseret vand i 10 min.
BEMÆRK: På dette stadium tilføjes yderligere kontrast til det DNA, der indeholder materiale. Prøvens farve skal ændres fra brun til sort.
5. ChromEM
BEMÆRK: Denne protokol blev ændret fra Ou et al., 201716.
- Inkuber dæksedlerne og mæt prøverne i 10 μM DRAQ5 i PBS i 10 minutter i mørke.
- Forbered 0,2% diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) opløsning i 50 mM Tris eller PBS:
opløs DAB i 90% af det endelige volumen ved at omrøre kraftigt i mørket, og juster derefter pH til 7,0-7,4 med NaOH. Juster lydstyrken til 100%, og filtrer gennem et 0,22 μM filter, opbevar indpakket i folie. - Tilsæt DAB-opløsning til celler (2 ml pr. 3 cm petriskål) og inkuber i 1 min.
- Flyt dækslen ind i glasbunden Petri-skål og læg den på scenen i et omvendt mikroskop. Bestråle prøven (flere synsfelter) på et omvendt mikroskop med metalhalogenidlyskilde og Cy5-filtersæt (640 nm, 1 W/cm2 ved brændplan) gennem Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) linse i 10 minutter.
BEMÆRK: En indikation af vellykket DAB-fotokonvertering er komplet DRAQ5-fotoblegning og mørk DAB-bundfaldsdannelse i bestrålede kerner. Sidstnævnte er dog ikke altid tydelig over intenst EdU-sølv-guld signal (især når udvidede EdU-impulser anvendes). - Vask med deioniseret vand tre gange i 5 minutter hver.
6. Dehydrering og indlejring af epoxyharpiks
- I et mikrocentrifugerør fremstilles delvist reduceret osmiumtetraoxidopløsning ved at blande 2% vandig opløsning af K4Fe(CN)6 med en lige stor mængde på 2% vandig opløsning afOsO4 for at få 1% endelig koncentration af begge komponenter. Inkuber dæksedler i reduceret OsO4 i 1 time og vask i deioniseret vand tre gange i 5 minutter hver.
BEMÆRK: På dette stadium reagerer den reducerede osmiumforbindelse med DAB-aflejringer og øger kontrasten af DNA.
FORSIGTIG: Osmium er giftigt, arbejder under en stinkhætte og håndterer affald i henhold til lokale sikkerhedsforskrifter. - Dehydrer prøverne i en række klassificerede ethanolopløsninger i stigende procentdele: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
- Til infiltration og indlejring anvendes harpiksformlen med komponentvolumenforholdet som følger: epoxyharpiksmonomer:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). Denne formel er blandbar med ethanol.
- Inkuber dæksedlen i ethanol-harpiksblandingen (3 dele 100% EtOH:1 del epoxyharpiks) i 30 minutter.
- Inkuber dæksedlen i ethanol-harpiksblandingen (1 del 100% EtOH:1 del epoxyharpiks) i 2 timer.
- Inkuber dæksedlen i ethanol-harpiksblandingen (1 del 100% EtOH: 3 dele epoxyharpiks) natten over.
- Udskift ethanol-harpiksblandingen med frisklavet ren harpiks. Inkuber i ren harpiksblanding i 8 timer. Åbn fadet for at lade rester af ethanol fordampe.
- Overfør dæksler til et nyt fad med ren harpiks og inkuber i 2 timer ved 37-42 °C.
- Fyld en siliciumform med frisklavet harpiks. Placer dækslipsene med cellerne nedad på passende siliciumform fyldt med epoxyharpiks. Harpiksen hærdes i 24 timer ved 37 °C og derefter ved 60 °C i mindst 2 dage.
FORSIGTIG: Komponenter i epoxyharpiksblanding er potentielle kræftfremkaldende stoffer. Brug handsker og arbejd under stinkhætten.
- Fjern harpikspladen fra formen, rengør overfladen af dækslippen med skalpellen eller barberbladet. For at fjerne dæksedlen skal du slippe dækslen i flydende nitrogen og derefter overføre pladen til det kogende vand. Gentag om nødvendigt.
- Find det bestrålede område under et stereomikroskop, og skær det ud af pladen med en hacksav eller et andet egnet instrument. Forvarm pladen ved 70 °C på en kogeplade, hvis det er nødvendigt.
- Fastgør udskæringen i en ultramikrotomprøveholder til endelig bloktrimning. Brug barbermaskinen til at forberede den pyramideformede prøve. Monter holderen med pyramide på ultramikrotomet, og installer kniven.
- Trim blokken, så de bestrålede celler, der bærer EdU-etiketten, er inkluderet. Forbered en halvtynd sektion (250 nm tykkelse), der er egnet til elektrontomografi.
BEMÆRK: Sektionstykkelsen kan justeres, så den passer til forsøgskravene.
- Trim blokken, så de bestrålede celler, der bærer EdU-etiketten, er inkluderet. Forbered en halvtynd sektion (250 nm tykkelse), der er egnet til elektrontomografi.
- Fjern sektionen fra knivens kant og læg dem på single-slot gitterene. Til elektrontomografi plukkes 250 nm sektioner på 1 mm single-slot gitter, og efter tørring kan disse sektioner kulstofbelægges fra begge sider. Ingen yderligere kontrastering er nødvendig.
BEMÆRK: Da sektionerne allerede indeholder Au-Ag-partikler med høj kontrast, er det ikke nødvendigt at tilføje fiducial guldpartikler til overfladen af sektionen. - Undersøg gitterene i et transmissionselektronmikroskop ved lav forstørrelse (ca. 600x) for at lokalisere cellerne med passende replikationsmønstre.
BEMÆRK: Denne protokol genererer mærkningstæthed, der er høj nok til nem detektion af replikationsfoci, selv ved lav forstørrelse. Det tilrådes først at oprette et kort over sektionen til efterfølgende navigation og vinkelfremspringsindsamling til tomografi. Skift til højere forstørrelse, og tag billeder i høj opløsning.
7. Elektrontomografi
- Indsæt gitteret i transmissionselektronmikroskopet med en højhældningsholder. Læg prøven i elektronmikroskopet og find det område, der er af interesse.
- Juster mikroskopet i EFTEM-tilstand i næsten parallel belysningstilstand. Indstil energifilteret med 20 eV energivalgt slids placeret ved nul tab peak.
- Bestråle tomografianskaffelsesområdet for iradieres med en dosishastighed på 40 e/Å2/s i mindst 1,5-2 min., hvilket svarer til den samlede dosis på mindst 3000 e/Å2.
- Juster eucentrisk højde med automatisk opgave i SerialEM. Kontroller autofokusopgaven for at sikre, at den fungerer korrekt ved nul hældningsvinkel og -0,8 m km måldefokusværdi.
- Vip prøveholderen til -60° med Walk-Up-opgaven.
- Konfigurer tomografianskaffelsen fra -60 til +60° med trin 2,0°. Eksponeringen skal indstilles afhængigt af hældningsvinklen for at bevare den gennemsnitlige intensitet på kameraet. Begræns billedskiftet, hvis det forårsager et energiskift og dermed spalteforskydning. Tomografidataene skal gemmes som .mrc-fil.
- Importer .mrc-filen til IMOD-software til tomografirekonstruktion. Fjern de afvigende pixelværdier på grund af røntgenstråler.
- Juster vippeserien. Udfør indledende krydskorrelation, og markér derefter manuelt 10-12 guldpartikler som fiducials. Spor fiducialmodellen, og kontroller, at hver fiducial spores korrekt gennem vippeserien. Opret prøvetomogrammer (skiver), og markér manuelt de tynde sektionskanter for at forhindre mulig hældning af den rekonstruerede densitet inde i volumenet. Den gennemsnitlige restfejl for finjustering var mindre end 1,2 pix.
- Rekonstruer tomogrammet med en filtreret tilbageprojektionsalgoritme, og trim derefter outputtet, så det passer til det område, der er af interesse, i det endelige volumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Replikationsfoci i pattedyrs cellekerner viser forskellige fordelingsmønstre i kernen afhængigt af S-faseprogression. Disse mønstre korrelerer med transkriptionel aktivitet af loci, der replikeres. Da den metode, der præsenteres her, anvender en ret stærkfikseringsprocedure, er det ret ligetil at anvende replikativ pulsmærkning til specifik påvisning af kromatin loci i forskellige transkriptionelle tilstande, selv under forhold, der tilbyder den bedste strukturelle bevarelse af kromatin opnået ved kemisk fiksering ved stuetemperatur.
Kvalitetskontroltrin har til formål at sikre en vellykket gennemførelse af de vigtigste procedurer i denne protokol. Indledningsvis bør vellykket EdU-mærkning bekræftes ved click-reaktion med fluorescerende mærket azid, hvilket viser typiske replikationsmønstre, hvis heterogen cellepopulation anvendes (figur 2). Det andet vigtige trin er streptavidinmærkning, som kan påvirkes stærkt af glutaraldehydfiksering. Til evaluering af streptavidinbindingseffektivitet skal du bruge AlexaFluor-488-konjugeret streptavidin under de samme betingelser som streptavidin-Nanogold (figur 3). På dette tidspunkt forventes en vis baggrund hovedsageligt på grund af glutaraldehydautofluorescens samt ufuldstændig streptavidinudvaskning. Hvis signal-støj-forholdet er uacceptabelt, kan du prøve at øge antallet og varigheden af vasketrin i trin 2.6. Alternativt tilsættes glutaraldehydslukning med NaBH4 (trin 2.9-2.10) efter trin 1.5.
Sølvforbedringsproceduren giver ofte inkonsekvente resultater og kræver optimering. For det første varierer reaktionshastigheden dramatisk afhængigt af acaciapulveropløsningsbatchen. Opløsningens viskositet er omvendt proportional med tidspunktet for sølvfarvningsudviklingen. Det er en god ide at have flere alikvoter af samme batch og teste dem på kontrolprøverne for at bestemme optimal reaktionstid. Da temperaturen på reagenserne og miljøet også har en betydelig indvirkning på reaktionshastigheden, skal du prøve at udføre reaktionen ved nøjagtig samme temperatur. Hvis du behandler mere end tre prøver samtidigt, er det praktisk at starte reaktionen med 30 sekunders intervaller for at have tilstrækkelig tid til vasketrin.
Et godt resultat af sølvforbedringsproceduren er den mørkebrune farvning af nogle (ikke alle) kerner med meget svag gullig cytoplasmatisk farvning (figur 4). Dette betyder, at den gennemsnitlige størrelse af sølvpartikler er ca. 20 nm, hvilket er velegnet til let etiketdetektion i et bredt forstørrelsesområde af TEM over kromatinmodbefædningen. For tomografiforsøg skal partiklernes størrelse reduceres til ca. 10 nm ved at forkorte reaktionstiden. Farven i dette tilfælde skal være lysebrun eller rødlig. Farven på sølvfarvning bør kontrolleres før guldtoning.
DAB-fotokonvertering og osmificering udføres efter guldtonning for at beskytte sølvskaller mod opløsning. I tilfælde af utilstrækkelig guldimprægnering bliver sølvnanopartikler eroderet og får uregelmæssig form, men forbliver stadig synlige under TEM. Kvaliteten af DAB-fotokonvertering overvåges først ved DRAQ5-blegning (i fluorescenstilstand) og derefter i lysfelttilstand, når cellekernerne i et bestrålet felt bliver mørkebrune (figur 5). DAB-farvningsintensiteten bør ikke være særlig høj, så Ag-Au-farvning forbliver godt detekteret for at muliggøre udvælgelse af cellerne med den krævede replikationstid for sektionering.
Ultratynde eller halvtynde sektioner kræver ikke yderligere farvning og kan ses direkte under TEM. Den relevante mærkning resulterer typisk i veldefinerede klynger af Ag nanopartikler, der afgrænser replikationssteder (figur 6), mens baggrundsmærkning er begrænset til nogle få nanopartikler pr. Kvadratmikrometer. Halvtynde sektioner er klar til tomografi og kræver ikke tilsætning af guldnanopartikler til sektionsoverfladen, da Ag nanopartikler, der er til stede i et afsnit, kan bruges som fiducialmærker (figur 7). I denne figur vises effekten af forlænget mærkningstid: individuelle replikationsfoci smelter sammen til fiberlignende strukturer, der afgrænser kromatindomæner af højere orden.
Figur 1. Metodeoversigten. Celler dyrket på dæksler er mærket med EdU, fastgjort med 2,5% glutaraldehyd, permeabiliseret, og Click-reaktion udføres med biotinyleretazid. Alternativt anvendes fluorescerende mærkede azider i let mikroskopisk observation. Steder for biotininkorporering er mærket med Nanogold-streptavidin (eller fluorescerende mærket streptavidin som en kontrol), sølvforstærket og efter guldtoniskning udsat for DRAQ5-medieret DAB-fotokonvertering og osmificering. Prøverne er indlejret i epoxyharpiks, sektioneret, undersøgt i TEM og udsat for elektrontomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Replikationsmønstre i pattedyrceller afsløret ved EdU-mærkning og klikreaktion (grøn). S-fase progression fra tidlig til sen S-fase (fra venstre mod højre) manifesteres af en ordnet ændring i replikationsmønstre: A,B - tidlig S-fase, C - midt S-fase, D,E - sen S-fase. DNA er farvet med DAPI (rød). Skalabjælke = 10 um. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Replikationsmønstre i pattedyrceller afsløret ved EdU-mærkning og to-trins Click-biotin og streptavidin-AlexaFluor 488 farvning efter glutaraldehydfiksering. Kontrolprøve mærket med streptavidin-AlexaFluor 488 viser optimal mærkningseffektivitet og S / N-forhold efter glutaraldehydfiksering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Repræsentativt billede af celler efter sølvforbedringsprocedure (trin 3). Forskellige repliktive mønstre (tidlig S-fase, pile, midt I S-fasen, pilespidsen, sene, dobbelte pile) er let synlige i en lysfeltlysmikroskopitilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. Et typisk resultat af DRAQ5-medieret DAB-fotokonvertering. (A) DRAQ5-farvning (stiplet cirkel angiver bestrålet område). Bemærk stærk DRAQ5-blegning inde i cirklen. (B) Det samme område, der ses i lysmikroskop. Bemærk stærkere DAB-nedbør i kernerne i bestrålet område. Indsat: pile angiver tidlige S-fasekerner, hvor replikationsmønstre mærket med Ag-Au stadig er let detekterbare på baggrund af DRAQ5-fotooxideret DAB-farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6. Replikationsfoci i pattedyrcellekerner afsløret ved EdU-mærkning og to-trins Click-biotin og streptavidin-Nanogold-farvning efter glutaraldehydfiksering. Tynde 90 nm sektioner af en S-fase celle, der viser klynger af Ag-Au nanopartikler ved replikationsfoci (A, røde cirkler). Baggrundsniveauet kan værdsættes i en ikke-S-fase celle (B). Pilespidser angiver kromatinfibre af forskellig skala. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7. 0°-vippeprojektion på 250 nm sektion. (A) og virtuelt tomografisk afsnit. (B) af en cellekerne mærket med EdU i 2 timer. Se individuelle replikationsfoci smeltet sammen til fiberlignende strukturer (pilespidser). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her har flere fordele i forhold til tidligere offentliggjorte protokoller. For det første eliminerer brugen af Click-kemi til mærkning af replikeret DNA nødvendigheden af DNA-denatureringsforudsætning for BrdU-påvisning med antistoffer, hvilket bedre bevarer kromatin ultrastruktur.
For det andet minimerer udnyttelsen af biotin som en sekundær ligand, der genereres efter glutaraldehydfiksering og korrekt slukning af ubundne aldehydgrupper, kemisk modifikation af målet, hvilket forbedrer mærkningseffektiviteten, samtidig med at baggrunden reduceres på grund af endogent biotin. Biotin-streptavidin tilføjer også alsidighed, da brugen af fluorescerende mærket streptavidin giver nem kvalitetskontrol i det meget tidlige stadium af proceduren. Protokollen kan forenkles yderligere ved introduktion af FluoroNanogold-mærket streptavidin, men i vores hænder gav disse reagenser noget højere baggrund sammenlignet med Nanogold-streptavidin, måske på grund af sondernes større størrelse.
For det tredje giver en kombination af små sonder, streptavidin-Nanogold er den største komponent på ca. 5 nm, meget god indtrængning i selv glutaraldehyd-tværbundne celler. Dette gør teknikken velegnet til præindlejring af mærkning af optimalt ultrastrukturelt bevarede celler og let kompatibel med forskellige 3D-elektronmikroskopiteknikker, herunder seriel sektionsrekonstruktion, arraytomografi, elektrontomografi, seriel blok ansigtsbilleddannelse og FIB-SEM.
Sølvforbedring er det mest kritiske trin, der kræver præcis kontrol af reagensdiffusion og vasketrin, hvilket er lettere at udføre med klæbende celler. På den anden side, da stærk tværbinding med glutaraldehyd også kan påvirke sølvforbedringen, bør fikseringsbetingelserne finjusteres for at afbalancere kromatinstrukturbevarelse og sølvforbedringseffektivitet. Af denne grund er kryofikserings-/kryosubstitutionsteknikker, som kræver udvidet og dårligt kontrolleret efterfiksering, selv om de muliggør endnu bedre strukturbevarelse, muligvis ikke fuldt ud forenelige med den foreslåede mærkningsstrategi23. Teknikken kan forbedres yderligere ved at bruge Au-forstærkning i stedet for sølvforbedring24. Denne ændring gør det muligt at springe over guld toning trin, men i vores hænder giver det betydeligt højere baggrund.
Endelig tillader forindlejringsmærkning forvalg af målceller til ChromEM og sektionering baseret på replikationsmønsteret, der kan detekteres under lysfelt eller fluorescerende mikroskop. Desuden kan metoden let udvides til CLEM, herunder forskellige superopløsningsteknikker. Dette åbner nye horisonter i studier af kromatin højere ordens struktur og dynamik i forskellige fysiologiske tilstande. Den tilgang, vi beskrev her, kan anvendes til undersøgelser af kromatinorganisation på replikationssteder, til analyse af postreplikativ omlejring af kromatin, herunder højopløsningsbilleddannelse af kromatidsegregation i interfase, og til replikativ mærkning af store kromosomale domæner og undersøgelser af højere ordens kromatinfoldning af specifikke fraktioner af genomet (euchromatin eller heterochromatin, mærket baseret på replikationstiming). Disse typer billeddannelsesteknikker er også vigtige som referencepunkt for de data, der genereres af alternative tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af RSF (bevilling nr. 17-15-01290) og RFBR (bevilling nr. 19-015-00273). Forfatterne takker Lomonosov Moscow State University udviklingsprogram (PNR 5.13) og Nikon Center of Excellence i korrelativ billeddannelse ved Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology for adgang til billeddannelsesinstrumentering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
