Summary
Bu protokol, yapısal olarak korunmuş kromatin in situ içindeki replikasyon bölgelerinin yüksek çözünürlüklü haritalanması için, önceden gömülmüş EdU-streptavidin-Nanogold etiketleme ve ChromEMT'nin bir kombinasyonunu kullanan bir teknik sunar.
Abstract
Hücre çekirdeğinde DNA katlanmasının prensipleri ve temel genetik fonksiyonların (transkripsiyon, replikasyon, ayrışma vb.) yerine getirilmesi sırasında meydana gelen dinamik dönüşümleri, kısmen yapısal olarak korunmuş çekirdeklerde spesifik kromatin lokuslarının yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine yönelik deneysel yaklaşımların bulunmaması nedeniyle tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, yeni sentezlenen DNA'nın EdU etiketlemesini, daha sonra Nanogold parçacıklarının Ag-amplifikasyonu ve kromatinin ChromEM boyaması ile sonraki etiket tespiti ile birleştirerek, tek katmanlı hücre kültüründe replikatif alanların in situ olarak görselleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, oda sıcaklığında numune işleme için kromatinin en iyi yapısal korumasını sağlayan geleneksel glutaraldehit fiksasyonu ile uyumlu, yüksek kontrastlı, yüksek verimli ön gömme etiketlemesine izin verir. Önceden gömme etiketlemenin bir diğer avantajı, bölümleme için ilgilenilen hücreleri önceden seçme olasılığıdır. Bu, özellikle heterojen hücre popülasyonlarının analizinin yanı sıra, replikasyon bölgelerinde kromatin organizasyonunun yüksek çözünürlüklü 3D analizine elektron tomografisi yaklaşımlarıyla uyumluluk ve replikatif sonrası kromatin yeniden düzenlenmesi ve ara fazda kardeş kromatid ayrışmasının analizi için önemlidir.
Introduction
DNA replikasyonu, hücre bölünmesi sırasında genetik bilginin sadık bir şekilde kopyalanması ve iletilmesi için gerekli olan temel bir biyolojik süreçtir. Daha yüksek ökaryotlarda, DNA replikasyonu, replikasyon kökenlerinin sıralı aktivasyonunda kendini gösteren sıkı uzaysal-zamansal düzenlemeye tabi tutulur1. Eşzamanlı olarak ateşlenen komşu çoğaltma kaynakları, replikon2 kümeleri oluşturur. Optik mikroskopi düzeyinde, devam eden DNA replikasyon bölgeleri, çeşitli sayı ve büyüklükte replikasyon odakları olarak tespit edilir. Replikasyon odakları, etiketli DNA 3,4'ün replikasyon zamanlamasına bağlı olarak hücre çekirdeği içindeki belirli uzamsal dağılım kalıplarını gösterir ve bu da gen aktivitesi ile sıkı bir şekilde ilişkilidir. Uzay ve zamanda kesin olarak sıralanmış iyi tanımlanmış DNA replikasyon dizisi sayesinde, replikatif etiketleme, sadece replikasyon sürecinin kendi başına incelenmesi için değil, aynı zamanda tanımlanmış transkripsiyon aktivitesi ve sıkıştırma seviyesi ile spesifik bir DNA alt fraksiyonunu ayırt etmek için de güçlü bir hassas DNA etiketleme yöntemidir. Replikasyon kromatininin görselleştirilmesi genellikle DNA replikasyon makinesinin ana protein bileşenlerinin tespiti yoluyla (immünoboyama veya floresan protein etiketlerinin ekspresyonu 5,6) veya modifiye DNA sentezi öncüllerinin dahil edilmesi yoluyla gerçekleştirilir 7,8,9,10 . Bunlardan sadece modifiye nükleotidlerin yeni kopyalanmış DNA'ya dahil edilmesine dayanan yöntemler, replikasyon sırasında kromatindeki konformasyonel değişikliklerin yakalanmasına izin verir ve replikasyonları tamamlandıktan sonra replikatif alanların davranışını izler.
Daha yüksek ökaryotlarda, kromatine DNA paketlemesi, temel genetik fonksiyonların (transkripsiyon, replikasyon, onarım vb.) düzenlenmesine başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Kromatin katlaması, DNA'nın düzenleyici trans-faktörlere ve şablon sentezi için gerekli DNA konformasyonel değişikliklerine (çift sarmal çözme) erişilebilirliğini etkiler. Bu nedenle, hücre çekirdeğindeki DNA'ya bağımlı sentetik süreçlerin, kromatinin yoğunlaşmış, baskıcı durumundan daha erişilebilir, açık bir konformasyona yapısal bir geçişini gerektirdiği genel olarak kabul edilmektedir. Sitolojik olarak, bu iki kromatin durumu heterokromatin ve ökromatin olarak tanımlanır. Bununla birlikte, çekirdekte DNA'nın katlanma şekli konusunda hala bir fikir birliği yoktur. Hipotezler, nükleozomal elyafın, ambalaj yoğunluğunun faz ayırma mekanizmaları tarafından kontrol edildiği rastgele bir polimer gibi davrandığı bir "polimer eriyik" model11'den, artan kalınlıkta kromatin lifi benzeri yapıların sıralı oluşumunu varsayan hiyerarşik katlanma modellerine kadar uzanmaktadır12,13. Hiyerarşik katlama modelleri son zamanlarda in situ DNA-DNA temaslarının (kromozom konformasyon yakalama, 3C) analizine dayanan moleküler yaklaşımlardan destek alarak, kromatin yapısal alanlarının hiyerarşisinin varlığını göstermiştir14. Replikasyon birimlerinin bu kromatin alanları15 ile çok iyi ilişkili olduğunu belirtmek önemlidir. Bu modellerin başlıca eleştirisi, çeşitli problar (örneğin, antikorlar) için kromatin erişilebilirliğini artırırken, ultrayapısal çalışmalar için kromatin kontrastını iyileştirmek amacıyla, hücre zarlarının geçirgenleştirilmesi ve kromatin olmayan bileşenlerin çıkarılması gibi numune hazırlama prosedürlerinin neden olduğu potansiyel yapay kromatin agregasyonuna dayanmaktadır. Diaminobenzidinin (ChromEMT6) DNA bağlayıcı florofor aracılı foto-oksidasyonu ile elektron mikroskobu için seçici DNA boyamadaki son teknik gelişmeler, bu engelin ortadan kaldırılmasına izin vermiştir. Bununla birlikte, aynı hususlar, DNA 17,18'i kopyalayan elektron mikroskobu görselleştirmesi için de geçerlidir. Burada, bozulmamış aldehit çapraz bağlı hücrelerde yeni sentezlenen DNA ve toplam kromatinin eşzamanlı yüksek çözünürlüklü ultrastrüktürel haritalanmasına izin veren bir tekniği açıklıyoruz. Teknik, EdU etiketli DNA'nın Click-kimyası ile biyotinile problar ve streptavidin-Nanogold ve ChromEMT ile tespitini birleştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, yapışkan hücreler için optimize edilmiştir ve HeLa, HT1080 ve CHO hücre hatları üzerinde test edilmiştir.
1. Hücre etiketleme ve sabitleme
- Asitle temizlenmiş kapaklar üzerindeki plaka hücreleri 3 cm'lik bir Petri kabında kayar. Kullanılan hücre hattı için önerilen ortamdaki hücreleri% 70 akıcılığa kadar büyütün.
- 10 mM stoktan 10 μM nihai konsantrasyona EdU (5-etinil-2'-deoksiuridin) ekleyin ve hücreleri inkübatöre 10 dakika veya daha uzun süre yerleştirin (deney amacına bağlı olarak). Daha kısa darbeler için (2 dakikaya kadar), 10 μM EdU ile desteklenmiş önceden ısıtılmış taze kültür ortamı içeren bir Petri kabı hazırlayın ve doğrudan hücrelere EdU eklemek yerine kapakları aktarın.
NOT: Sonraki tüm adımlar, aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirilir. - Etiketli hücreleri, 100 mM kakodilat tamponunda% 25 stok seyreltilerek taze yapılan% 2.5 glutaraldehit ile 1 saat boyunca sabitleyin.
NOT: Sonraki EdU algılama adımları sabitleme zamanlamasına duyarlıdır. Daha uzun sabitleme süreleri, EdU etiketlemesini olumsuz yönde etkileyerek daha düşük sinyal-gürültü oranına neden olabilir. - Glutaraldehiti 5 mM MgCl2 (PBS* ile desteklenmiş PBS ile yıkayarak çıkarın. Her yıkama için 10 dakikalık bir inkübasyonla üç kez yıkayın.
- PBS'de* %1 Triton X-100 ile plazma membranlarını geçirgenleştirin (bundan sonra PBS*T). Her yıkama için 5 dakikalık bir inkübasyonla iki kez yıkayın.
- Numuneyi PBS* ile kapsamlı bir şekilde yıkayın. Beş değişiklik yapın ve her değişiklikte 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kalıntı içermeyen aldehit gruplarını PBS'de* 20 mM glisin ile her biri 10 dakika boyunca iki kez söndürün.
- Numuneleri PBS'de* %1 BSA'da 30 dakika boyunca bloke edin.
2. Tıklama reaksiyonu
NOT: Bu yordam daha önce yayımlanmış bir protokol19'dan değiştirilir.
- Kullanımdan hemen önce, EdU tespiti için Click-reaksiyon karışımını hazırlayın: bir mikrosantrifüj tüpünde, 430 μL 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 20 μL 100 mM CuSO4, 1.2 μL biyotin-azid (DMSO'da 10 mM) ve 50 μL 0.5 M askorbik asit karışımı. Floresan mikroskopi düzeyinde replikatif etiketleme ve Tıklama prosedürünün kalite kontrolü için, biyotin-azid AlexaFluor 488-azid ile değiştirilebilir.
NOT: Yukarıdaki reaksiyondaki bileşenlerin eklenme sırası önemlidir. - Reaksiyon kokteylindeki buharlaşmayı ve konsantrasyon kaymalarını en aza indirmek için nemli bir odada tıklama reaksiyonu gerçekleştirin. Petri kabının dibine ıslak bir filtre kağıdı tabakası yerleştirerek ve bir parafin filmle kaplayarak nemli odayı hazırlayın. Kapak kaymalarını, hücreler yukarı bakacak şekilde filmin yüzeyine yerleştirin ve reaksiyon kokteylinin 50-100 μL'sini kapak kapağına yerleştirin. Reaksiyon oda sıcaklığında 30 dakika sürer.
- Numuneyi PBS* (PBS*T) içinde %0,1 Triton X-100'de, her biri 5 dakika boyunca beş kez yıkayarak reaksiyonu durdurun.
- PBS*T'de %1 BSA'da oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloke edin.
- % 1 BSA içeren PBS * T ile streptavidin-Nanogold çözeltisi hazırlayın. Numuneyi, yeni hazırlanan nemli odada +4 ° C'de% 1 BSA + PBS * T'de 1.4 nm Nanogold parçacıkları (Nanoproblar) ile konjuge edilmiş streptavidin ile inkübe edin.
- Reaksiyonu durdurun ve numuneyi PBS*T'de, her biri 10 dakika boyunca beş kez yıkayın.
- PBS'de* %1 glutaraldehit içine 30 dakika boyunca son sabitleme yaparak biyotin streptavidin kompleksini stabilize edin.
- Deiyonize suyla yoğun bir şekilde yıkayarak glutaraldehiti çıkarın ve numuneyi PBS'de* her biri 20 dakika boyunca beş kez yıkayın.
- Serbest aldehit gruplarını taze hazırlanmış 1 mg/mL NaBH4 ile suda her biri 10 dakika boyunca iki kez söndürün. Kuluçka sırasında, kapak kaymalarını kaldırabilenH2 kabarcıkları oluşur. Onları cımbızla dikkatlice aşağı itin.
- Her biri 5 dakika boyunca beş kez deiyonize su ile yıkayın.
NOT: Etiketleme adımında kalite kontrolü için, floresan etiketli streptavidin ile kontrol etiketlemesinin yapılması önerilir (Şekil 2). Bu, sıkıcı ve artefakta eğilimli sonraki adımlara geçmeden önce etiketleme yoğunluğunun ve arka plan seviyesinin bir tahminini sağlayacaktır.
3. Ag-amplifikasyonu
NOT: Bu prosedür Gileroviç ve ark., 1995'ten değiştirilmiştir (bkz. 20,21).
- 100 mL deiyonize suda 50 g akasya tozunu tekrar askıya alın. 3 gün boyunca çözün, gazı çözün ve dört kat tülbent ile süzün. 50 mL tüplerde 5 mL alikotlarda dondurulmuş olarak saklayın. Kullanmadan hemen önce çözün.
- Akasya tozu çözeltisinde 7 mL'lik 0.28 M MES (pH = 6.1) yapmak için 2 mL'lik 1 M MES (pH = 6.1) ila 5 mL çözülmüş akasya tozu çözeltisi aliquot ekleyin. Tüpü 30 dakika boyunca yavaşça sallayarak karıştırın. Işıktan korumak için tüpü folyo ile sarın.
- Adım 3.2. ile eşzamanlı olarak, kapakları yıkama tamponu (50 mM MES, pH = 5.8, 200 mM sakaroz) ile yıkayın, her biri 10 dakika boyunca üç kez.
- Taze N-propil galat (NPG) çözeltisini hazırlayın. 15 mL'lik bir tüpte, 10 mg NPG'yi 250 μL% 96 etanol içinde çözün ve deiyonize su ile 5 mL'ye ayarlayın.
- Folyo sarılı 15 mL'lik bir tüpe 36 mg gümüş laktat koyun.
- Adım 3.2'den sonra. tamamlandığında, akasya tozu karışımına 1,5 mL NPG çözeltisi ekleyin ve 3 dakika daha sallayın.
NOT: Sonraki tüm adımlar karanlık bir odada gerçekleştirilir. Aktinik olmayan güvenli ışık kullanın (sarı veya kırmızı). - Numuneyi yıkama tamponu ile dengeleyin ve karanlık odaya geçin. Aynı zamanda, gümüş laktat üzerine 5 mL deiyonize su ekleyin ve 1-2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayarak çözün.
- Akasya tozu karışımına 1,5 mL gümüş laktat çözeltisi ekleyin, 1 dakika boyunca yavaşça sallayın. Kabarcık oluşumundan kaçının, çünkü karışımdaki oksijen reaksiyonu yavaşlatır.
- Çözeltiyi kapaklarla tabaktan boşaltın ve hücrelere 3 mL gümüş laktat-akasya tozu karışımı dökün. Yemeği birkaç kez sallayın ve 2-5 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresi akasya tozu partisine ve sıcaklığa bağlıdır. Bu deneysel olarak tanımlanmalıdır.
NOT: Daha uzun bir inkübasyon süresi, spesifik olmayan gümüş bağlanmaya neden olabilir. - Reaksiyonu durdurmak için, reaksiyon karışımını boşaltın ve bulaşığı üç ila beş deiyonize su değişikliği ile kapsamlı bir şekilde yıkayın, ardından her biri 5 dakika boyunca üç değişiklik daha yapın.
- Parlak alan mikroskobu altında lekelenmeyi kontrol edin. İyi boyama, çok soluk sarımsı bir arka plan ile açık ila koyu kahverengi olmalıdır.
NOT: Boyama gelişmiyorsa, önceden yapılmış karışımla hemen tekrarlamak mümkündür (karışım karanlıkta tutulursa yaklaşık 15 dakika boyunca aktiftir). Bununla birlikte, bu durumda lekelenme çok hızlı gelişebilir.
4. Altın tonlama
NOT: Sonraki prosedürlerde gümüş nanopartikülleri OsO4 oksidasyonu ile çözünmeye karşı korumak için, bu adımda altın ile emprenye edilmesi kullanılır (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Deiyonize su ile kapakları durulayın.
- Gümüş nanopartikülleri OsO4 oksidasyonu ile çözünmeye karşı korumak için, numuneleri karanlıkta 2 dakika boyunca% 0.05 tetrakloroaurik asit içinde inkübe edin.
- 10 dakika boyunca deiyonize su ile iyice yıkayın.
NOT: Bu aşamada, DNA içeren materyale ek kontrast eklenir. Numunenin rengi kahverengiden siyaha değişmelidir.
5. KromEM
NOT: Bu protokol Ou ve ark., 201716'dan değiştirilmiştir.
- Kapakları inkübe edin ve numuneleri karanlıkta 10 dakika boyunca PBS'de 10 μM DRAQ5'te doyurun.
- 50 mM Tris veya PBS'de% 0.2 diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB) çözeltisi hazırlayın:
DAB'ı karanlıkta kuvvetlice karıştırarak nihai hacmin% 90'ında çözün, ardından pH'ı NaOH ile 7.0-7.4'e ayarlayın. Ses seviyesini% 100'e ayarlayın ve 0,22 μM'lik bir filtreden süzün, folyoya sarılı olarak saklayın. - Hücrelere DAB çözeltisi ekleyin (3 cm Petri kabı başına 2 mL) ve 1 dakika boyunca inkübe edin.
- Kapak kapağını cam alt Petri kabına taşıyın ve ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına yerleştirin. Metal halojenür ışık kaynağı ve Cy5 filtre seti (640 nm, odak düzleminde 1 W/cm2) ile ters çevrilmiş bir mikroskopta numuneyi (birkaç görüş alanı) Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) lensle 10 dakika boyunca ışınlayın.
NOT: Başarılı DAB fotodönüşümünün bir göstergesi, ışınlanmış çekirdeklerde tam DRAQ5 fotobeyazlatma ve koyu DAB çökelti oluşumudur. Bununla birlikte, ikincisi yoğun EdU-gümüş-altın sinyali üzerinde her zaman belirgin değildir (özellikle genişletilmiş EdU darbeleri kullanıldığında). - Her biri 5 dakika boyunca üç kez deiyonize su ile yıkayın.
6. Dehidrasyon ve epoksi reçine gömme
- Bir mikrosantrifüj tüpünde, her iki bileşenin% 1'lik nihai konsantrasyonunu elde etmek için,% 2'lik sulu K4Fe (CN) 6 çözeltisini% 2'lik eşit miktarda% 2'lik sulu OsO4 çözeltisi ile karıştırarak kısmen indirgenmiş osmiyum tetraoksit çözeltisi hazırlayın. Kapakları indirgenmiş OsO4'te 1 saat boyunca inkübe edin ve her biri 5 dakika boyunca üç kez deiyonize suda yıkayın.
NOT: Bu aşamada, indirgenmiş ozmiyum bileşiği DAB birikimleri ile reaksiyona girer ve DNA'nın kontrastını arttırır.
DİKKAT: Osmiyum zehirlidir, bir duman davlumbazının altında çalışır ve atıkları yerel güvenlik düzenlemelerine göre işler. - Numuneleri bir dizi derecelendirilmiş etanol çözeltisinde artan yüzdelerde kurutun:% 50 EtOH - 3 x 10 dakika; %70 EtOH - 3 x 10 dakika, %80 EtOH - 3 x 10 dakika, %96 EtOH - 3 x 10 dakika, %100 EtOH - 3 x 10 dk.
- Sızma ve gömme için, bileşen hacimsel oranına sahip reçine formülünü aşağıdaki gibi kullanın: epoksi reçine monomeri: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0.23 (w / w). Bu formül etanol ile karışabilir.
- Kapak kaymasını 30 dakika boyunca etanol-reçine karışımında (3 parça% 100 EtOH: 1 parça epoksi reçine) inkübe edin.
- Kapak kaymasını 2 saat boyunca etanol-reçine karışımında (1 kısım% 100 EtOH: 1 kısım epoksi reçine) inkübe edin.
- Kapak kaymasını etanol-reçine karışımında (1 kısım% 100 EtOH: 3 parça epoksi reçine) gece boyunca inkübe edin.
- Etanol-reçine karışımını taze hazırlanmış saf reçine ile değiştirin. 8 saat boyunca saf reçine karışımında inkübe edin. Etanol kalıntılarının buharlaşmasına izin vermek için çanağı açın.
- Transfer kapakları saf reçineli yeni bir kaba koyun ve 37-42 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin.
- Bir silikon kalıbı taze hazırlanmış reçine ile doldurun. Kapak kapaklarını, hücreler aşağı bakacak şekilde epoksi reçine ile doldurulmuş uygun silikon kalıba yerleştirin. Reçineyi 37 ° C'de 24 saat, daha sonra 60 ° C'de en az 2 gün boyunca kürleyin.
DİKKAT: Epoksi reçine karışımının bileşenleri potansiyel kanserojenlerdir. Eldiven giyin ve duman başlığının altında çalışın.
- Reçine levhayı kalıptan çıkarın, kapak kapağının yüzeyini neşter veya tıraş bıçağı ile temizleyin. Kapak kaymasını çıkarmak için, kapak kaymasını sıvı azot içine bırakın ve ardından levhayı kaynar suya aktarın. Gerekirse tekrarlayın.
- Işınlanan alanı bir stereomikroskop altında bulun ve demir testeresi veya başka bir uygun aletle levhadan kesin. Gerekirse, levhayı 70 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde önceden ısıtın.
- Son blok kırpma için kesimi ultramikrotomlu bir numune tutucuya sabitleyin. Jileti kullanarak, piramit şeklindeki örneği hazırlayın. Tutucuyu piramitle ultramikrotom üzerine monte edin ve bıçağı takın.
- Bloğu, EdU etiketini taşıyan ışınlanmış hücreler dahil edilecek şekilde kırpın. Elektron tomografisi için uygun yarı ince bir kesit (250 nm kalınlığında) hazırlayın.
NOT: Kesit kalınlığı deneysel gerekliliklere uyacak şekilde ayarlanabilir.
- Bloğu, EdU etiketini taşıyan ışınlanmış hücreler dahil edilecek şekilde kırpın. Elektron tomografisi için uygun yarı ince bir kesit (250 nm kalınlığında) hazırlayın.
- Bölümü bıçağın kenarından ayırın ve tek yuvalı ızgaralara yerleştirin. Elektron tomografisi için 1 mm tek yuvalı ızgaralara 250 nm kesitler alınır ve kuruduktan sonra bu kesitler her iki taraftan da karbon kaplamalı olabilir. Ek bir kontrast gerekmez.
NOT: Bölümler zaten yüksek kontrastlı Au-Ag parçacıkları içerdiğinden, bölümün yüzeyine güvenilir altın parçacıkları eklemeye gerek yoktur. - Uygun replikasyon modellerine sahip hücreleri bulmak için ızgaraları bir iletim elektron mikroskobunda düşük büyütmede (yaklaşık 600x) inceleyin.
NOT: Bu protokol, düşük büyütmede bile çoğaltma odaklarının kolayca algılanması için yeterince yüksek etiketleme yoğunluğu oluşturur. Öncelikle sonraki navigasyon için bölümün bir haritasının oluşturulması ve tomografi için açısal projeksiyon toplanması önerilir. Daha yüksek büyütmeye geçin ve yüksek çözünürlüklü görüntüler çekin.
7. Elektron tomografisi
- Izgarayı, yüksek eğimli bir tutucu ile iletim elektron mikroskobuna yerleştirin. Numuneyi elektron mikroskobuna yükleyin ve ilgilenilen bölgeyi bulun.
- EFTEM modunda mikroskobu neredeyse paralel aydınlatma modunda hizalayın. Enerji filtresini, sıfır kayıp zirvesine yerleştirilmiş 20 eV enerji seçici yarıkla ayarlayın.
- Tomografi edinim alanını en az 1.5-2 dakika boyunca 40 e/ş2/s doz hızında ışınlayın, bu da toplam doza en az 3000 e/Å2 karşılık gelir.
- SerialEM'deki otomatik görevle ösentrik yüksekliği ayarlayın. Sıfır eğim açısında ve -0,8 mkm hedef bulanıklaştırma değerinde doğru çalıştığından emin olmak için otomatik odaklama görevini kontrol edin.
- Walk-Up görevi ile numune tutucuyu -60°'ye eğin.
- Tomografi alımını adım 2.0° ile -60 ila +60° arasında ayarlayın. Pozlama, kameradaki ortalama yoğunluğu korumak için eğim açısına bağlı olarak ayarlanmalıdır. Bir enerji kaymasına neden olması ve dolayısıyla yanlış hizalamayı kesmesi ihtimaline karşı görüntü kaymasını sınırlayın. Tomografi verileri .mrc dosyası olarak kaydedilmelidir.
- Tomografi rekonstrüksiyonu için .mrc dosyasını IMOD yazılımına aktarın. X-ışınları nedeniyle aykırı piksel değerlerini kaldırın.
- Eğim serisini hizalayın. İlk çapraz korelasyonu gerçekleştirin, ardından 10-12 altın parçacığını referans olarak manuel olarak işaretleyin. Referans modelini izleyin ve her referansın eğim serisi boyunca doğru şekilde izlendiğini kontrol edin. Örnek tomogramlar (dilimler) oluşturun ve yeniden yapılandırılmış yoğunluğun hacim içinde olası eğimini önlemek için ince kesit kenarlıklarını manuel olarak işaretleyin. İnce hizalamada ortalama kalıntı hata 1.2 pix'ten azdı.
- Tomogramı filtrelenmiş bir geri projeksiyon algoritmasıyla yeniden yapılandırın ve ardından çıktıyı, ilgilenilen bölgeyi son birime sığdıracak şekilde kırpın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Memeli hücre çekirdeklerindeki replikasyon odakları, S-fazı ilerlemesine bağlı olarak çekirdek içinde farklı dağılım paternleri gösterir. Bu modeller, çoğaltılan lokusların transkripsiyonel aktivitesi ile ilişkilidir. Burada sunulan yöntem oldukça güçlü bir sabitleme prosedürü kullandığından, oda sıcaklığında kimyasal fiksasyon ile elde edilen kromatinin en iyi yapısal korumasını sunan koşullar altında bile, çeşitli transkripsiyonel durumlarda kromatin lokuslarının spesifik tespiti için replikatif darbe etiketlemesinin kullanılması oldukça basittir.
Kalite kontrol adımları, bu protokoldeki temel prosedürlerin başarıyla tamamlanmasını sağlamayı amaçlamaktadır. Başlangıçta, başarılı EdU etiketlemesi, floresan olarak etiketlenmiş azid ile Tıklama reaksiyonu ile doğrulanmalı ve heterojen hücre popülasyonu kullanıldığında tipik replikasyon paternleri gösterilmelidir (Şekil 2). İkinci önemli adım, glutaraldehit fiksasyonundan güçlü bir şekilde etkilenebilen streptavidin etiketlemesidir. Streptavidin bağlanma verimliliğinin değerlendirilmesi için, streptavidin-Nanogold ile aynı koşullar altında AlexaFluor-488-konjuge streptavidin'i kullanın (Şekil 3). Bu noktada, esas olarak glutaraldehit otofloresansı ve eksik streptavidin yıkaması nedeniyle bazı arka planlar beklenmektedir. Sinyal-gürültü oranı kabul edilemezse, adım 2.6'daki yıkama adımlarının sayısını ve süresini artırmayı deneyin. Alternatif olarak, adım 1.5'ten sonra NaBH4 (adım 2.9-2.10) ile glutaraldehit söndürme ekleyin.
Gümüş geliştirme prosedürü genellikle tutarsız sonuçlar üretir ve optimizasyon gerektirir. İlk olarak, reaksiyon hızı akasya tozu çözeltisi partisine bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Çözeltinin viskozitesi, gümüş boyama gelişim zamanı ile ters orantılıdır. Aynı partiden birkaç alikotun olması ve optimum reaksiyon zamanlamasını belirlemek için bunları kontrol numuneleri üzerinde test etmesi iyi bir fikirdir. Reaktiflerin ve ortamın sıcaklığı da reaksiyon hızı üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğundan, reaksiyonu aynı sıcaklıkta gerçekleştirmeye çalışın. Aynı anda üçten fazla numune işleniyorsa, yıkama adımları için yeterli zamana sahip olmak için reaksiyonu 30 saniyelik aralıklarla başlatmak uygundur.
Gümüş geliştirme prosedürünün iyi bir sonucu, çok soluk sarımsı sitoplazmik boyama ile bazı (hepsi değil) çekirdeklerin koyu kahverengi boyanmasıdır (Şekil 4). Bu, gümüş parçacıklarının ortalama boyutunun yaklaşık 20 nm olduğu anlamına gelir; bu, kromatin karşı boyaması üzerinde geniş bir TEM büyütme aralığında kolay etiket tespiti için uygundur. Tomografi deneyleri için, reaksiyon süresi kısaltılarak parçacıkların boyutu yaklaşık 10 nm'ye düşürülmelidir. Bu durumda renk açık kahverengi veya kırmızımsı olmalıdır. Altın tonlamadan önce gümüş boyamasının rengi kontrol edilmelidir.
DAB fotokonversiyon ve ozmifikasyon, gümüş kabukları çözünmeye karşı korumak için altın tonlamasından sonra gerçekleştirilir. Yetersiz altın emprenyesi durumunda, gümüş nanopartiküller aşınır ve düzensiz şekil alır, ancak yine de TEM altında görünür kalır. DAB fotokonversiyonun kalitesi önce DRAQ5 ağartma (floresan modunda), daha sonra ışınlanmış bir alandaki hücre çekirdekleri koyu kahverengi olduğunda parlak alan modunda izlenir (Şekil 5). DAB boyama yoğunluğu çok yüksek olmamalıdır, böylece Ag-Au boyaması, kesitleme için gerekli replikasyon zamanlamasına sahip hücrelerin seçimine izin vermek için iyi tespit edilir.
Ultra ince veya yarı ince kesitler ek boyama gerektirmez ve doğrudan TEM altında görüntülenebilir. Uygun etiketleme tipik olarak replikasyon bölgelerini sınırlayan iyi tanımlanmış Ag nanopartikül kümeleri ile sonuçlanır (Şekil 6), arka plan etiketlemesi ise kare mikrometre başına birkaç nanopartikül ile sınırlıdır. Yarı ince kesitler tomografi için hazırdır ve kesit yüzeyine altın nanopartiküllerin eklenmesini gerektirmez, çünkü bir kesitte bulunan Ag nanopartikülleri referans işaretleri olarak kullanılabilir (Şekil 7). Bu şekilde, uzun etiketleme süresinin etkisi gösterilmiştir: bireysel replikasyon odakları, daha yüksek dereceli kromatin alanlarını tanımlayarak elyaf benzeri yapılara kaynaşır.
Şekil 1. Yönteme genel bakış. Kapaklarda yetiştirilen hücreler EdU ile etiketlenir,% 2.5 glutaraldehit ile sabitlenir, geçirgenleşir ve Click-reaksiyonu biyotinillenmiş azid ile gerçekleştirilir. Alternatif olarak, floresan olarak etiketlenmiş azidler ışık mikroskobik gözleminde kullanılır. Biyotin ekleme bölgeleri, Nanogold-streptavidin (veya bir kontrol olarak floresan olarak streptavidin olarak etiketlenmiş), gümüş geliştirilmiş ve DRAQ5 aracılı DAB fotokonversiyon ve osmifikasyona tabi tutulan altın tonlamasından sonra etiketlenir. Örnekler epoksi reçinesine gömülür, kesitlenir, TEM'de incelenir ve elektron tomografisine tabi tutulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Memeli hücrelerindeki replikasyon paternleri EdU etiketleme ve Tıklama reaksiyonu (yeşil) ile ortaya çıkmıştır. Erken S-fazından geç S-fazına (soldan sağa) ilerleme, replikasyon modellerinde düzenli bir değişiklikle kendini gösterir: A, B - erken S-fazı, C - orta S-fazı, D, E - geç S-fazı. DNA DAPI (kırmızı) ile boyanır. Ölçek çubuğu = 10 um. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Glutaraldehit fiksasyonundan sonra EdU etiketlemesi ve iki aşamalı Click-biotin ve streptavidin-AlexaFluor 488 boyaması ile ortaya çıkan memeli hücrelerindeki replikasyon paternleri. Streptavidin-AlexaFluor 488 ile etiketlenmiş kontrol numunesi, glutaraldehit fiksasyonundan sonra optimum etiketleme verimliliğini ve S / N oranını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Gümüş geliştirme prosedüründen sonra hücrelerin temsili görüntüsü (Adım 3). Çeşitli replikatif desenler (erken S-fazı, oklar; orta S-fazı, ok ucu; geç, çift oklar) parlak alan ışık mikroskobu modunda kolayca görülebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. DRAQ5 aracılı DAB fotodönüşümünün tipik bir sonucu. (A) DRAQ5 boyama (kesikli daire ışınlanmış alanı gösterir). Dairenin içinde güçlü DRAQ5 ağartmaya dikkat edin. (B) Parlak alan ışık mikroskobunda görülen aynı alan. Işınlanmış alandaki çekirdeklerde daha güçlü DAB çökelmesine dikkat edin. Giriş: Oklar, Ag-Au ile etiketlenmiş replikasyon modellerinin DRAQ5-foto-oksitlenmiş DAB boyamasının arka planında hala kolayca tespit edilebildiği erken S-faz çekirdeklerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Glutaraldehit fiksasyonundan sonra EdU etiketlemesi ve iki aşamalı Click-biotin ve streptavidin-Nanogold boyama ile ortaya çıkan memeli hücre çekirdeklerindeki replikasyon odakları. Bir S-faz hücresinin ince 90 nm bölümleri, replikasyon odaklarında Ag-Au nanopartikül kümelerini gösterir (A, kırmızı daireler). Arka plan düzeyi, S fazı olmayan bir hücrede (B) takdir edilebilir. Ok uçları, çeşitli ölçeklerdeki kromatin liflerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. 250 nm kesitin 0° eğimli projeksiyonu. (A) ve sanal tomografi bölümü. (B) 2 saat boyunca EdU ile etiketlenmiş bir hücre çekirdeğinin. Fiber benzeri yapılara (ok uçları) kaynaşmış bireysel çoğaltma odaklarına bakın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntemin daha önce yayımlanmış protokollere göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, replika DNA'yı etiketlemek için Click-kimyasının kullanılması, antikorlarla BrdU tespiti için DNA denatürasyon ön koşulunun gerekliliğini ortadan kaldırır, böylece kromatin ultrayapısını daha iyi korur.
İkincisi, glutaraldehit fiksasyonundan sonra üretilen ikincil bir ligand olarak biyotinin kullanılması ve bağlanmamış aldehit gruplarının uygun şekilde söndürülmesi, hedefin kimyasal modifikasyonunu en aza indirir, böylece endojen biyotin nedeniyle arka planı azaltırken etiketleme verimliliğini arttırır. Biotin-streptavidin ayrıca floresan olarak etiketlenmiş streptavidin kullanımı prosedürün çok erken aşamasında kolay kalite kontrolü sağladığı için çok yönlülük ekler. Protokol, FloroNanogold etiketli streptavidin'in tanıtılmasıyla daha da basitleştirilebilir, ancak elimizde bu reaktifler, belki de probların daha büyük boyutlarından dolayı, Nanogold-streptavidin'e kıyasla biraz daha yüksek bir arka plan verdi.
Üçüncüsü, yaklaşık 5 nm'nin en büyük bileşeni olan streptavidin-Nanogold, küçük probların bir kombinasyonu, glutaraldehit çapraz bağlı hücrelere bile çok iyi penetrasyon sağlar. Bu, tekniği optimum ultrayapısal olarak korunmuş hücrelerin önceden gömülmesi için uygun hale getirir ve seri kesit rekonstrüksiyonu, dizi tomografisi, elektron tomografisi, seri blok yüz görüntüleme ve FIB-SEM dahil olmak üzere çeşitli 3D-elektron mikroskobu teknikleriyle kolayca uyumludur.
Gümüş geliştirme, reaktif difüzyonunun ve yıkama adımlarının hassas kontrolünü gerektiren ve yapışkan hücrelerle gerçekleştirilmesi daha kolay olan en kritik adımdır. Öte yandan, glutaraldehit ile güçlü çapraz bağlanma gümüş gelişimini de etkileyebileceğinden, kromatin yapısının korunmasını ve gümüş geliştirme verimliliğini dengelemek için sabitleme koşullarına ince ayar yapılmalıdır. Bu nedenle, daha iyi bir yapı korumasına izin vermesine rağmen, uzun süreli ve kötü kontrol edilen post-fiksasyon gerektiren kriyo-fiksasyon / kriyo-ikame teknikleri, önerilen etiketleme stratejisi23 ile tam olarak uyumlu olmayabilir. Teknik, gümüş geliştirme24 yerine Au-amplifikasyon kullanılarak daha da geliştirilebilir. Bu modifikasyon, altın tonlama adımını atlamaya izin verir, ancak ellerimizde, önemli ölçüde daha yüksek arka plan verir.
Son olarak, önceden gömme etiketleme, ChromEM için hedef hücrelerin önceden seçilmesine ve parlak alan veya floresan mikroskop altında tespit edilebilen replikasyon modeline göre bölümlemeye izin verir. Dahası, yöntem çeşitli süper çözünürlük teknikleri de dahil olmak üzere CLEM'e kolayca genişletilebilir. Bu, çeşitli fizyolojik durumlarda kromatin üst düzey yapısı ve dinamikleri çalışmalarında yeni ufuklar açar. Burada tarif ettiğimiz yaklaşım, replikasyon bölgelerinde kromatin organizasyonu çalışmaları, interfazda kromatit ayrışmasının yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi de dahil olmak üzere kromatinin replikatif sonrası yeniden düzenlenmesinin analizi ve büyük kromozomal alanların replikatif etiketlenmesi ve genomun spesifik fraksiyonlarının (replikasyon zamanlamasına göre etiketlenmiş ökromatin veya heterokromatin) daha yüksek dereceli kromatin katlanması çalışmaları için kullanılabilir. Bu tür görüntüleme teknikleri, alternatif yaklaşımlarla üretilen veriler için bir referans noktası olarak da önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen RSF (hibe #17-15-01290) ve RFBR (hibe #19-015-00273) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, görüntüleme enstrümantasyonuna erişim için Belozersky Fiziko-Kimyasal Biyoloji Enstitüsü'nde Lomonosov Moskova Devlet Üniversitesi geliştirme programına (PNR 5.13) ve Nikon Mükemmeliyet Merkezi'ne korelasyon görüntülemede teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C.
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
