이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.
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방법 논문
전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포 핵에서 DNA 폴딩의 원리와 기본적인 유전 기능 (전사, 복제, 분리 등)의 이행 중에 발생하는 동적 변형은 부분적으로 구조적으로 보존 된 핵에서 특정 염색질 유전자좌의 고해상도 시각화에 대한 실험 접근법이 부족하기 때문에 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기서 우리는 새로 합성 된 DNA의 EdU 표지와 나노 골드 입자의 Ag 증폭 및 크로마틴의 ChromEM 염색을 통한 후속 라벨 검출을 결합하여 단층 세포 배양물 에서 복제 도메인을 시각화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 상온 시료 처리를 위한 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 전통적인 글루타르알데히드 고정과 호환되는 고대비, 고효율 사전 임베딩 라벨링을 가능하게 합니다. 라벨링을 사전 임베딩하는 또 다른 이점은 단면화를 위해 관심있는 세포를 미리 선택할 수 있다는 것이다. 이것은 이종 세포 집단의 분석뿐만 아니라 복제 부위에서 크로마틴 조직의 고해상도 3D 분석에 대한 전자 단층 촬영 접근법과의 호환성, 복제 후 크로마틴 재배열 및 자매 염색질 분리의 분석에 특히 중요합니다.
서론
DNA 복제는 세포 분열 동안 유전 정보의 충실한 복사 및 전달에 필요한 기본적인 생물학적 과정입니다. 고등 진핵생물에서, DNA 복제는 엄격한 시공간-시간적 조절을 받게 되며, 이는 복제 기원의 순차적 활성화로 나타난다1. 이웃 복제 기원은 동기적으로 발사되어 replicons2의 클러스터를 형성합니다. 광학 현미경 검사의 수준에서, 진행중인 DNA 복제 부위는 다양한 수와 크기의 복제 초점으로 검출됩니다. 복제 초점은 표지된 DNA 3,4의 복제 타이밍에 따라 세포 핵 내 공간 분포의 특정 패턴을 표시하며, 이는 차례로 유전자 활성과 밀접한 상관 관계가 있다. 공간과 시간에 엄격하게 정렬된 잘 정의된 DNA 복제 시퀀스 덕분에, 복제 표지는 복제 과정 그 자체에 대한 연구뿐만 아니라 전사 활성 및 압축 수준이 정의된 특정 DNA 하위 분획을 구별하는 강력한 DNA 표지 방법입니다. 복제 크로마틴의 시각화는 일반적으로 DNA 복제 기계의 주요 단백질 성분 검출 (면역 염색 또는 형광 단백질 태그5,6의 발현) 또는 변....
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프로토콜
상기 프로토콜은 부착성 세포에 최적화되어 있으며 HeLa, HT1080 및 CHO 세포주에서 시험하였다.
1. 세포 표지 및 고정
- 산성 세척 커버 슬립에있는 플레이트 셀은 3cm 페트리 접시에 담겨 있습니다. 70% 컨플루언시로 사용되는 세포주에 권장되는 배지에서 세포를 성장시킨다.
- 10 mM 스톡으로부터 10 μM 최종 농도까지 EdU (5-에티닐-2'-데옥시우리딘)를 첨가하고, 세포를 10분 이상 동안 인큐베이터에 넣는다 (실험 목적에 따라 다름). 더 짧은 펄스 (최대 2 분)를 위해 10 μM EdU가 보충 된 미리 가온 된 신선한 배양 배지로 페트리 접시를 준비하고 EdU를 세포에 직접 첨가하는 대신 커버 슬립을 옮깁니다.
참고: 모든 후속 단계는 달리 표시되지 않는 경우 실온에서 수행됩니다. - 표지된 세포를 2.5% 글루타르알데히드로 고정시키고, 1시간 동안 100 mM 카코딜레이트 완충액에 25% 스톡을 희석하여 갓 만들었다.
참고: 후속 EdU 감지 단계는 고정 타이밍에 민감합니다. 고정 시간이 길면 EdU 라벨링에 부정적인 영향을 미쳐 신호 대 잡음비가 낮아질 수 있습니다. - 샘플을 5 mMMgCl2....
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결과
포유류 세포 핵에서의 복제 초점은 S상 진행에 따라 핵 내 분포의 뚜렷한 패턴을 나타낸다. 이러한 패턴은 복제되는 유전자좌의 전사 활성과 상관관계가 있다. 여기에 제시된 방법은 다소 강한 고정 절차를 이용하기 때문에, 실온 화학적 고정에 의해 얻어지는 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 조건 하에서도 다양한 전사 상태에서 크로마틴 유전자좌의 특정 검출을 위해 복제 펄스 라벨링을 사용하는 것은 매우 간단합니다.
품질 관리 단계는이 프로토콜의 핵심 절차를 성공적으로 완료하기위한 것입니다. 처음에는 형광 표지된 아지드와의 클릭 반응으로 성공적인 EdU 라벨링을 확인해야 하며, 이종 세포 집단을 사용할 경우 일반적인 복제 패턴을 보여 줍니다(그림 2). 두 번째 중요한 단계는 스트렙타비딘 라벨링이며, 이는 글루타르알데히드 고정에 의해 강하게 영향을 받을 수 있습니다. 스트렙타비딘 결합 효율의 평가를 위해, 스트렙타비딘-나노골드와.......
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토론
여기에 설명된 방법은 이전에 게시된 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 복제된 DNA를 표지하기 위한 클릭화학의 사용은 항체를 이용한 BrdU 검출을 위한 DNA 변성 전제조건의 필요성을 제거하여, 크로마틴 울트라구조를 더 잘 보존한다.
둘째, 글루타르알데히드 고정 및 결합되지 않은 알데히드 그룹의 적절한 담금질 후에 생성되는 보조 리간드로 비오틴의 활용은 표적의 화학적 변형을 최소화하고, 따라서 내인성 비오틴으로 인한 배경을 감소시키면서 라벨링 효율을 향상시킨다. 비오틴-스트렙타비딘은 또한 형광 표지된 스트렙타비딘의 사용이 절차의 초기 단계에서 쉬운 품질 관리를 제공하기 때문에 다재다능함을 더합니다. 이 프로토콜은 FluoroNanogold 표지 된 스트렙타비딘의 도입으로 더욱 단순화 될 수 있지만, 우리 손에서 이러한 시약은 Nanogold-streptavidin에 비해 다소 높은 배경을 제공했으며, 아마도 프로브의 크기가 더 크기 때문일 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 RSF (보조금 #17-15-01290) 및 RFBR (보조금 #19-015-00273)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 Lomonosov Moscow State University 개발 프로그램 (PNR 5.13)과 Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology의 상관 관계 이미징 분야의 Nikon Center of Excellence에 감사 드리며 이미징 계측에 대한 액세스를 제공합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| 비오틴-아지드 | Lumiprobe | C3730 | |
| 소 혈청 알부민 | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| 에폭시 수지 단량체 | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| 글루타르알데히드(25%, EM 등급) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| 아라비아 ACROS | Organics | 258850010 | |
| 염화마그네슘 | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-프로필 갈레이트 | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| 은 젖산 | 알드리치 | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 접합체 | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold 접합체 | 나노 프로브 | 2016 | |
| 테트라클로로오우산 | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 형광 필터 세트 (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | 대안 : Zeiss, Leica, Olympus |
| 다이아몬드 나이프 Ultra Wet 45o | Diatome | DU | 대안: Ted Pella |
| 형광 현미경 | Nikon | Ti-E | 대안: Zeiss, Leica, Olympus |
| 고틸트 샘플 홀더 | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| EFTEM 모드에서 200kV에서 작동하는 투과 전자 현미경, 고 틸트 고니오미터 | Jeol | JEM-2100 | 대안 : FEI, Hitachi |
| 핀셋 | Ted Pella | 523 | |
| 초박 절기 | Leica | UltraCut-E | 대안 : RMC |
| Software< / strong> | |||
| Image acquisition | 오픈 소스 | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| 이미지 처리 | 오픈 소스 | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
참고문헌
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. ....
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