Summary
이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.
Abstract
세포 핵에서 DNA 폴딩의 원리와 기본적인 유전 기능 (전사, 복제, 분리 등)의 이행 중에 발생하는 동적 변형은 부분적으로 구조적으로 보존 된 핵에서 특정 염색질 유전자좌의 고해상도 시각화에 대한 실험 접근법이 부족하기 때문에 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기서 우리는 새로 합성 된 DNA의 EdU 표지와 나노 골드 입자의 Ag 증폭 및 크로마틴의 ChromEM 염색을 통한 후속 라벨 검출을 결합하여 단층 세포 배양물 에서 복제 도메인을 시각화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 상온 시료 처리를 위한 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 전통적인 글루타르알데히드 고정과 호환되는 고대비, 고효율 사전 임베딩 라벨링을 가능하게 합니다. 라벨링을 사전 임베딩하는 또 다른 이점은 단면화를 위해 관심있는 세포를 미리 선택할 수 있다는 것이다. 이것은 이종 세포 집단의 분석뿐만 아니라 복제 부위에서 크로마틴 조직의 고해상도 3D 분석에 대한 전자 단층 촬영 접근법과의 호환성, 복제 후 크로마틴 재배열 및 자매 염색질 분리의 분석에 특히 중요합니다.
Introduction
DNA 복제는 세포 분열 동안 유전 정보의 충실한 복사 및 전달에 필요한 기본적인 생물학적 과정입니다. 고등 진핵생물에서, DNA 복제는 엄격한 시공간-시간적 조절을 받게 되며, 이는 복제 기원의 순차적 활성화로 나타난다1. 이웃 복제 기원은 동기적으로 발사되어 replicons2의 클러스터를 형성합니다. 광학 현미경 검사의 수준에서, 진행중인 DNA 복제 부위는 다양한 수와 크기의 복제 초점으로 검출됩니다. 복제 초점은 표지된 DNA 3,4의 복제 타이밍에 따라 세포 핵 내 공간 분포의 특정 패턴을 표시하며, 이는 차례로 유전자 활성과 밀접한 상관 관계가 있다. 공간과 시간에 엄격하게 정렬된 잘 정의된 DNA 복제 시퀀스 덕분에, 복제 표지는 복제 과정 그 자체에 대한 연구뿐만 아니라 전사 활성 및 압축 수준이 정의된 특정 DNA 하위 분획을 구별하는 강력한 DNA 표지 방법입니다. 복제 크로마틴의 시각화는 일반적으로 DNA 복제 기계의 주요 단백질 성분 검출 (면역 염색 또는 형광 단백질 태그5,6의 발현) 또는 변형 된 DNA 합성 전구체 7,8,9,10의 혼입을 통해 수행됩니다. . 이들 중에서, 변형된 뉴클레오티드를 새로 복제된 DNA에 혼입하는 것에 기초한 방법만이 복제 동안 크로마틴의 형태적 변화의 포획을 허용하고, 복제가 완료된 후 복제 도메인의 거동을 추적한다.
고등 진핵생물에서 염색질로의 DNA 패키징은 기본 유전 기능 (전사, 복제, 배상 등)의 조절에 또 다른 수준의 복잡성을 추가합니다. 크로마틴 폴딩은 주형 합성에 필요한 조절 트랜스 팩터 및 DNA 형태 변화 (이중 나선 풀기)에 대한 DNA의 접근성에 영향을 미칩니다. 따라서, 세포 핵에서의 DNA 의존성 합성 과정은 크로마틴의 응축되고 억압적인 상태로부터 보다 접근하기 쉽고, 개방된 형태로의 구조적 전이를 필요로 한다는 것이 일반적으로 받아들여진다. 세포학적으로, 이들 두 크로마틴 상태는 헤테로크로마틴 및 유크로마틴으로 정의된다. 그러나 핵에서 DNA 폴딩 방식에 관한 합의는 아직 이루어지지 않았다. 가설은 핵솜 섬유가 패킹 밀도가 상 분리 메커니즘에 의해 제어되는 임의의 중합체로서 행동하는 "중합체 용융" 모델(11)로부터, 두께12,13을 증가시키는 크로마틴 섬유형 구조의 순차적 형성을 가정하는 계층적 폴딩 모델에 이르기까지 다양하다. 계층적 폴딩 모델은 최근 계내 DNA-DNA 접촉(염색체 입체 형태 포획, 3C)의 분석에 기초한 분자 접근법으로부터 지지를 얻었으며, 이는 크로마틴 구조 도메인(14)의 계층 구조의 존재를 입증한다. 복제 단위는 이러한 크로마틴 도메인(15)과 매우 잘 상관관계가 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 이들 모델에 대한 주요 비판은 다양한 프로브 (예 : 항체)에 대한 크로마틴 접근성을 향상시키면서 초 구조 연구를 위해 크로마틴 대비를 개선하기 위해 세포막의 투과 및 비 염색질 성분의 제거와 같은 샘플 준비 절차에 의해 야기 된 잠재적 인 인공 염색질 응집에 기초합니다. DNA 결합 형광단에 의한 전자 현미경을 위한 선택적 DNA 염색의 최근 기술 발전은 디아미노벤지딘(ChromEMT6)의 광산화-매개 이러한 장애물의 제거를 허용하였다. 그러나, DNA17,18을 복제하는 전자 현미경 시각화에 대해서도 동일한 고려사항이 적용된다. 여기서 우리는 무손상 알데히드 가교 세포에서 새로 합성 된 DNA와 총 크로마틴의 동시 고해상도 초구조적 매핑을 가능하게하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 클릭 화학에 의한 EdU 표지 DNA의 검출을 비오티닐화 프로브 및 스트렙타비딘-나노골드 및 ChromEMT와 결합합니다.
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Protocol
상기 프로토콜은 부착성 세포에 최적화되어 있으며 HeLa, HT1080 및 CHO 세포주에서 시험하였다.
1. 세포 표지 및 고정
- 산성 세척 커버 슬립에있는 플레이트 셀은 3cm 페트리 접시에 담겨 있습니다. 70% 컨플루언시로 사용되는 세포주에 권장되는 배지에서 세포를 성장시킨다.
- 10 mM 스톡으로부터 10 μM 최종 농도까지 EdU (5-에티닐-2'-데옥시우리딘)를 첨가하고, 세포를 10분 이상 동안 인큐베이터에 넣는다 (실험 목적에 따라 다름). 더 짧은 펄스 (최대 2 분)를 위해 10 μM EdU가 보충 된 미리 가온 된 신선한 배양 배지로 페트리 접시를 준비하고 EdU를 세포에 직접 첨가하는 대신 커버 슬립을 옮깁니다.
참고: 모든 후속 단계는 달리 표시되지 않는 경우 실온에서 수행됩니다. - 표지된 세포를 2.5% 글루타르알데히드로 고정시키고, 1시간 동안 100 mM 카코딜레이트 완충액에 25% 스톡을 희석하여 갓 만들었다.
참고: 후속 EdU 감지 단계는 고정 타이밍에 민감합니다. 고정 시간이 길면 EdU 라벨링에 부정적인 영향을 미쳐 신호 대 잡음비가 낮아질 수 있습니다. - 샘플을 5 mMMgCl2 로 보충된 PBS로 세척하여 글루타르알데히드를 제거하였다 (그 후 PBS*). 각 세척에 대해 10분 인큐베이션으로 세 번 세척한다.
- PBS*에서 1% 트리톤 X-100으로 원형질막을 투과시킨다(그 후 PBS*T). 각 세척에 대해 5 분 인큐베이션으로 두 번 씻으십시오.
- PBS*로 샘플을 광범위하게 세척하십시오. 다섯 가지 변화를 수행하고 각 변화에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 잔류하는 무함유 알데히드 그룹을 PBS* 중의 20 mM 글리신으로 각각 10분 동안 두 번 담금질한다.
- 샘플을 30분 동안 PBS* 중의 1% BSA로 차단한다.
2. 클릭반응
참고: 이 절차는 이전에 게시된 프로토콜19에서 수정되었습니다.
- 사용 직전에, EdU 검출을 위한 클릭-반응 믹스를 준비한다: 마이크로원심분리 튜브에서, 430 μL의 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 20 μL의 100 mM CuSO4, 1.2 μL의 비오틴-아지드 (DMSO 중 10 mM), 및 50 μL의 0.5 M 아스코르브산을 혼합한다. 형광 현미경 검사의 수준에서 복제 표지 및 클릭 절차의 품질 관리를 위해, 비오틴-아지드는 AlexaFluor 488-azide로 대체될 수 있다.
참고 : 위의 반응에서 성분의 첨가 순서는 중요합니다. - 습한 챔버에서 클릭 반응을 수행하여 반응 칵테일의 증발 및 농도 이동을 최소화하십시오. 젖은 여과지 시트를 페트리 접시의 바닥에 놓고 파라핀 필름으로 덮어서 촉촉한 챔버를 준비하십시오. 커버슬립을 필름 표면에 놓고 셀을 위로 향하게 하고 50-100 μL의 반응 칵테일을 커버슬립 위에 겹쳐 놓습니다. 반응은 실온에서 30 분이 소요된다.
- PBS*(PBS*T)로 0.1% 트리톤 X-100으로 샘플을 세척하고, 각각 5분 동안 5회 세척하여 반응을 중지시킨다.
- 실온에서 30분 동안 PBS*T의 1% BSA를 차단합니다.
- 스트렙타비딘-나노골드 용액을 1% BSA를 함유한 PBS*T로 준비합니다. 새로 준비된 습한 챔버에서 +4°C에서 하룻밤 동안 1% BSA + PBS*T에서 1.4 nm 나노골드 입자(나노프로브)와 접합된 스트렙타비딘으로 샘플을 인큐베이션한다.
- 반응을 중지하고 PBS*T로 샘플을 세척하고, 각각 10분 동안 다섯 번 세척한다.
- PBS*의 1% 글루타르알데히드에 30분 동안 후고정시킴으로써 비오틴 스트렙타비딘 복합체를 안정화시킨다.
- 탈이온수로 강렬한 세척으로 글루타르알데히드를 제거하고 PBS*로 샘플을 각각 20분 동안 다섯 번 세척한다.
- 물에 갓 준비된 1 mg/mL NaBH4로 유리 알데히드 그룹을 담금질하고, 각각 10분 동안 두 번 담금질한다. 인큐베이션 동안, 커버슬립을 들어 올릴 수 있는H2의 기포가 형성된다. 핀셋으로 조심스럽게 밀어 내립니다.
- 탈이온수로 각각 5 분 동안 5 번 씻으십시오.
참고: 라벨링 단계에서 품질 관리를 위해서는 형광 라벨이 붙은 스트렙타비딘으로 제어 라벨링을 수행하는 것이 좋습니다(그림 2). 이렇게 하면 지루하고 아티팩트가 발생하기 쉬운 후속 단계로 전환하기 전에 레이블링 강도와 배경 수준을 추정할 수 있습니다.
3. Ag 증폭
참고: 이 절차는 Gilerovitch et al., 1995 (20,21 참조)에서 수정되었습니다.
- 아카시아 분말 50g을 탈이온수 100mL에 재현탁한다. 3 일 동안 녹이고 가스를 제거하고 치즈 천의 네 층을 통해 여과하십시오. 50mL 튜브에 5mL 분취량으로 냉동 보관하십시오. 사용 직전에 해동하십시오.
- 아카시아 분말 용액의 해동된 분취량 5 mL에 2 mL의 1 M MES (pH = 6.1)를 첨가하여 아카시아 분말 용액에 7 mL의 0.28 M MES (pH = 6.1)를 만든다. 튜브를 천천히 30 분 동안 흔들어서 혼합하십시오. 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 호일로 감싸십시오.
- 단계 3.2.와 동시에, 커버슬립을 세척 완충액 (50 mM MES, pH = 5.8, 200 mM 수크로오스)으로 각각 10분 동안 3회 세척한다.
- N-프로필 갈레이트(NPG)의 신선한 용액을 준비한다. 15 mL 튜브에서, 10 mg의 NPG를 96% 에탄올의 250 μL에 용해시키고, 탈이온수로 5 mL로 조정한다.
- 호일 싸인 15 mL 튜브에 은락테이트 36 mg을 넣는다.
- 3.2 단계 이후. 완료되면, NPG 용액 1.5 mL를 아카시아 분말 믹스에 첨가하고, 또 다른 3분 동안 암석시킨다.
참고: 이후의 모든 단계는 암실에서 수행됩니다. 비-actinic 안전 표시등(노란색 또는 빨간색)을 사용합니다. - 샘플을 세척 완충액으로 평형화시키고 암실로 진행하십시오. 동시에, 은유에 탈이온수 5 mL를 첨가하고 1-2 분 동안 격렬하게 흔들어서 용해시킨다.
- 아카시아 분말 믹스에 은락테이트 용액 1.5 mL를 넣고 1 분 동안 천천히 흔든다. 믹스의 산소가 반응을 늦추기 때문에 거품 형성을 피하십시오.
- 커버슬립으로 접시에서 용액을 배출하고 세포에 은락테이트-아카시아 파우더 믹스 3mL를 붓습니다. 접시를 여러 번 흔들고 2-5 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 시간은 아카시아 분말 배치 및 온도에 따라 달라집니다. 이것은 실험적으로 정의되어야합니다.
참고: 인큐베이션 시간이 길어지면 비특이적인 은 결합이 발생할 수 있습니다. - 반응을 멈추려면 반응 믹스를 배수하고 탈이온수를 세 ~ 5 회 변화시킨 다음 각각 5 분 동안 세 번 더 바꿔 접시를 광범위하게 씻으십시오.
- 염색을 브라이트필드 현미경으로 확인한다. 좋은 염색은 매우 희미한 황색 배경을 가진 밝은 갈색에서 짙은 갈색이어야합니다.
참고 : 염색이 진행되지 않으면 이미 만들어진 믹스로 즉시 반복 할 수 있습니다 (어둠 속에 보관하면 믹스가 약 15 분 동안 활성화됩니다). 그러나이 경우 염색이 너무 빨리 진행될 수 있습니다.
4. 금 토닝
참고: 후속 절차에서 OsO4 산화에 의한 용해로부터 은 나노입자를 보호하기 위해, 이 단계에서 금으로 함침시키는 것이 사용된다(Sawada, Esaki, 1994)22.
- 커버슬립을 탈이온수로 헹구십시오.
- OsO4 산화에 의한 용해로부터 은 나노입자를 보호하기 위해, 샘플을 어둠 속에서 2분 동안 0.05% 테트라클로로우르산으로 인큐베이션한다.
- 탈이온수로 10 분 동안 철저히 씻으십시오.
참고 :이 단계에서 추가 대비가 함유 된 DNA에 첨가됩니다. 샘플의 색상은 갈색에서 검은 색으로 바뀌어야합니다.
5. 크롬엠
참고: 이 프로토콜은 Ou et al., 201716에서 수정되었습니다.
- 커버슬립을 인큐베이션하고, 샘플을 어둠 속에서 10분 동안 PBS 중의 10 μM DRAQ5로 포화시킨다.
- 50 mM 트리스 또는 PBS에 0.2% 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) 용액을 제조하였다:
어둠 속에서 격렬하게 교반하여 DAB를 최종 부피의 90%에 용해시킨 다음, NaOH로 pH를 7.0-7.4로 조정한다. 부피를 100%로 조정하고 0.22 μM 필터를 통해 필터하고, 호일에 싸서 보관한다. - DAB 용액을 세포 (3 cm 페트리 접시 당 2 mL)에 첨가하고 1 분 동안 인큐베이션한다.
- 커버 슬립을 유리 바닥 페트리 접시로 옮겨 거꾸로 된 현미경의 무대에 놓습니다. 10분 동안 Plan Apo λ 40х(NA = 0.95) 렌즈를 통해 금속 할로겐화물 광원과 Cy5 필터 세트(초점면에서 640nm, 1W/cm2)로 반전된 현미경에 샘플(여러 시야)을 조사합니다.
참고 : 성공적인 DAB 광변환의 표시는 조사 된 핵에서 완전한 DRAQ5 광표백 및 어두운 DAB 침전물 형성입니다. 그러나 후자는 강렬한 EdU-silver-gold 신호에서 항상 명백한 것은 아닙니다 (특히 확장 된 EdU 펄스가 활용되는 경우). - 탈이온수로 각각 5 분 동안 세 번 씻으십시오.
6. 탈수 및 에폭시 수지 임베딩
- 마이크로 원심분리 튜브에서, K4Fe(CN)6의 2% 수용액과 동량의 2%OsO4 수용액을 혼합하여 부분적으로 환원된 사산화오스뮴 용액을 준비하여, 두 성분의 최종 농도 1%를 얻는다. 환원된OsO4 에서 커버슬립을 1시간 동안 인큐베이션하고, 각각 5분 동안 탈이온수에서 3회 세척한다.
참고: 이 단계에서 감소된 오스뮴 화합물은 DAB 침착과 반응하여 DNA의 대비를 증가시킵니다.
주의: 오스뮴은 독성이 있으며 흄 후드 아래에서 작업하며 현지 안전 규정에 따라 폐기물을 처리합니다. - 샘플을 일련의 등급화된 에탄올 용액으로 탈수시켜 백분율을 증가시킨다: 50% EtOH - 3 x 10분; 70% EtOH - 3 x 10 분, 80% EtOH - 3 x 10 분, 96% EtOH - 3 x 10 분, 100% EtOH - 3 x 10 분.
- 침투 및 매립을 위해 다음과 같이 성분 부피 비율의 수지 공식을 사용하십시오 : 에폭시 수지 단량체 : DDSA:MNA : DMP-30 = 9 : 6 : 4 : 0.23 (W / W). 이 공식은 에탄올과 혼화성이다.
- 커버슬립을 에탄올-수지 믹스(3부 100% EtOH:1부 에폭시 수지)에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 커버슬립을 에탄올-수지 믹스(1부 100% EtOH:1부 에폭시 수지)에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
- 커버슬립을 에탄올-수지 믹스(1부 100% EtOH:에폭시 수지 3부)에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
- 에탄올 - 수지 믹스를 갓 준비된 순수한 수지로 교체하십시오. 순수한 수지 믹스에서 8 h 동안 인큐베이션한다. 접시를 열어 에탄올의 잔해가 증발하도록하십시오.
- 커버슬립을 순수한 수지로 새 접시에 옮기고 37-42°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
- 실리콘 몰드를 갓 준비된 수지로 채 웁니다. 셀이 아래를 향하도록 커버슬립을 에폭시 수지로 채워진 적절한 실리콘 몰드 위에 놓습니다. 수지를 37°C에서 24시간 동안 경화시킨 다음, 60°C에서 적어도 2일 동안 경화시킨다.
주의: 에폭시 수지 혼합의 성분은 잠재적인 발암 물질입니다. 장갑을 착용하고 흄 후드 아래에서 작업하십시오.
- 몰드에서 수지 슬래브를 제거하고 메스 또는 면도날로 커버 슬립 표면을 청소하십시오. 커버슬립을 제거하려면 커버슬립을 액체 질소에 떨어뜨린 다음 슬래브를 끓는 물에 옮깁니다. 필요한 경우 반복하십시오.
- 입체 현미경으로 조사 된 영역을 찾아 쇠톱이나 다른 적절한 장비로 슬래브에서 잘라냅니다. 필요에 따라 슬래브를 핫플레이트 상에서 70°C에서 미리 데우십시오.
- 컷아웃을 울트라마이크로톰 샘플 홀더에 고정하여 최종 블록 트리밍을 수행합니다. 면도기를 사용하여 피라미드 모양의 샘플을 준비하십시오. 피라미드가있는 홀더를 울트라 마이크로 톰에 장착하고 칼을 설치하십시오.
- EdU 레이블이 있는 조사된 셀이 포함되도록 블록을 트리밍합니다. 전자 단층 촬영에 적합한 반박형 섹션 (250 nm 두께)을 준비하십시오.
참고: 섹션 두께는 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다.
- EdU 레이블이 있는 조사된 셀이 포함되도록 블록을 트리밍합니다. 전자 단층 촬영에 적합한 반박형 섹션 (250 nm 두께)을 준비하십시오.
- 칼 가장자리에서 부분을 분리하여 단일 슬롯 그리드에 놓습니다. 전자 단층 촬영의 경우, 250nm 섹션은 1mm 단일 슬롯 그리드 상에 선택되며 건조 후이 섹션은 양쪽에서 탄소 코팅 될 수 있습니다. 추가 대조는 필요하지 않습니다.
참고: 섹션에는 이미 고대비 Au-Ag 입자가 포함되어 있으므로 단면 표면에 신탁 금 입자를 추가할 필요가 없습니다. - 낮은 배율 (약 600x)에서 투과 전자 현미경으로 그리드를 검사하여 적절한 복제 패턴을 가진 세포를 찾습니다.
참고: 이 프로토콜은 낮은 배율에서도 복제 초점을 쉽게 감지할 수 있을 만큼 충분히 높은 라벨링 밀도를 생성합니다. 먼저 단층 촬영을위한 후속 탐색 및 각도 투영 수집을위한 섹션의지도를 만드는 것이 좋습니다. 더 높은 배율로 전환하고 고해상도 이미지를 촬영합니다.
7. 전자 단층 촬영
- 그리드를 높은 기울기 홀더가있는 투과 전자 현미경에 삽입하십시오. 샘플을 전자 현미경에 넣고 관심 영역을 찾습니다.
- EFTEM 모드의 현미경을 거의 평행 조명 모드로 정렬합니다. 제로 손실 피크에 배치된 20eV 에너지 선택 슬릿으로 에너지 필터를 조정합니다.
- 단층 촬영 획득 영역을 적어도 1.5-2 분 동안 40 e / Å 2 / s의 용량 속도로 사전 조사하며, 이는 적어도 3000 e / Å2의 총 용량에 해당합니다.
- SerialEM에서 자동 작업으로 eucentric 높이를 조정합니다. 자동 초점 작업을 확인하여 제로 틸트 각도 및 -0.8mkm 목표 디포커스 값에서 올바르게 작동하는지 확인합니다.
- 워크업 작업을 통해 샘플 홀더를 -60°로 기울입니다.
- 단층 촬영 수집을 -60°에서 +60°까지 2.0° 단계로 설정합니다. 노출은 카메라의 평균 강도를 유지하기 위해 기울기 각도에 따라 설정되어야 합니다. 에너지 이동을 일으켜 정렬 불량을 일으킬 경우 이미지 이동을 제한하십시오. 단층 촬영 데이터는 .mrc 파일로 저장해야합니다.
- 단층 촬영 재구성을 위해 .mrc 파일을 IMOD 소프트웨어로 가져옵니다. X선으로 인한 이상값 픽셀 값을 제거합니다.
- 틸트 계열을 정렬합니다. 초기 상호 상관 관계를 수행 한 다음 수동으로 10-12 금 입자를 신탁으로 표시하십시오. 신탁 모델을 추적하고 모든 신탁이 틸트 시리즈를 통해 올바르게 추적되는지 검사합니다. 샘플 단층 촬영 (슬라이스)을 만들고 수동으로 얇은 섹션 테두리를 표시하여 볼륨 내부의 재구성 된 밀도가 기울어 질 수 없도록하십시오. 미세 정렬에 대한 평균 잔류 오차는 1.2pix 미만이었다.
- 필터링된 백 프로젝션 알고리즘을 사용하여 토모그램을 재구성한 다음 관심 영역을 최종 볼륨에 맞게 출력을 트리밍합니다.
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Representative Results
포유류 세포 핵에서의 복제 초점은 S상 진행에 따라 핵 내 분포의 뚜렷한 패턴을 나타낸다. 이러한 패턴은 복제되는 유전자좌의 전사 활성과 상관관계가 있다. 여기에 제시된 방법은 다소 강한 고정 절차를 이용하기 때문에, 실온 화학적 고정에 의해 얻어지는 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 조건 하에서도 다양한 전사 상태에서 크로마틴 유전자좌의 특정 검출을 위해 복제 펄스 라벨링을 사용하는 것은 매우 간단합니다.
품질 관리 단계는이 프로토콜의 핵심 절차를 성공적으로 완료하기위한 것입니다. 처음에는 형광 표지된 아지드와의 클릭 반응으로 성공적인 EdU 라벨링을 확인해야 하며, 이종 세포 집단을 사용할 경우 일반적인 복제 패턴을 보여 줍니다(그림 2). 두 번째 중요한 단계는 스트렙타비딘 라벨링이며, 이는 글루타르알데히드 고정에 의해 강하게 영향을 받을 수 있습니다. 스트렙타비딘 결합 효율의 평가를 위해, 스트렙타비딘-나노골드와 동일한 조건에서 알렉사플루오르-488 컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 사용한다(그림 3). 이 시점에서, 일부 배경은 주로 글루타르알데히드 자가형광 및 불완전한 스트렙타비딘 세척으로 인해 예상된다. 신호 대 잡음비가 허용되지 않는 경우 2.6단계에서 세척 단계의 수와 지속 시간을 늘려 보십시오. 대안적으로, 단계 1.5 후에 NaBH4로 담금질된 글루타르알데히드를 첨가한다(단계 2.9-2.10).
실버 향상 절차는 종종 일관성없는 결과를 생성하고 최적화가 필요합니다. 첫째, 반응 속도는 아카시아 분말 용액 배치에 따라 극적으로 변한다. 용액의 점도는 은 염색 발생 시간에 반비례한다. 동일한 배치의 여러 분취량을 가지고 대조군 샘플에서 테스트하여 최적의 반응 타이밍을 결정하는 것이 좋습니다. 시약의 온도와 환경 또한 반응 속도에 큰 영향을 미치므로 정확히 동일한 온도에서 반응을 수행하십시오. 세 개 이상의 샘플을 동시에 처리하는 경우, 세척 단계를 위한 충분한 시간을 갖도록 30초 간격으로 반응을 시작하는 것이 편리하다.
은 강화 절차의 좋은 결과는 매우 희미한 황색 세포질 염색으로 일부 (전부는 아님) 핵의 짙은 갈색 염색입니다 (그림 4). 이는 은 입자의 평균 크기가 약 20nm임을 의미하며, 이는 크로마틴 역염색을 통한 TEM의 광범위한 배율 범위에서 쉽게 라벨 검출에 적합하다. 단층 촬영 실험의 경우, 반응 시간을 단축시킴으로써 입자의 크기를 약 10 nm로 줄여야합니다. 이 경우 색상은 연한 갈색 또는 붉은 색이어야합니다. 금 토닝 전에 은색 염색의 색상을 확인해야합니다.
DAB 광변환 및 삼투는 은색 껍질을 용해로부터 보호하기 위해 금 토닝 후에 수행됩니다. 불충분 한 금 함침의 경우,은 나노 입자가 침식되어 불규칙한 모양을 얻지만 TEM 아래에서는 여전히 볼 수 있습니다. DAB 광변환의 품질은 먼저 DRAQ5 표백(형광 모드)에 의해 모니터링된 다음, 조사된 필드의 세포 핵이 암갈색이 될 때 밝은 필드 모드에서 모니터링됩니다(그림 5). DAB 염색 강도는 Ag-Au 염색이 잘 검출된 채로 유지되도록 매우 높지 않아야 하며, 이는 절편에 필요한 복제 타이밍을 갖는 세포의 선택을 허용한다.
초박형 또는 반박형 절편은 추가적인 염색이 필요하지 않으며 TEM 아래에서 직접 볼 수 있습니다. 적절한 표지는 일반적으로 복제 부위를 경계하는 Ag 나노 입자의 잘 정의 된 클러스터를 초래하지만 (그림 6), 배경 표지는 평방 마이크로 미터 당 몇 개의 나노 입자로 제한됩니다. 반박형 섹션은 단층 촬영을 위해 준비되었으며 단면에 존재하는 Ag 나노 입자가 신탁 마크로 사용될 수 있으므로 단면 표면에 금 나노 입자를 첨가 할 필요가 없습니다 (그림 7). 이 그림에서는 장기간 라벨링 시간의 효과가 표시됩니다 : 개별 복제 초점이 섬유형 구조로 융합되어 고차 크로마틴 도메인을 묘사합니다.
그림 1. 메서드 개요입니다. 커버슬립 상에서 성장한 세포는 EdU로 표지되고, 2.5% 글루타르알데히드로 고정되고, 투과되고, 클릭-비오티닐화 아지드로 반응이 수행된다. 대안적으로, 형광 표지된 아지드는 광현미경 관찰에 사용된다. 비오틴 혼입의 부위는 나노골드-스트렙타비딘 (또는 대조군으로서 형광 표지된 스트렙타비딘)으로 표지되고, 은을 강화하고, 금 토닝 후 DRAQ5 매개된 DAB 광변환 및 삼투를 실시한다. 샘플은 에폭시 수지에 매립되고, 절개되고, TEM에서 검사되고, 전자 단층 촬영을 실시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. EdU 라벨링 및 클릭 반응 (녹색)에 의해 밝혀진 포유류 세포의 복제 패턴. S상 진행은 초기부터 후반까지 S상(왼쪽에서 오른쪽으로)으로 나타나며, 복제패턴의 질서 정연한 변화에 의해 나타난다: A,B - 초기 S상, C-S-중간상, D,E-후기 S상. DNA는 DAPI (적색)로 염색된다. 스케일 바 = 10 um. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. EdU 표지 및 글루타르알데히드 고정 후 두 단계 클릭-비오틴 및 스트렙타비딘-알렉사플루오르 488 염색에 의해 밝혀진 포유동물 세포에서의 복제 패턴. 스트렙타비딘-알렉사플루오르 488로 라벨링된 대조 샘플은 글루타르알데히드 고정 후 최적의 라벨링 효율과 S/N 비율을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 은 강화 절차 후의 세포의 대표적인 이미지(단계 3). 다양한 복제 패턴(초기 S상, 화살표, 중간 S상, 화살촉, 후기, 이중 화살표)은 밝은 필드 광 현미경 모드에서 쉽게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. DRAQ5 매개 DAB 광변환의 전형적인 결과입니다. (a) DRAQ5 염색 (점선 원은 조사된 영역을 나타냄). 원 안에 강한 DRAQ5 표백이 있음을 주목하십시오. (B) 밝은 필드 광학 현미경에서 볼 수있는 동일한 영역. 조사된 영역에서 핵에서 더 강한 DAB 침전을 주목하라. 삽입: 화살표는 Ag-Au로 표지된 복제 패턴이 DRAQ5-광산화된 DAB 염색의 배경에서 여전히 쉽게 검출될 수 있는 초기 S상 핵을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. EdU 표지 및 글루타르알데히드 고정 후 두 단계 클릭-비오틴 및 스트렙타비딘-나노골드 염색에 의해 밝혀진 포유동물 세포 핵에서의 복제 초점. S상 전지의 얇은 90nm 절편은 복제 초점(A, 적색 원)에서 Ag-Au 나노입자의 클러스터를 나타낸다. 배경 레벨은 비S상 셀(B)에서 인식될 수 있다. 화살촉은 다양한 규모의 크로마틴 섬유를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 250 nm 단면의 0°-틸트 돌기. (A) 및 가상 단층 촬영 섹션. (b) 2시간 동안 EdU로 표지된 세포 핵. 섬유형 구조(화살촉)에 융합된 개별 복제 초점을보십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 방법은 이전에 게시된 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 복제된 DNA를 표지하기 위한 클릭화학의 사용은 항체를 이용한 BrdU 검출을 위한 DNA 변성 전제조건의 필요성을 제거하여, 크로마틴 울트라구조를 더 잘 보존한다.
둘째, 글루타르알데히드 고정 및 결합되지 않은 알데히드 그룹의 적절한 담금질 후에 생성되는 보조 리간드로 비오틴의 활용은 표적의 화학적 변형을 최소화하고, 따라서 내인성 비오틴으로 인한 배경을 감소시키면서 라벨링 효율을 향상시킨다. 비오틴-스트렙타비딘은 또한 형광 표지된 스트렙타비딘의 사용이 절차의 초기 단계에서 쉬운 품질 관리를 제공하기 때문에 다재다능함을 더합니다. 이 프로토콜은 FluoroNanogold 표지 된 스트렙타비딘의 도입으로 더욱 단순화 될 수 있지만, 우리 손에서 이러한 시약은 Nanogold-streptavidin에 비해 다소 높은 배경을 제공했으며, 아마도 프로브의 크기가 더 크기 때문일 수 있습니다.
셋째, 작은 프로브의 조합, 스트렙타비딘-나노 골드는 약 5 nm의 가장 큰 성분이며, 글루타르 알데히드 가교 된 세포에도 매우 우수한 침투를 제공합니다. 따라서 이 기술은 최적으로 초구조적으로 보존된 세포의 라벨링을 사전 임베딩하는 데 적합하며 직렬 섹션 재구성, 어레이 단층 촬영, 전자 단층 촬영, 직렬 블록 얼굴 이미징 및 FIB-SEM을 포함한 다양한 3D 전자 현미경 기술과 쉽게 호환됩니다.
실버 향상은 시약 확산 및 세척 단계를 정밀하게 제어해야 하는 가장 중요한 단계로, 부착 세포로 더 쉽게 수행할 수 있습니다. 한편, 글루타르알데히드와의 강한 가교결합은 또한 은 증진에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 크로마틴 구조 보존과 은 증진 효율의 균형을 맞추기 위해서는 고정 조건을 미세 조정해야 한다. 이러한 이유로, 더 나은 구조 보존을 허용하지만, 연장되고 제대로 제어되지 않은 후고정을 필요로 하는 냉동-고정/냉동-치환 기술은 제안된 라벨링 전략(23)과 완전히 양립되지 않을 수 있다. 이 기술은 은 향상(24) 대신에 Au-증폭을 사용함으로써 더욱 개선될 수 있다. 이 수정을 통해 금 토닝 단계를 건너 뛸 수 있지만 우리 손에는 상당히 높은 배경을 제공합니다.
마지막으로, 사전 임베딩 라벨링을 통해 ChromEM에 대한 표적 세포를 미리 선택하고 브라이트필드 또는 형광 현미경에서 검출할 수 있는 복제 패턴을 기반으로 단면화를 수행할 수 있습니다. 더욱이, 상기 방법은 다양한 초분해능 기술을 포함하는 CLEM으로 용이하게 확장될 수 있다. 이것은 다양한 생리 학적 상태에서 염색질 고차 구조와 역학에 대한 연구에서 새로운 지평을 열어줍니다. 우리가 여기에 설명 한 접근법은 복제 부위에서의 크로마틴 조직 연구, 간상에서의 크로마티드 분리의 고해상도 이미징을 포함한 크로마틴의 복제 후 재배열 분석, 큰 염색체 도메인의 복제 표지 및 게놈의 특정 분획 (유크로마틴 또는 헤테로 크로마틴, 복제 타이밍에 따라 표지 됨)의 고차 크로마틴 폴딩 연구에 사용될 수 있습니다. 이러한 유형의 이미징 기술은 대안적인 접근법에 의해 생성된 데이터의 기준점으로서 또한 중요하다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 RSF (보조금 #17-15-01290) 및 RFBR (보조금 #19-015-00273)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 Lomonosov Moscow State University 개발 프로그램 (PNR 5.13)과 Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology의 상관 관계 이미징 분야의 Nikon Center of Excellence에 감사 드리며 이미징 계측에 대한 액세스를 제공합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
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