Summary
Este protocolo apresenta uma técnica para mapeamento de alta resolução de locais de replicação em cromatina estruturalmente preservada in situ que emprega uma combinação de rotulagem EdU-streptavidin-Nanogold pré-incorporação e ChromEMT.
Abstract
Os princípios de dobramento do DNA no núcleo celular e suas transformações dinâmicas que ocorrem durante o cumprimento de funções genéticas básicas (transcrição, replicação, segregação, etc.) permanecem mal compreendidos, em parte devido à falta de abordagens experimentais para visualização de alta resolução de locis de cromatina específica em núcleos estruturalmente preservados. Aqui apresentamos um protocolo para a visualização de domínios replicativos na cultura de células monocamadas in situ, combinando rotulagem EdU de DNA recém-sintetizado com posterior detecção de rótulo com amplificação ag de partículas nanogold e coloração chromEM de cromatina. Este protocolo permite a rotulagem pré-incorporação de alto contraste e alta eficiência, compatível com a fixação tradicional de glutaraldeído que fornece a melhor preservação estrutural da cromatina para o processamento da amostra de temperatura ambiente. Outra vantagem da rotulagem pré-incorporação é a possibilidade de pré-selecionar células de interesse para secção. Isso é especialmente importante para a análise de populações de células heterogêneas, bem como compatibilidade com abordagens de tomografia eletrônica para análise 3D de alta resolução da organização cromatina em locais de replicação, e a análise do rearranjo pós-replicativo da cromatina e da segregação cromátide irmã na interfase.
Introduction
A replicação do DNA é um processo biológico básico necessário para cópia e transmissão fiel das informações genéticas durante a divisão celular. Em eucariotes mais altos, a replicação de DNA é submetida a uma regulação espátula-temporal apertada, que se manifesta na ativação sequencial das origens de replicação1. Origens de replicação vizinhas disparando sincronizadamente formam aglomerados de replicons2. Ao nível da microscopia óptica, locais de replicação contínua de DNA são detectados como focos de replicação de vários números e tamanhos. Os focos de replicação exibem padrões específicos de distribuição espacial dentro do núcleo celular, dependendo do tempo de replicação do DNArotulado 3,4, que, por sua vez, está fortemente correlacionado com sua atividade genética. Graças à sequência bem definida de replicação de DNA, estritamente ordenada no espaço e no tempo, a rotulagem replicativa é um método poderoso de rotulagem precisa de DNA não apenas para o estudo do processo de replicação em si, mas também para discriminar uma sub fração de DNA específica com atividade de transcrição definida e nível de compactação. A visualização da cromatina replicante é geralmente realizada através da detecção de componentes proteicos principais de máquinas de replicação de DNA (seja por imunostaining ou por expressão de marcas de proteína fluorescente 5,6) ou pela incorporação de precursores de síntese de DNA modificados 7,8,9,10 . Destes, apenas métodos baseados na incorporação de nucleotídeos modificados em DNA recém-replicado permitem a captura de alterações conformais na cromatina durante a replicação, e traçam o comportamento dos domínios replicativos após sua replicação ser concluída.
Em eucariotes mais altos, a embalagem de DNA em cromatina adiciona outro nível de complexidade à regulação de funções genéticas básicas (transcrição, replicação, reparação, etc.). A dobra de cromatina afeta a acessibilidade do DNA a fatores transregulatórios e alterações conformais de DNA (duplo desenrolar de hélice) necessárias para a síntese do modelo. Portanto, é geralmente aceito que processos sintéticos dependentes de DNA no núcleo celular requerem uma transição estrutural da cromatina de seu estado condensado e repressivo para uma conformação mais acessível e aberta. Citologicamente, esses dois estados de cromatina são definidos como heterocromatina e eucromatina. No entanto, ainda não há consenso sobre o modo de dobramento de DNA no núcleo. As hipóteses variam de um modelo11 de "derretimento de polímeros", onde a fibra nucleosômica se comporta como um polímero aleatório para o qual a densidade de embalagem é controlada por mecanismos de separação de fase, até modelos hierárquicos dobráveis postulando formação sequencial de estruturas de fibras de cromatina de espessura crescente12,13. Modelos hierárquicos dobráveis recentemente ganharam apoio de abordagens moleculares com base na análise de contatos in situ DNA-DNA (captura de conformação cromossomo, 3C), demonstrando a existência da hierarquia dos domínios estruturais da cromatina14. É importante notar que as unidades de replicação se correlacionam muito bem com esses domínios de cromatina15. A maior crítica desses modelos baseia-se na potencial agregação artificial de cromatina causada por procedimentos de preparação de amostras, como permeabilização de membranas celulares e remoção de componentes não cromatinas, a fim de melhorar o contraste da cromatina para estudos ultraestruturais, melhorando a acessibilidade da cromatina para várias sondas (por exemplo, anticorpos). Os recentes avanços técnicos na coloração seletiva de DNA para microscopia eletrônica por foto-oxidação mediada por fluoroforino mediado pelo DNA de diaminobenzidina (ChromEMT6) permitiram a eliminação deste obstáculo. No entanto, as mesmas considerações são verdadeiras para a visualização da microscopia eletrônica da replicação do DNA17,18. Aqui descrevemos uma técnica que permite o mapeamento ultraestrutural de alta resolução simultânea do DNA recém-sintetizado e cromatina total em células intactas cruzadas de aldeído. A técnica combina a detecção de DNA rotulado pela EdU por click-química com sondas biotiniladas e streptavidin-Nanogold, e ChromEMT.
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Protocol
O protocolo é otimizado para células aderentes e foi testado nas linhas celulares HeLa, HT1080 e CHO.
1. Rotulagem e fixação de células
- Células de placa em tampas limpas com ácido em uma placa de Petri de 3 cm. Cultivar as células na mídia recomendadas para a linha celular sendo usada para 70% de confluência.
- Adicione EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) de 10 mM de estoque para 10 μM de concentração final e coloque as células na incubadora por 10 minutos ou mais (dependendo do objetivo do experimento). Para pulsos mais curtos (até 2 minutos), prepare uma placa de Petri com mídia de cultura fresca pré-aquecida complementada com 10 μM EdU, e transfira tampas nele, em vez de adicionar EdU às células diretamente.
NOTA: Todas as etapas subsequentes são realizadas à temperatura ambiente, se não for indicada de outra forma. - Fixar as células rotuladas com glutaraldeído de 2,5%, recém-feito pela diluição de 25% do estoque em tampão de cacodilato de 100 mM, por 1h.
NOTA: As etapas subsequentes de detecção do EdU são sensíveis ao tempo de fixação. Tempos de fixação mais longos podem afetar negativamente a rotulagem edu, causando menor relação sinal-ruído. - Remova o glutaraldeído lavando as amostras com PBS complementado com 5 mM MgCl2 (PBS* posteriormente). Lave três vezes com uma incubação de 10 minutos para cada lavagem.
- Membranas plasmáticas permeabilize com 1% Triton X-100 em PBS* (PBS*T depois disso). Lave duas vezes com uma incubação de 5 minutos para cada lavagem.
- Lave extensivamente a amostra com PBS*. Realize cinco alterações e incubar por 5 minutos em cada alteração.
- Sacie os grupos de aldeído sem resíduos com 40 mM de glycina no PBS*, duas vezes por 10 minutos cada.
- Bloqueie as amostras em 1% de BSA em PBS* por 30 minutos.
2. Reação de cliques
NOTA: Este procedimento é modificado a partir de um protocolo19 publicado anteriormente.
- Imediatamente antes do uso, prepare a mistura de reação de clique para detecção de EdU: em um tubo de microcentrifutura, misturar 430 μL de 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL de 100 mM CuSO4, 1,2 μL de biotin-azide (10 mM em DMSO) e 50 μL de 0,5 M ascor acidbic. Para o controle de qualidade da rotulagem replicativa e procedimento de clique ao nível de microscopia fluorescente, o biotin-azide pode ser substituído por AlexaFluor 488-azide.
NOTA: A ordem de adição de componentes na reação acima é importante. - Realize a reação em uma câmara úmida para minimizar as mudanças de evaporação e concentração no coquetel de reação. Prepare a câmara úmida colocando uma folha molhada de papel filtro na parte inferior da placa de Petri e cobrindo-a com um filme de parafina. Coloque as tampas na superfície do filme com as células voltadas para cima e a camada 50-100 μL do coquetel de reação no deslizamento de cobertura. A reação leva 30 minutos à temperatura ambiente.
- Pare a reação lavando a amostra em 0,1% Triton X-100 em PBS* (PBS*T), cinco vezes por 5 min cada.
- Bloqueie em 1% de BSA em PBS*T por 30 min a temperatura ambiente.
- Prepare a solução streptavidin-Nanogold com PBS*T contendo 1% de BSA. Incubar a amostra com streptavidina, conjugada com partículas nanogold de 1,4 nm (Nanoprobes) em 1% BSA + PBS*T durante a noite a +4 °C na câmara úmida recém-preparada.
- Pare a reação e lave a amostra em PBS*T, cinco vezes por 10 min cada.
- Estabilize o complexo de biotina streptavidin por pós-fixação em 1% de glutaraldeído em PBS* por 30 min.
- Remova o glutaraldeído por lavagem intensa com água deionizada e lave a amostra em PBS*, cinco vezes por 20 min cada.
- Sacie grupos de aldeído gratuitos com 1 mg/mL nabh4 em água, duas vezes por 10 min cada. Durante a incubação, são formadas bolhas de H2 que podem levantar as tampas. Empurre-os cuidadosamente para baixo com a pinça.
- Lave com água deionizada cinco vezes por 5 min cada.
NOTA: Para o controle de qualidade na etapa de rotulagem, é aconselhável realizar rotulagem de controle com streptavidina fluorescentemente rotulado (Figura 2). Isso forneceria uma estimativa de intensidade de rotulagem e nível de fundo antes de mudar para passos subsequentes tediosos e propensos a artefatos.
3. Amplificação ag
NOTA: Este procedimento é modificado a partir de Gilerovitch et al., 1995 (ver 20,21).
- Resuspend 50 g de pó de acácia em 100 mL de água desionizada. Dissolva por 3 dias, degas e filtre através de quatro camadas de pano de queijo. Armazene as alíquotas congeladas em 5 mL em tubos de 50 mL. Descongele imediatamente antes do uso.
- Adicione 2 mL de 1 M MES (pH = 6,1) a 5 mL de alíquota descongelada de solução em pó de acácia para fazer 7 mL de 0,28 M MES (pH = 6,1) em solução em pó de acácia. Misture balançando lentamente o tubo por 30 minutos. Enrole o tubo com papel alumínio para proteger da luz.
- Simultaneamente com a etapa 3.2., lave as tampas com tampão de lavagem (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM de sacarose), três vezes por 10 min cada.
- Prepare a nova solução de N-propyl gallate (NPG). Em um tubo de 15 mL, dissolva 10 mg de NPG em 250 μL de 96% de etanol, e ajuste para 5 mL com água deionizada.
- Coloque 36 mg de lactato prateado em um tubo de 15 mL embrulhado em folha.
- Depois do passo 3.2. é concluído, adicione 1,5 mL de solução NPG à mistura de pó de acácia e rocha por mais 3 minutos.
NOTA: Todas as etapas subsequentes são realizadas em uma sala escura. Use luz segura não actínica (amarela ou vermelha). - Equilibre a amostra com tampão de lavagem e vá para a sala escura. Simultaneamente, adicione 5 mL de água deionizada ao lactato prateado e dissolva-se por um tremor vigoroso por 1-2 min.
- Adicione 1,5 mL de solução de lactato prateado à mistura de pó de acácia, a rocha lentamente por 1 min. Evite a formação de bolhas, pois o oxigênio na mistura diminuirá a reação.
- Escorra a solução do prato com tampas e despeje 3 mL de mistura de lactato-acácia de prata nas células. Balance o prato várias vezes e incubar por 2-5 min. O tempo de incubação depende do lote de pó de acácia e da temperatura. Isso deve ser definido experimentalmente.
NOTA: Um tempo de incubação mais longo pode resultar em encadernação de prata inespecífica. - Para parar a reação, escorra a mistura de reação e lave o prato extensivamente com três a cinco mudanças de água desionizada, seguido por mais três mudanças por 5 minutos cada.
- Verifique a mancha sob o microscópio de campo brilhante. Uma boa coloração deve ser clara para marrom escuro com um fundo amarelado muito fraco.
NOTA: Se a coloração não estiver se desenvolvendo, é possível repetir imediatamente com a mistura já feita (a mistura está ativa por cerca de 15 minutos se mantida no escuro). No entanto, a coloração neste caso pode se desenvolver muito rápido.
4. Tonificação de ouro
NOTA: Para proteger as nanopartículas de prata da dissolução pela oxidação de OsO4 nos procedimentos subsequentes, é utilizada uma impregnação com ouro nesta etapa (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Enxágüe tampas com água desionizada.
- A fim de proteger as nanopartículas de prata da dissolução pela oxidação de OsO4 , incubar as amostras em ácido tetracloroaurico de 0,05% por 2 min no escuro.
- Lave bem com água deionizada por 10 minutos.
NOTA: Nesta fase, o contraste adicional é adicionado ao DNA contendo material. A cor da amostra deve mudar de marrom para preto.
5. ChromEM
NOTA: Este protocolo foi modificado a partir de Ou et al., 201716.
- Incubar as tampas e saturar as amostras em 10 μM DRAQ5 em PBS por 10 min no escuro.
- Prepare 0,2% de solução de tetrahidrocloide diaminobenzidina (DAB) em 50 mM Tris ou PBS:
dissolver o DAB em 90% do volume final mexendo vigorosamente no escuro, depois ajuste o pH para 7,0-7,4 com NaOH. Ajuste o volume para 100% e filtre através de um filtro de 0,22 μM, armazene embrulhado em papel alumínio. - Adicione a solução DAB às células (2 mL por placa de Petri de 3 cm) e incubar por 1 min.
- Mova a tampa para o fundo de vidro da placa de Petri e coloque-a no estágio de um microscópio invertido. Irradie a amostra (vários campos de visão) em um microscópio invertido com fonte de luz metal-halide e conjunto de filtro Cy5 (640 nm, 1 W/cm2 no plano focal) através do Plano Apo λ 40ц (NA = 0,95) lente por 10 minutos.
NOTA: Uma indicação de fotoconversão da DAB bem sucedida é a formação completa de fotobleaching DRAQ5 e dab escuro em núcleos irradiados. No entanto, este último nem sempre é aparente sobre o intenso sinal EdU-prata-ouro (especialmente quando pulsos EdU estendidos são utilizados). - Lave com água deionizada três vezes por 5 min cada.
6. Desidratação e resina epóxi incorporando
- Em um tubo de microcentrifuge, prepare a solução de tetraóxido de ódio parcialmente reduzida misturando 2% de solução aquosa de K4Fe(CN)6 com uma quantidade igual de 2% de solução aquosa de OsO4, para obter 1% de concentração final de ambos os componentes. Incubar tampas em OsO4 reduzidos por 1h e lavar em água deionizada três vezes por 5 min cada.
NOTA: Nesta fase, o composto de ósmio reduzido reage com deposições DAB e aumenta o contraste do DNA.
ATENÇÃO: O ósmio é tóxico, trabalha sob um capô de fumaça e lida com resíduos de acordo com as normas locais de segurança. - Desidratar as amostras em uma série de soluções de etanol classificados em percentuais crescentes: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
- Para infiltração e incorporação use a fórmula de resina com a razão volumosa do componente da seguinte forma: monômero de resina epóxi:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). Esta fórmula é miscible com etanol.
- Incubar o deslizamento de cobertura no mix etanol-resina (3 partes 100% EtOH:1 parte resina epóxi) por 30 min.
- Incubar a tampa no mix etanol-resina (1 parte 100% EtOH:1 parte resina epóxi) por 2 h.
- Incubar o deslizamento de cobertura no mix etanol-resina (1 parte 100% EtOH:3 partes epóxi resina) durante a noite.
- Substitua a mistura etanol-resina por resina pura recém-preparada. Incubar em mistura de resina pura por 8 h. Abra o prato para deixar os restos de etanol evaporarem.
- Transfira as tampas em um novo prato com resina pura e incubar por 2h a 37-42 °C.
- Encha um molde de silicone com resina recém preparada. Coloque as tampas com as células voltadas para baixo no molde de silício apropriado preenchido com resina epóxi. Cure a resina por 24h a 37 °C, depois a 60 °C por pelo menos 2 dias.
ATENÇÃO: Os componentes da mistura de resina epóxi são potenciais cancerígenos. Use luvas e trabalhe sob o capô da fumaça.
- Remova a laje de resina do molde, limpe a superfície da mancha com o bisturi ou lâmina de barbear. Para remover a mancha de cobertura, solte a mancha de cobertura em nitrogênio líquido e, em seguida, transfira a laje para a água fervente. Repita se necessário.
- Localize a área irradiada sob um estereómico e corte-a da laje com uma serra de corte ou qualquer outro instrumento adequado. Pré-aqueça a laje a 70 °C em uma placa quente, se necessário.
- Fixe o recorte em um suporte de amostra ultramicrotome para aparamento final do bloco. Usando a navalha, prepare a amostra em forma de pirâmide. Monte o suporte com pirâmide no ultramicroome e instale a faca.
- Corte o bloco para que as células irradiadas com etiqueta EdU estejam incluídas. Prepare uma seção semifina (250 nm de espessura) adequada para tomografia eletrônica.
NOTA: A espessura da seção pode ser ajustada para atender aos requisitos experimentais.
- Corte o bloco para que as células irradiadas com etiqueta EdU estejam incluídas. Prepare uma seção semifina (250 nm de espessura) adequada para tomografia eletrônica.
- Desprender a seção da borda da faca e colocá-los nas grades de um único slot. Para a tomografia eletrônica, seções de 250 nm são colhidas em grades de um único slot de 1 mm e após a secagem dessas seções podem ser revestidas de carbono de ambos os lados. Não é necessário contraste adicional.
NOTA: Como as seções já contêm partículas Au-Ag de alto contraste, não há necessidade de adicionar partículas de ouro fiduciário à superfície da seção. - Examine as redes em um microscópio eletrônico de transmissão em baixa ampliação (cerca de 600x) para localizar as células com padrões de replicação apropriados.
NOTA: Este protocolo gera densidade de rotulagem alta o suficiente para fácil detecção de focos de replicação mesmo em baixa ampliação. É aconselhável primeiro criar um mapa da seção para posterior navegação e coleta de projeções angulares para tomografia. Mude para uma ampliação mais alta e pegue imagens de alta resolução.
7. Tomografia eletrônica
- Insira a grade no microscópio eletrônico de transmissão com um suporte de alta inclinação. Carregue a amostra no microscópio eletrônico e localize a região de interesse.
- Alinhe o microscópio no modo EFTEM no modo de iluminação quase paralelo. Sintonize o filtro de energia com 20 eV de seleção de energia colocado no pico de perda zero.
- Pré-irradie a área de aquisição da tomografia a uma taxa de dose de 40 e/Å2/s por pelo menos 1,5-2 min, o que corresponde à dose total de pelo menos 3000 e/Å2.
- Ajuste a altura eucêntrica com a tarefa automática no SerialEM. Verifique a tarefa de foco automático para garantir que ele esteja funcionando corretamente em ângulo de inclinação zero e -0,8 mkm de valor de desfoco de destino.
- Incline o suporte da amostra para -60° com a tarefa Walk-Up.
- Configure a aquisição da tomografia de -60 a +60° com etapa 2.0°. A exposição deve ser definida dependendo do ângulo de inclinação para manter a intensidade média na câmera. Limitar a mudança de imagem no caso de causar uma mudança de energia e, assim, cortar o desalinhamento. Os dados da tomografia devem ser salvos como arquivo .mrc.
- Importe o arquivo .mrc em software IMOD para reconstrução da tomografia. Remova os valores de pixels outlier devido aos raios-X.
- Alinhe a série de inclinação. Realize a correlação cruzada inicial, em seguida, marque manualmente 10-12 partículas de ouro como fiduciais. Rastreie o modelo fiduciário e inspecione se cada fiduciário é rastreado corretamente através da série de inclinação. Crie tomogramas de amostra (fatias) e marque manualmente as bordas finas da seção para evitar a possível inclinação da densidade reconstruída dentro do volume. O erro residual médio para alinhamento de multa foi inferior a 1,2 pix.
- Reconstrua o tomograma com um algoritmo de projeção de costas filtrado e, em seguida, corte a saída para encaixar a região de interesse no volume final.
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Representative Results
Os focos de replicação nos núcleos de células mamíferas apresentam padrões distintos de distribuição dentro do núcleo, dependendo da progressão da fase S. Esses padrões se correlacionam com a atividade transcricional do loci sendo replicado. Uma vez que o método aqui apresentado utiliza um procedimento de fixação bastante forte, é bastante simples o uso de rotulagem de pulso replicativo para detecção específica de cromatina loci em vários estados transcricionais, mesmo em condições que oferecem melhor preservação estrutural da cromatina obtida pela fixação química da temperatura ambiente.
As etapas de controle de qualidade visam garantir a conclusão bem-sucedida dos principais procedimentos deste protocolo. Inicialmente, a rotulagem edu bem sucedida deve ser confirmada pela reação do Click com azida fluorescentemente rotulada, demonstrando padrões típicos de replicação se a população de células heterogêneas for usada (Figura 2). O segundo passo importante é a rotulagem de streptavidin, que pode ser fortemente influenciada pela fixação do glutaraldeído. Para avaliação da eficiência de ligação streptavidin, use o streptavidin conjugado AlexaFluor-488 nas mesmas condições que o streptavidin-Nanogold (Figura 3). Neste ponto, alguns antecedentes são esperados principalmente devido à autofluorescência de glutaraldeído, bem como à lavagem incompleta de streptavidin. Se a relação sinal-ruído for inaceitável, tente aumentar o número e a duração das etapas de lavagem na etapa 2.6. Alternativamente, adicione glutaraldeído saciando com NaBH4 (passos 2.9-2.10) após a etapa 1.5.
O procedimento de aprimoramento de prata muitas vezes produz resultados inconsistentes e requer otimização. Primeiro, a velocidade de reação varia drasticamente dependendo do lote de solução de pó de acácia. A viscosidade da solução é inversamente proporcional ao tempo do desenvolvimento da coloração de prata. É uma boa ideia ter várias alíquotas do mesmo lote e testá-las nas amostras de controle para determinar o melhor tempo de reação. Como a temperatura dos reagentes e do ambiente também tem um impacto significativo na velocidade de reação, tente realizar a reação exatamente na mesma temperatura. Se processar mais de três amostras simultaneamente, é conveniente iniciar a reação em intervalos de 30 segundos para ter tempo suficiente para lavar etapas.
Um bom resultado do procedimento de aprimoramento de prata é a coloração marrom escura de alguns (nem todos) núcleos com coloração citoplasmática amarelada muito fraca (Figura 4). Isso significa que o tamanho médio das partículas de prata é de cerca de 20 nm, o que é adequado para fácil detecção de rótulos em uma ampla gama de ampliação de TEM sobre a contra-magem de cromatina. Para experimentos de tomografia, o tamanho das partículas deve ser reduzido para cerca de 10 nm, encurtando o tempo de reação. A cor neste caso deve ser marrom claro ou avermelhada. A cor da coloração prateada deve ser verificada antes da tonalidade dourada.
A fotoconversão e osmificação da DAB é realizada após a tonificação de ouro para proteger as conchas de prata da dissolução. Em caso de impregnação de ouro insuficiente, as nanopartículas de prata ficam erodidas e adquirem forma irregular, mas ainda permanecem visíveis sob tem. A qualidade da fotoconversão DAB é monitorada primeiro pelo branqueamento DRAQ5 (no modo fluorescência), depois em um modo de campo brilhante, quando os núcleos celulares em um campo irradiado tornam-se marrom escuro (Figura 5). A intensidade de coloração da DAB não deve ser muito alta para que a coloração de Ag-Au permaneça bem detectada para permitir a seleção das células com tempo de replicação necessário para secção.
As seções ultrafinas ou semifinas não requerem coloração adicional e podem ser visualizadas diretamente em TEM. A rotulagem apropriada normalmente resulta em clusters bem definidos de nanopartículas Ag demarcando locais de replicação (Figura 6), enquanto a rotulagem de fundo é limitada a algumas nanopartículas por micrômetro quadrado. Seções semifinais estão prontas para a tomografia e não requerem adição de nanopartículas de ouro à superfície da seção, pois as nanopartículas ag presentes em uma seção podem ser usadas como marcas fiduciárias (Figura 7). Nesta figura, o efeito do tempo de rotulagem prolongado é mostrado: focos de replicação individuais se fundem em estruturas semelhantes a fibras, delineando domínios de cromatina de alta ordem.
Figura 1. A visão geral do método. As células cultivadas em deslizamentos são rotuladas com EdU, fixadas com glutaraldeído de 2,5%, permeabilizadas e a reação de clique é realizada com azida biotinína. Alternativamente, azides fluorescentes rotulados são usados em observação microscópica leve. Os locais de incorporação de biotinas são rotulados com Nanogold-streptavidin (ou fluorescentemente rotulado streptavidina como um controle), prata aprimorada, e após tonificação de ouro submetida à fotoconversão e osmificação da DAB mediada pelo DRAQ5. As amostras estão embutidas em resina epóxi, seccionadas, examinadas em TEM e submetidas à tomografia eletrônica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Padrões de replicação em células de mamíferos revelados pela rotulagem edu e click-reaction (verde). A progressão da fase S do início para o final da fase S (da esquerda para a direita) é manifestada por uma mudança ordenada nos padrões de replicação: A,B - fase S inicial, C - fase S média, D,E - fase S tardia. O DNA está manchado com DAPI (vermelho). Barra de escala = 10 hum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Padrões de replicação em células de mamíferos revelados pela rotulagem edu e duas etapas click-biotina e streptavidin-AlexaFluor 488 coloração após fixação de glutaraldeído. A amostra de controle rotulada com streptavidin-AlexaFluor 488 exibe a eficiência de rotulagem ideal e a razão S/N após a fixação do glutaraldeído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Imagem representativa das células após o procedimento de aprimoramento da prata (Passo 3). Vários padrões replicativos (fase S inicial, setas; fase S média, ponta de flecha; setas duplas tardias) são facilmente visíveis em um modo de microscopia de luz brilhante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Um resultado típico da fotoconversão DAB mediada pelo DRAQ5. (A) Coloração DRAQ5 (círculo tracejado indica área irradiada). Note forte branqueamento DRAQ5 dentro do círculo. (B) A mesma área vista no microscópio de luz brightfield. Note precipitação daB mais forte nos núcleos em área irradiada. Inset: setas indicam núcleos de fase S iniciais onde padrões de replicação rotulados com Ag-Au ainda são facilmente detectáveis no fundo da coloração DAB draq5-foto-oxidazed. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Focos de replicação em núcleos de células de mamíferos revelados pela rotulagem da EdU e manchas de clique-biotina e streptavidin-Nanogold de duas etapas após a fixação de glutaraldeído. Finas seções de 90 nm de uma célula de fase S mostrando aglomerados de nanopartículas Ag-Au em focos de replicação (A, círculos vermelhos). O nível de fundo pode ser apreciado em uma célula não-fase S (B). Pontas de flecha indicam fibras de cromatina de várias escalas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Projeção de 0°inclinação de seção de 250 nm. (A) e seção tomográfica virtual. (B) de um núcleo celular rotulado com EdU por 2 h. Veja os focos de replicação individuais fundidos em estruturas semelhantes a fibras (pontas de flecha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método descrito aqui tem várias vantagens em relação aos protocolos publicados anteriormente. Primeiro, o uso de Click-química para rotular DNA replicado elimina a necessidade de pré-requisito de desnaturação de DNA para detecção de BrdU com anticorpos, preservando assim melhor a ultraestrutura de cromatina.
Em segundo lugar, a utilização da biotina como um ligante secundário que é gerado após a fixação do glutaraldeído e a sacieciação adequada de grupos de aldeído desvinculados minimiza a modificação química do alvo, melhorando assim a eficiência da rotulagem, reduzindo o fundo devido à biotina endógena. Biotina-streptavidin também adiciona versatilidade, pois o uso de streptavidin rotulado fluorescente proporciona fácil controle de qualidade no estágio inicial do procedimento. O protocolo pode ser ainda mais simplificado pela introdução de Streptavidin rotulado por FluoroNanogold, no entanto, em nossas mãos esses reagentes deram um fundo um pouco maior em comparação com Nanogold-streptavidin, talvez devido ao tamanho maior das sondas.
Em terceiro lugar, uma combinação de pequenas sondas, streptavidin-Nanogold sendo o maior componente de cerca de 5 nm, fornece uma penetração muito boa em até mesmo células interligadas de glutaraldeído. Isso torna a técnica adequada para a rotulagem pré-incorporação de células preservadas de forma ultraestrutural e facilmente compatível com várias técnicas de microscopia de elétrons 3D, incluindo reconstrução de seção serial, tomografia de matriz, tomografia eletrônica, imagem facial de bloco serial e FIB-SEM.
O aprimoramento da prata é o passo mais crítico, exigindo controle preciso das etapas de difusão e lavagem de reagentes, o que é mais fácil de executar com células aderentes. Por outro lado, uma vez que o forte crosslinking com glutaraldeído também pode afetar o aprimoramento da prata, as condições de fixação devem ser ajustadas para equilibrar a preservação da estrutura de cromatina e a eficiência do aprimoramento da prata. Por essa razão, as técnicas de crio-fixação/crio-substituição, que requerem pós-fixação estendida e mal controlada, embora permitindo uma preservação ainda melhor da estrutura, podem não ser totalmente compatíveis com a estratégia de rotulagemproposta 23. A técnica pode ser melhorada usando amplificação au em vez de aprimoramento de prata24. Esta modificação permite pular a etapa de tonificação de ouro, no entanto, em nossas mãos, dá um fundo consideravelmente maior.
Finalmente, a rotulagem pré-incorporação permite a pré-seleção de células-alvo para ChromEM e seção com base no padrão de replicação detectável sob o campo brilhante ou microscópio fluorescente. Além disso, o método pode ser facilmente estendido ao CLEM, incluindo várias técnicas de super-resolução. Isso abre novos horizontes em estudos de estrutura e dinâmica de ordem superior cromatina em vários estados fisiológicos. A abordagem que descrevemos aqui pode ser usada para estudos de organização de cromatina em locais de replicação, para análise do rearranjo pós-replicativo da cromatina, incluindo imagens de alta resolução de segregação cromátide em interfase, e para rotulagem replicativa de grandes domínios cromossômicos e estudos de compatibilidade de cromatina de alta ordem de frações específicas do genoma (eucromatina ou heterocromatina, rotulada com base no tempo de replicação). Esses tipos de técnicas de imagem também são importantes como ponto de referência para os dados gerados por abordagens alternativas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pela RSF (subvenção nº 17-15-01290) e RFBR (subvenção nº 19-015-00273). Os autores agradecem ao programa de desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou Lomonosov (PNR 5.13) e ao Centro de Excelência Nikon em imagens correlativas do Instituto Belozersky de Biologia Físico-Química pelo acesso à instrumentação por imagem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
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