Summary
Dieses Protokoll stellt eine Technik zur hochauflösenden Kartierung von Replikationsstellen in strukturell konserviertem Chromatin in situ vor, die eine Kombination aus voreingebetteter EdU-Streptatvid-Nanogold-Markierung und ChromEMT verwendet.
Abstract
Die Prinzipien der DNA-Faltung im Zellkern und ihre dynamischen Transformationen, die während der Erfüllung grundlegender genetischer Funktionen (Transkription, Replikation, Segregation usw.) auftreten, sind nach wie vor wenig verstanden, was zum Teil auf das Fehlen experimenteller Ansätze zur hochauflösenden Visualisierung spezifischer Chromatinorte in strukturell konservierten Kernen zurückzuführen ist. Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung replitiver Domänen in Monolayer-Zellkultur in situ vor, indem wir die EdU-Markierung neu synthetisierter DNA mit anschließender Markierungsdetektion mit Ag-Amplifikation von Nanogoldpartikeln und ChromEM-Färbung von Chromatin kombinieren. Dieses Protokoll ermöglicht die kontrastreiche, hocheffiziente Voreinbettungsmarkierung, die mit der traditionellen Glutaraldehydfixierung kompatibel ist und die beste strukturelle Konservierung von Chromatin für die Probenverarbeitung bei Raumtemperatur bietet. Ein weiterer Vorteil der Prä-Embedding-Kennzeichnung ist die Möglichkeit, Zellen von Interesse für die Schnittaufnahme vorzuselektieren. Dies ist besonders wichtig für die Analyse heterogener Zellpopulationen sowie für die Kompatibilität mit elektronentomographischen Ansätzen zur hochauflösenden 3D-Analyse der Chromatinorganisation an Replikationsstellen und zur Analyse der postreplizierenden Chromatin-Neuanordnung und Schwesterchromatid-Segregation in der Interphase.
Introduction
Die DNA-Replikation ist ein grundlegender biologischer Prozess, der für das originalgetreue Kopieren und Übertragen der genetischen Information während der Zellteilung erforderlich ist. Bei höheren Eukaryoten unterliegt die DNA-Replikation einer engen räumlich-zeitlichen Regulation, die sich in einer sequentiellen Aktivierung der Replikationsursprüngemanifestiert 1. Benachbarte Replikationsursprünge, die synchron ausgelöst werden, bilden Cluster von replicons2. Auf der Ebene der optischen Mikroskopie werden Stellen der laufenden DNA-Replikation als Replikationsherde unterschiedlicher Anzahl und Größe nachgewiesen. Replikationsherde zeigen spezifische Muster der räumlichen Verteilung innerhalb des Zellkerns, abhängig vom Replikationszeitpunkt der markierten DNA3,4, die wiederum eng mit ihrer Genaktivität korreliert ist. Dank der klar definierten Sequenz der DNA-Replikation, die streng in Raum und Zeit geordnet ist, ist die replizierende Markierung eine leistungsstarke Methode der präzisen DNA-Markierung nicht nur für die Untersuchung des Replikationsprozesses an sich, sondern auch zur Unterscheidung einer spezifischen DNA-Unterfraktion mit definierter Transkriptionsaktivität und Verdichtungsebene. Die Visualisierung von replizierendem Chromatin erfolgt in der Regel durch den Nachweis von Hauptproteinkomponenten der DNA-Replikationsmaschinerie (entweder durch Immunfärbung oder durch Expression fluoreszierender Protein-Tags5,6) oder durch die Einbeziehung modifizierter DNA-Synthesevorläufer 7,8,9,10 . Von diesen ermöglichen nur Methoden, die auf der Einarbeitung modifizierter Nukleotide in neu replizierte DNA basieren, die Erfassung von Konformationsänderungen im Chromatin während der Replikation und verfolgen das Verhalten replizierender Domänen nach Abschluss ihrer Replikation.
In höheren Eukaryoten fügt die DNA-Verpackung in Chromatin der Regulation grundlegender genetischer Funktionen (Transkription, Replikation, Reparation usw.) eine weitere Ebene der Komplexität hinzu. Die Chromatinfaltung beeinflusst die Zugänglichkeit der DNA zu regulatorischen Transfaktoren und DNA-Konformationsänderungen (Doppelhelix-Abwicklung), die für die Template-Synthese erforderlich sind. Daher ist es allgemein anerkannt, dass DNA-abhängige synthetische Prozesse im Zellkern einen strukturellen Übergang von Chromatin von seinem kondensierten, repressiven Zustand zu einer zugänglicheren, offenen Konformation erfordern. Zytologisch sind diese beiden Chromatinzustände als Heterochromatin und Euchromatin definiert. Es gibt jedoch immer noch keinen Konsens über die Art und Weise der DNA-Faltung im Zellkern. Die Hypothesen reichen von einem "Polymerschmelze" -Modell11, bei dem sich die nukleosomale Faser wie ein zufälliges Polymer verhält, bei dem die Packungsdichte durch Phasentrennungsmechanismen gesteuert wird, bis hin zu hierarchischen Faltungsmodellen, die die sequentielle Bildung von chromatinfaserähnlichen Strukturen mit zunehmender Dicke postulieren12,13. Hierarchische Faltungsmodelle haben kürzlich Unterstützung durch molekulare Ansätze erhalten, die auf der Analyse von In-situ-DNA-DNA-Kontakten (Chromosomenkonformationsabscheidung, 3C) basieren und die Existenz der Hierarchie der strukturellen Chromatindomänendemonstrieren 14. Es ist wichtig zu beachten, dass Replikationseinheiten sehr gut mit diesen Chromatindomänen korrelieren15. Die Hauptkritik an diesen Modellen basiert auf der potenziellen künstlichen Chromatinaggregation, die durch Probenvorbereitungsverfahren wie die Permeabilisierung von Zellmembranen und die Entfernung von Nicht-Chromatin-Komponenten verursacht wird, um den Chromatinkontrast für ultrastrukturelle Studien zu verbessern und gleichzeitig die Chromatin-Zugänglichkeit für verschiedene Sonden (z. B. Antikörper) zu verbessern. Jüngste technische Fortschritte bei der selektiven DNA-Färbung für die Elektronenmikroskopie durch DNA-bindende fluorophorvermittelte Photooxidation von Diaminobenzidin (ChromEMT6) haben die Beseitigung dieses Hindernisses ermöglicht. Die gleichen Überlegungen gelten jedoch für die elektronenmikroskopische Visualisierung der sich replizierenden DNA17,18. Hier beschreiben wir eine Technik, die die gleichzeitige hochauflösende ultrastrukturelle Kartierung von neu synthetisierter DNA und Gesamtchromatin in intakten aldehydvernetzten Zellen ermöglicht. Die Technik kombiniert den Nachweis von EdU-markierter DNA durch Click-Chemie mit biotinylierten Sonden und Streptavidin-Nanogold und ChromEMT.
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Protocol
Das Protokoll ist für adhärente Zellen optimiert und wurde an HeLa-, HT1080- und CHO-Zelllinien getestet.
1. Zellmarkierung und -fixierung
- Plattenzellen auf säuregereinigten Deckgläsern in einer 3 cm Petrischale. Züchten Sie die Zellen in den Medien, die für die verwendete Zelllinie empfohlen werden, zu 70% Konfluenz.
- Fügen Sie EdU (5-Ethynyl-2'-desoxyuridin) aus 10 mM Stamm bis 10 μM Endkonzentration hinzu und legen Sie die Zellen für 10 min oder länger in den Inkubator (abhängig vom Experimentziel). Für kürzere Hülsenfrüchte (bis zu 2 min) bereiten Sie eine Petrischale mit vorgewärmten frischen Nährmedien vor, die mit 10 μM EdU ergänzt werden, und übertragen Sie Deckgläser darin, anstatt den Zellen direkt EdU hinzuzufügen.
HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. - Fixieren Sie die markierten Zellen mit 2,5% Glutaraldehyd, frisch hergestellt, indem Sie 25% des Vorrats in 100 mM Cacodylatpuffer verdünnen, für 1 h.
HINWEIS: Die nachfolgenden EdU-Erkennungsschritte reagieren empfindlich auf das Fixierungstiming. Längere Fixationszeiten können sich negativ auf die EdU-Kennzeichnung auswirken und zu einem geringeren Signal-Rausch-Verhältnis führen. - Entfernen Sie Glutaraldehyd, indem Sie die Proben mit PBS waschen, ergänzt mit 5 mMMgCl 2 (PBS* danach). Dreimal waschen mit einer 10-minütigen Inkubation für jede Wäsche.
- Permeabilisieren Sie Plasmamembranen mit 1% Triton X-100 in PBS* (danach PBS*T). Waschen Sie zweimal mit einer 5-minütigen Inkubation für jede Wäsche.
- Waschen Sie die Probe ausgiebig mit PBS*. Führen Sie fünf Änderungen durch und inkubieren Sie bei jeder Änderung 5 Minuten lang.
- Löschen Sie die restfreien Aldehydgruppen mit 20 mM Glycin in PBS*, zweimal für jeweils 10 min.
- Blockieren Sie die Proben in 1% BSA in PBS* für 30 min.
2. Klick-Reaktion
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde gegenüber einem zuvor veröffentlichten Protokoll19 geändert.
- Bereiten Sie unmittelbar vor der Anwendung eine Click-Reaktionsmischung für den EdU-Nachweis vor: Mischen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen 430 μL 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL 100 mM CuSO 4, 1,2 μLBiotin-Azid (10 mM in DMSO) und 50 μL 0,5 M Ascorbinsäure. Zur Qualitätskontrolle der replizierenden Markierung und des Click-Verfahrens auf der Ebene der Fluoreszenzmikroskopie kann Biotin-Azid durch AlexaFluor 488-Azid ersetzt werden.
HINWEIS: Die Reihenfolge der Addition von Komponenten in der obigen Reaktion ist wichtig. - Führen Sie eine Klickreaktion in einer feuchten Kammer durch, um die Verdunstung und Konzentrationsverschiebungen im Reaktionscocktail zu minimieren. Bereiten Sie die feuchte Kammer vor, indem Sie ein nasses Blatt Filterpapier auf den Boden der Petrischale legen und mit einer Paraffinfolie bedecken. Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen nach oben auf die Oberfläche der Folie und schichten Sie 50-100 μL des Reaktionscocktails auf das Deckglas. Die Reaktion dauert bei Raumtemperatur 30 Minuten.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Probe in 0,1% Triton X-100 in PBS* (PBS*T) fünfmal für jeweils 5 Minuten waschen.
- Blockieren Sie 1% BSA in PBS * T für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie Streptavidin-Nanogold-Lösung mit PBS*T vor, das 1% BSA enthält. Inkubieren Sie die Probe mit Streptavidin, konjugiert mit 1,4 nm Nanogoldpartikeln (Nanosonden) in 1% BSA + PBS*T über Nacht bei +4 °C in der neu vorbereiteten Feuchtkammer.
- Stoppen Sie die Reaktion und waschen Sie die Probe in PBS * T, fünfmal für jeweils 10 Minuten.
- Stabilisieren Sie den Biotin-Streptavidin-Komplex durch Nachfixierung in 1% Glutaraldehyd in PBS* für 30 min.
- Entfernen Sie Glutaraldehyd durch intensives Waschen mit entionisiertem Wasser und waschen Sie die Probe in PBS *, fünfmal für jeweils 20 Minuten.
- Quenchfreie Aldehydgruppen mit frisch zubereiteten 1 mg/ml NaBH4 in Wasser, zweimal für jeweils 10 min. Während der Inkubation bilden sich Blasen von H2, die die Deckgläser anheben können. Drücken Sie sie vorsichtig mit der Pinzette nach unten.
- Mit entionisiertem Wasser fünfmal für jeweils 5 min waschen.
HINWEIS: Für die Qualitätskontrolle im Etikettierschritt ist es ratsam, eine Kontrollmarkierung mit fluoreszierend markiertem Streptavidin durchzuführen (Abbildung 2). Dies würde eine Schätzung der Beschriftungsintensität und des Hintergrundniveaus liefern, bevor zu mühsamen und artefaktanfälligen nachfolgenden Schritten übergegangen wird.
3. Ag-Verstärkung
ANMERKUNG: Dieses Verfahren wurde von Gilerovitch et al., 1995 geändert (siehe 20,21).
- Resuspendiert 50 g Akazienpulver in 100 ml entionisiertem Wasser. 3 Tage auflösen, entgasen und durch vier Schichten Käsetuch filtrieren. Gefroren in 5 ml-Aliquots in 50-ml-Röhrchen lagern. Unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
- 2 ml 1 M MES (pH = 6,1) zu 5 ml aufgetautem Aliquot Akazienpulverlösung hinzufügen, um 7 ml 0,28 M MES (pH = 6,1) in Akazienpulverlösung herzustellen. Mischen Sie, indem Sie die Tube 30 Minuten lang langsam schaukeln. Wickeln Sie das Rohr mit Folie um, um es vor Licht zu schützen.
- Gleichzeitig mit Schritt 3.2. Waschen Sie Deckgläser mit Waschpuffer (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM Saccharose), dreimal für jeweils 10 min.
- Bereiten Sie die frische Lösung von N-Propylgallat (NPG) vor. In einer 15-ml-Tube 10 mg NPG in 250 μL 96% Ethanol auflösen und mit deionisiertem Wasser auf 5 ml einstellen.
- Geben Sie 36 mg Silberlactat in ein mit Folie umwickeltes 15-ml-Röhrchen.
- Nach Schritt 3.2. ist abgeschlossen, fügen Sie 1,5 ml NPG-Lösung zu Akazienpulvermischung hinzu und rocken Sie für weitere 3 min.
HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte werden in einer Dunkelkammer durchgeführt. Verwenden Sie nicht-aktinisches Safelight (gelb oder rot). - Quilibrieren Sie die Probe mit dem Waschpuffer und begeben Sie sich in den dunklen Raum. Gleichzeitig 5 ml entionisiertes Wasser in Silberlactat geben und durch kräftiges Schütteln für 1-2 min auflösen.
- 1,5 ml Silberlactatlösung in die Akazienpulvermischung geben, 1 min langsam eintopfen. Vermeiden Sie Blasenbildung, da Sauerstoff in der Mischung die Reaktion verlangsamt.
- Lassen Sie die Lösung aus der Schale mit Deckgläsern ab und gießen Sie 3 ml Silberlactat-Akazienpulver-Mischung auf die Zellen. Das Gericht mehrmals schaukeln und 2-5 min inkubieren. Die Inkubationszeit hängt von der Akazienpulvercharge und der Temperatur ab. Dies sollte experimentell definiert werden.
HINWEIS: Eine längere Inkubationszeit kann zu einer unspezifischen Silberbindung führen. - Um die Reaktion zu stoppen, lassen Sie die Reaktionsmischung abtropfen und waschen Sie das Gericht ausgiebig mit drei bis fünf Wechseln von deionisiertem Wasser, gefolgt von drei weiteren Änderungen für jeweils 5 Minuten.
- Überprüfen Sie die Färbung unter dem Hellfeldmikroskop. Eine gute Färbung sollte hell- bis dunkelbraun mit einem sehr schwachen gelblichen Hintergrund sein.
HINWEIS: Wenn sich die Färbung nicht entwickelt, ist es möglich, sofort mit der bereits gemachten Mischung zu wiederholen (die Mischung ist für ca. 15 Minuten aktiv, wenn sie im Dunkeln gehalten wird). Allerdings kann sich die Färbung in diesem Fall zu schnell entwickeln.
4. Goldtönung
HINWEIS: Um Silbernanopartikel in den nachfolgenden Verfahren vor der Auflösung durchOsO4-Oxidation zu schützen, wird bei diesem Schritt eine Imprägnierung mit Gold verwendet (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Deckgläser mit entionisiertem Wasser abspülen.
- Um Silbernanopartikel vor der Auflösung durchOsO4-Oxidation zu schützen, inkubieren Sie die Proben in 0,05% Tetrachloraurinsäure für 2 min im Dunkeln.
- 10 min gründlich mit entionisiertem Wasser waschen.
HINWEIS: In diesem Stadium wird dem DNA-haltigen Material zusätzlicher Kontrast hinzugefügt. Die Farbe der Probe sollte sich von braun zu schwarz ändern.
5. ChromEM
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Ou et al., 201716, geändert.
- Inkubieren Sie die Deckgläser und sättigen Sie die Proben in 10 μM DRAQ5 in PBS für 10 min im Dunkeln.
- 0,2%ige Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)-Lösung in 50 mM Tris oder PBS herstellen:
DAB in 90% des Endvolumens durch kräftiges Rühren im Dunkeln auflösen und dann den pH-Wert mit NaOH auf 7,0-7,4 einstellen. Stellen Sie die Lautstärke auf 100% ein und filtern Sie durch einen 0,22 μM-Filter, der in Folie eingewickelt ist. - DAB-Lösung in die Zellen geben (2 ml pro 3 cm Petrischale) und 1 min inkubieren.
- Bewegen Sie das Deckglas in die Petrischale mit Glasboden und stellen Sie es auf die Bühne eines umgekehrten Mikroskops. Bestrahlung der Probe (mehrere Sichtfelder) auf einem inversen Mikroskop mit Metallhalogenid-Lichtquelle und Cy5-Filterset (640 nm, 1 W/cm2 in Brennebene) durch Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) Objektiv für 10 min.
HINWEIS: Ein Hinweis auf eine erfolgreiche DAB-Photokonversion ist die vollständige DRAQ5-Photobleiche und die Bildung dunkler DAB-Niederschläge in bestrahlten Kernen. Letzteres ist jedoch nicht immer über ein intensives EdU-Silber-Gold-Signal ersichtlich (insbesondere wenn ausgedehnte EdU-Impulse verwendet werden). - Mit entionisiertem Wasser dreimal für jeweils 5 min waschen.
6. Dehydratisierung und Einbettung von Epoxidharzen
- Stellen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen eine teilweise reduzierte Osmiumtetraoxidlösung her, indem Sie 2% wässrige Lösung von K4Fe (CN) 6 mit einer gleichen Menge von 2% wässriger Lösung von OsO4 mischen, um eine Endkonzentration von 1% beider Komponenten zu erhalten. Bezüge in reduziertem OsO 4 für 1 h inkubieren und in entionisiertem Wasser dreimal für jeweils 5 min waschen.
HINWEIS: In diesem Stadium reagiert die reduzierte Osmiumverbindung mit DAB-Ablagerungen und erhöht den Kontrast der DNA.
ACHTUNG: Osmium ist giftig, arbeitet unter einem Abzug und behandelt Abfälle gemäß den örtlichen Sicherheitsvorschriften. - Dehydrieren Sie die Proben in einer Reihe von abgestuften Ethanollösungen in steigenden Prozentsätzen: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
- Für die Infiltration und Einbettung verwenden Sie die Harzformel mit dem Komponentenvolumenverhältnis wie folgt: Epoxidharzmonomer:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). Diese Formel ist mit Ethanol mischbar.
- Inkubieren Sie das Deckglas in der Ethanol-Harz-Mischung (3 Teile 100% EtOH: 1 Teil Epoxidharz) für 30 min.
- Inkubieren Sie das Deckglas in der Ethanol-Harz-Mischung (1 Teil 100% EtOH: 1 Teil Epoxidharz) für 2 h.
- Inkubieren Sie das Deckglas in der Ethanol-Harz-Mischung (1 Teil 100% EtOH: 3 Teile Epoxidharz) über Nacht.
- Ersetzen Sie die Ethanol-Harz-Mischung durch frisch zubereitetes reines Harz. 8 h in reiner Harzmischung inkubieren. Öffnen Sie die Schale, um Ethanolreste verdampfen zu lassen.
- Deckgläser mit reinem Harz in eine neue Schale geben und 2 h bei 37-42 °C inkubieren.
- Füllen Sie eine Silikonform mit frisch zubereitetem Harz. Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen nach unten auf eine geeignete Silikonform, die mit Epoxidharz gefüllt ist. Aushärten Sie das Harz für 24 h bei 37 °C, dann bei 60 °C für mindestens 2 Tage.
ACHTUNG: Bestandteile der Epoxidharzmischung sind potenzielle Karzinogene. Tragen Sie Handschuhe und arbeiten Sie unter dem Abzug.
- Entfernen Sie die Harzplatte aus der Form, reinigen Sie die Oberfläche des Deckglases mit dem Skalpell oder der Rasierklinge. Um den Deckglas zu entfernen, lassen Sie den Deckglas in flüssigen Stickstoff fallen und geben Sie die Platte dann in das kochende Wasser. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.
- Suchen Sie den bestrahlten Bereich unter einem Stereomikroskop und schneiden Sie ihn mit einer Bügelsäge oder einem anderen geeigneten Instrument von der Platte aus. Wärmen Sie die Platte bei Bedarf bei 70 °C auf einer Kochplatte vor.
- Befestigen Sie den Ausschnitt in einem Ultramikrotom-Probenhalter für den endgültigen Blockbeschnitt. Bereiten Sie mit dem Rasiermesser die pyramidenförmige Probe vor. Montieren Sie den Halter mit Pyramide auf das Ultramikrotom und installieren Sie das Messer.
- Schneiden Sie den Block so zu, dass die bestrahlten Zellen mit EdU-Label enthalten sind. Bereiten Sie einen halbdünnen Schnitt (250 nm Dicke) vor, der für die Elektronentomographie geeignet ist.
HINWEIS: Die Profildicke kann an die experimentellen Anforderungen angepasst werden.
- Schneiden Sie den Block so zu, dass die bestrahlten Zellen mit EdU-Label enthalten sind. Bereiten Sie einen halbdünnen Schnitt (250 nm Dicke) vor, der für die Elektronentomographie geeignet ist.
- Lösen Sie den Abschnitt von der Messerkante und legen Sie ihn auf die Einzelschlitzgitter. Für die Elektronentomographie werden 250-nm-Abschnitte auf 1-mm-Single-Slot-Gitter gepflückt und nach dem Trocknen können diese Abschnitte von beiden Seiten mit Kohlenstoff beschichtet werden. Es ist keine zusätzliche Kontrastierung notwendig.
HINWEIS: Da die Abschnitte bereits kontrastreiche Au-Ag-Partikel enthalten, ist es nicht erforderlich, der Oberfläche des Abschnitts treuhänderische Goldpartikel hinzuzufügen. - Untersuchen Sie die Gitter in einem Transmissionselektronenmikroskop bei geringer Vergrößerung (ca. 600x), um die Zellen mit geeigneten Replikationsmustern zu lokalisieren.
HINWEIS: Dieses Protokoll erzeugt eine Beschriftungsdichte, die hoch genug ist, um Replikationsherde auch bei geringer Vergrößerung leicht zu erkennen. Es ist ratsam, zunächst eine Karte des Abschnitts für die anschließende Navigation und Winkelprojektionssammlung für die Tomographie zu erstellen. Wechseln Sie zu höherer Vergrößerung und nehmen Sie hochauflösende Bilder auf.
7. Elektronentomographie
- Setzen Sie das Gitter mit einem hochgeneigten Halter in das Transmissionselektronenmikroskop ein. Laden Sie die Probe in das Elektronenmikroskop und lokalisieren Sie den interessierenden Bereich.
- Richten Sie das Mikroskop im EFTEM-Modus im nahezu parallelen Beleuchtungsmodus aus. Stimmen Sie den Energiefilter mit einem 20-eV-Energieauswahlspalt ab, der auf Null-Verlust-Spitze platziert ist.
- Die Tomographie-Aufnahmefläche wird mit einer Dosisleistung von 40 e/Å 2/s für mindestens 1,5-2 min vorbestrahlt, was der Gesamtdosis von mindestens 3000 e/Å2 entspricht.
- Passen Sie die euzentrische Höhe mit automatischer Aufgabe in SerialEM an. Überprüfen Sie die Autofokus-Aufgabe, um sicherzustellen, dass sie bei Null-Neigungswinkel und -0,8 mkm Ziel-Defokus-Wert korrekt funktioniert.
- Kippen Sie den Probenhalter mit der Walk-Up-Aufgabe auf -60°.
- Richten Sie die Tomographieerfassung von -60 bis +60° mit Schritt 2.0° ein. Die Belichtung sollte abhängig vom Neigungswinkel eingestellt werden, um die durchschnittliche Intensität der Kamera beizubehalten. Begrenzen Sie die Bildverschiebung für den Fall, dass sie eine Energieverschiebung und damit eine Spaltfehlausrichtung verursacht. Die Tomographiedaten sollten als .mrc-Datei gespeichert werden.
- Importieren Sie die .mrc-Datei in die IMOD-Software für die Tomographie-Rekonstruktion. Entfernen Sie die Ausreißer-Pixelwerte aufgrund von Röntgenstrahlen.
- Richten Sie die Neigungsreihe aus. Führen Sie eine anfängliche Kreuzkorrelation durch und markieren Sie dann manuell 10-12 Goldpartikel als Fiducials. Verfolgen Sie das Fiducial-Modell und überprüfen Sie, ob jedes Fiducial durch die Tilt-Serie korrekt verfolgt wird. Erstellen Sie Probentomogramme (Scheiben) und markieren Sie manuell die dünnen Schnittränder, um eine mögliche Neigung der rekonstruierten Dichte innerhalb des Volumens zu verhindern. Der mittlere Restfehler bei der Feinausrichtung betrug weniger als 1,2 pix.
- Rekonstruieren Sie das Tomogramm mit einem gefilterten Rückprojektionsalgorithmus und schneiden Sie dann die Ausgabe zu, um den interessierenden Bereich in das endgültige Volume einzufügen.
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Representative Results
Replikationsherde in Säugetierzellkernen zeigen je nach S-Phasen-Progression unterschiedliche Verteilungsmuster innerhalb des Kerns. Diese Muster korrelieren mit der transkriptionellen Aktivität der replizierten Loci. Da die hier vorgestellte Methode ein ziemlich starkes Fixationsverfahren verwendet, ist es ziemlich einfach, die repliktive Pulsmarkierung für den spezifischen Nachweis von Chromatin-Loci in verschiedenen Transkriptionszuständen zu verwenden, selbst unter Bedingungen, die eine beste strukturelle Konservierung von Chromatin bieten, die durch chemische Fixierung bei Raumtemperatur erhalten wird.
Qualitätskontrollschritte sollen den erfolgreichen Abschluss der Schlüsselverfahren in diesem Protokoll sicherstellen. Zunächst sollte eine erfolgreiche EdU-Markierung durch Click-Reaktion mit fluoreszierend markiertem Azid bestätigt werden, was typische Replikationsmuster zeigt, wenn heterogene Zellpopulationen verwendet werden (Abbildung 2). Der zweite wichtige Schritt ist die Streptavidin-Markierung, die durch die Glutaraldehydfixierung stark beeinflusst werden kann. Zur Bewertung der Streptavidin-Bindungseffizienz verwenden Sie AlexaFluor-488-konjugiertes Streptavidin unter den gleichen Bedingungen wie Streptavidin-Nanogold (Abbildung 3). Zu diesem Zeitpunkt wird ein gewisser Hintergrund erwartet, hauptsächlich aufgrund der Autofluoreszenz von Glutaraldehyd sowie der unvollständigen Streptavidin-Auswaschung. Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis inakzeptabel ist, versuchen Sie, die Anzahl und Dauer der Waschschritte in Schritt 2.6 zu erhöhen. Alternativ können Sie nach Schritt 1.5 eine Glutaraldehyd-Abschreckung mit NaBH 4 (Schritte 2.9-2.10) hinzufügen.
Das Silberverbesserungsverfahren führt oft zu inkonsistenten Ergebnissen und erfordert eine Optimierung. Erstens variiert die Reaktionsgeschwindigkeit dramatisch in Abhängigkeit von der Akazienpulverlösungscharge. Die Viskosität der Lösung ist umgekehrt proportional zum Zeitpunkt der Silberfärbungsentwicklung. Es ist eine gute Idee, mehrere Aliquots derselben Charge zu haben und sie an den Kontrollproben zu testen, um den optimalen Reaktionszeitpunkt zu bestimmen. Da die Temperatur der Reagenzien und der Umgebung auch einen erheblichen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit hat, versuchen Sie, die Reaktion bei genau der gleichen Temperatur durchzuführen. Wenn mehr als drei Proben gleichzeitig verarbeitet werden, ist es zweckmäßig, die Reaktion in Intervallen von 30 Sekunden zu starten, um genügend Zeit für Waschschritte zu haben.
Ein gutes Ergebnis des Silberverstärkungsverfahrens ist die dunkelbraune Färbung einiger (nicht aller) Kerne mit sehr schwacher gelblicher zytoplasmatischer Färbung (Abbildung 4). Dies bedeutet, dass die mittlere Größe von Silberpartikeln etwa 20 nm beträgt, was für eine einfache Markierungserkennung in einem breiten Vergrößerungsbereich von TEM über die Chromatin-Gegenfärbung geeignet ist. Für Tomographie-Experimente sollte die Größe der Partikel durch Verkürzung der Reaktionszeit auf etwa 10 nm reduziert werden. Die Farbe sollte in diesem Fall hellbraun oder rötlich sein. Die Farbe der Silberfärbung sollte vor der Goldtönung überprüft werden.
Die DAB-Photokonversion und -Osmifikation wird nach der Goldtönung durchgeführt, um Silberschalen vor Auflösung zu schützen. Bei unzureichender Goldimprägnierung werden Silber-Nanopartikel erodiert und nehmen eine unregelmäßige Form an, bleiben aber unter TEM noch sichtbar. Die Qualität der DAB-Photokonversion wird zuerst durch DRAQ5-Bleichen (im Fluoreszenzmodus) überwacht, dann im Hellfeldmodus, wenn die Zellkerne in einem bestrahlten Feld dunkelbraun werden (Abbildung 5). Die DAB-Färbeintensität sollte nicht sehr hoch sein, damit die Ag-Au-Färbung gut erkannt bleibt, um die Auswahl der Zellen mit dem erforderlichen Replikationszeitpunkt für die Schnittaufnahme zu ermöglichen.
Ultradünne oder halbdünne Schnitte benötigen keine zusätzliche Färbung und können direkt unter TEM betrachtet werden. Die entsprechende Markierung führt typischerweise zu gut definierten Clustern von Ag-Nanopartikeln, die Replikationsstellen abgrenzen (Abbildung 6), während die Hintergrundmarkierung auf wenige Nanopartikel pro Quadratmikrometer beschränkt ist. Halbdünne Schnitte sind bereit für die Tomographie und erfordern keine Zugabe von Goldnanopartikeln zur Schnittoberfläche, da Ag-Nanopartikel, die in einem Abschnitt vorhanden sind, als treuhänderische Markierungen verwendet werden können (Abbildung 7). In dieser Abbildung wird der Effekt einer längeren Markierungszeit gezeigt: Einzelne Replikationsherde verschmelzen zu faserähnlichen Strukturen und grenzen Chromatindomänen höherer Ordnung ab.
Abbildung 1. Die Methodenübersicht. Zellen, die auf Deckgläsern gezüchtet werden, werden mit EdU markiert, mit 2,5% Glutaraldehyd fixiert, permeabilisiert und die Click-Reaktion wird mit biotinyliertem Azid durchgeführt. Alternativ werden fluoreszierend markierte Azide in der lichtmikroskopischen Beobachtung eingesetzt. Die Orte der Biotineinarbeitung werden mit Nanogold-Streptavidin (oder fluoreszierend markiertem Streptavidin als Kontrolle) markiert, silberverstärkt und nach der Goldtonisierung einer DRAQ5-vermittelten DAB-Photokonversion und -Osmifikation unterzogen. Die Proben werden in Epoxidharz eingebettet, geschnitten, in TEM untersucht und einer Elektronentomographie unterzogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Replikationsmuster in Säugetierzellen durch EdU-Markierung und Click-Reaktion (grün). Die S-Phasen-Progression von der frühen zur späten S-Phase (von links nach rechts) manifestiert sich in einer geordneten Änderung der Replikationsmuster: A,B - frühe S-Phase, C - mittlere S-Phase, D,E - späte S-Phase. Die DNA ist mit DAPI (rot) angefärbt. Maßstabsleiste = 10 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Replikationsmuster in Säugetierzellen, die durch EdU-Markierung und zweistufige Click-Biotin- und Streptavidin-AlexaFluor 488-Färbung nach Glutaraldehydfixierung aufgedeckt wurden. Die mit Streptavidin-AlexaFluor 488 markierte Kontrollprobe zeigt nach der Glutaraldehydfixierung eine optimale Markierungseffizienz und ein optimales S / N-Verhältnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Repräsentatives Bild von Zellen nach Silberverstärkungsverfahren (Schritt 3). Verschiedene replizierende Muster (frühe S-Phase, Pfeile; mittlere S-Phase, Pfeilspitze; späte, doppelte Pfeile) sind in einem Hellfeld-Lichtmikroskopie-Modus gut sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5. Ein typisches Ergebnis der DRAQ5-vermittelten DAB-Fotokonvertierung. (A) DRAQ5-Färbung (gestrichelter Kreis zeigt bestrahlte Fläche an). Beachten Sie das starke DRAQ5-Bleichen innerhalb des Kreises. (B) Derselbe Bereich, der im Hellfeld-Lichtmikroskop zu sehen ist. Beachten Sie stärkere DAB-Niederschläge in den Kernen im bestrahlten Bereich. Einschub: Pfeile zeigen frühe S-Phase-Kerne an, in denen Replikationsmuster, die mit Ag-Au markiert sind, auf dem Hintergrund der DRAQ5-photooxidierten DAB-Färbung noch leicht erkennbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6. Replikationsherde in Säugetierzellkernen, die durch EdU-Markierung und zweistufige Click-Biotin- und Streptavidin-Nanogold-Färbung nach Glutaraldehydfixierung aufgedeckt werden. Dünne 90-nm-Abschnitte einer S-Phase-Zelle, die Cluster von Ag-Au-Nanopartikeln an Replikationsherden (A, rote Kreise) zeigen. Die Hintergrundebene kann in einer Nicht-S-Phasen-Zelle (B) geschätzt werden. Pfeilspitzen zeigen Chromatinfasern unterschiedlichen Maßstabs an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7. 0°-Neigungsprojektion von 250 nm Schnitt. (A) und virtueller tomographischer Teil. (B) eines Zellkerns, der 2 h lang mit EdU markiert war. Sehen Sie, wie einzelne Replikationsherde zu faserähnlichen Strukturen verschmolzen sind (Pfeilspitzen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die hier beschriebene Methode hat mehrere Vorteile gegenüber zuvor veröffentlichten Protokollen. Erstens eliminiert die Verwendung der Click-Chemie zur Markierung replizierter DNA die Notwendigkeit der DNA-Denaturierung, die für den BrdU-Nachweis mit Antikörpern erforderlich ist, wodurch die Chromatin-Ultrastruktur besser erhalten wird.
Zweitens minimiert die Verwendung von Biotin als sekundärer Ligand, der nach der Glutaraldehydfixierung und dem ordnungsgemäßen Abschrecken von ungebundenen Aldehydgruppen erzeugt wird, die chemische Modifikation des Ziels, wodurch die Markierungseffizienz verbessert und gleichzeitig der Hintergrund aufgrund von endogenem Biotin reduziert wird. Biotin-Streptavidin erhöht auch die Vielseitigkeit, da die Verwendung von fluoreszierend markiertem Streptavidin eine einfache Qualitätskontrolle in einem sehr frühen Stadium des Verfahrens ermöglicht. Das Protokoll kann durch die Einführung von FluorNanogold-markiertem Streptavidin weiter vereinfacht werden, jedoch gaben diese Reagenzien in unseren Händen im Vergleich zu Nanogold-Streptavidin einen etwas höheren Hintergrund, möglicherweise aufgrund der größeren Größe der Sonden.
Drittens bietet eine Kombination kleiner Sonden, wobei Streptavidin-Nanogold die größte Komponente von etwa 5 nm ist, eine sehr gute Penetration in sogar glutaraldehydvernetzte Zellen. Dies macht die Technik geeignet für die Voreinbettung der Markierung von optimal ultrastrukturell konservierten Zellen und leicht kompatibel mit verschiedenen 3D-Elektronenmikroskopie-Techniken, einschließlich serieller Schnittrekonstruktion, Array-Tomographie, Elektronentomographie, serieller Blockflächenbildgebung und FIB-REM.
Die Silberveredelung ist der kritischste Schritt, der eine präzise Kontrolle der Reagenzdiffusions- und Waschschritte erfordert, was mit adhärenten Zellen einfacher durchzuführen ist. Da andererseits eine starke Vernetzung mit Glutaraldehyd auch die Silberverstärkung beeinflussen kann, sollten die Fixationsbedingungen fein abgestimmt werden, um die Erhaltung der Chromatinstruktur und die Effizienz der Silberverstärkung auszugleichen. Aus diesem Grund sind Kryofixations-/Kryosubstitutionstechniken, die eine erweiterte und schlecht kontrollierte Nachfixierung erfordern, obwohl sie eine noch bessere Strukturerhaltung ermöglichen, möglicherweise nicht vollständig mit der vorgeschlagenen Kennzeichnungsstrategievereinbar 23. Die Technik kann durch die Verwendung von Au-Amplifikation anstelle von Silberverstärkung24 weiter verbessert werden. Diese Modifikation ermöglicht es, den Goldtoning-Schritt zu überspringen, aber in unseren Händen gibt es einen deutlich höheren Hintergrund.
Schließlich ermöglicht die Prä-Embedding-Markierung die Vorauswahl von Zielzellen für ChromEM und die Schnittaufnahme basierend auf dem Replikationsmuster, das unter Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskop detektiert werden kann. Darüber hinaus kann die Methode leicht auf CLEM erweitert werden, einschließlich verschiedener Super-Resolution-Techniken. Dies eröffnet neue Horizonte in der Erforschung der Struktur und Dynamik von Chromatin höherer Ordnung in verschiedenen physiologischen Zuständen. Der hier beschriebene Ansatz kann für Studien der Chromatinorganisation an Replikationsstellen, für die Analyse der postreplizierten Neuanordnung von Chromatin, einschließlich hochauflösender Bildgebung der Chromatidsegregation in Interphase, und für die replizierende Markierung großer Chromosomendomänen und Studien der Chromatinfaltung höherer Ordnung bestimmter Fraktionen des Genoms (Euchromatin oder Heterochromatin, markiert basierend auf dem Replikationstiming) verwendet werden. Diese Art von bildgebenden Verfahren sind auch als Bezugspunkt für die Daten wichtig, die durch alternative Ansätze generiert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil von RSF (Grant #17-15-01290) und RFBR (Grant #19-015-00273) unterstützt. Die Autoren danken dem Lomonosov Moscow State University Development Program (PNR 5.13) und dem Nikon Center of Excellence in korrelativer Bildgebung am Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology für den Zugang zu bildgebenden Instrumenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
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