Summary
Detta protokoll presenterar en teknik för högupplöst kartläggning av replikationsställen i strukturellt bevarat kromatin in situ som använder en kombination av förinbäddning av EdU-streptavidin-Nanogold-märkning och ChromEMT.
Abstract
Principer för DNA-vikning i cellkärnan och dess dynamiska omvandlingar som uppstår under uppfyllandet av grundläggande genetiska funktioner (transkription, replikation, segregering etc.) förblir dåligt förstådda, delvis på grund av bristen på experimentella metoder för högupplöst visualisering av specifika kromatinlokier i strukturellt bevarade kärnor. Här presenterar vi ett protokoll för visualisering av replikativa domäner i monolagercellodling in situ, genom att kombinera EdU-märkning av nyligen syntetiserat DNA med efterföljande etikettdetektion med Ag-amplifiering av Nanogold-partiklar och ChromEM-färgning av kromatin. Detta protokoll möjliggör högkontrast, högeffektiv förinbäddningsmärkning, kompatibel med traditionell glutaraldehydfixering som ger den bästa strukturella bevarandet av kromatin för rumstemperaturprovbehandling. En annan fördel med förinbäddning av märkning är möjligheten att förvälla celler av intresse för sektionering. Detta är särskilt viktigt för analys av heterogena cellpopulationer, liksom kompatibilitet med elektrontomografimetoder för högupplöst 3D-analys av kromatinorganisation vid replikationsställen och analys av postreplikativ kromatinomläggning och systerkromatidsegregering i interfasen.
Introduction
DNA-replikation är en grundläggande biologisk process som krävs för trogen kopiering och överföring av den genetiska informationen under celldelning. I högre eukaryoter utsätts DNA-replikation för tät spatio-temporal reglering, vilket manifesteras i sekventiell aktivering av replikationens ursprung1. Angränsande replikeringsursprung som avfyras synkront bildar kluster av replikationskoner2. På nivån av optisk mikroskopi detekteras platser för pågående DNA-replikation som replikationsfoci av olika antal och storlek. Replikationsfoci visar specifika mönster för rumslig fördelning inom cellkärnan beroende på replikationstiden för det märkta DNA 3,4, vilket i sin tur är tätt korrelerat med dess genaktivitet. Tack vare väldefinierad sekvens av DNA-replikation, strikt ordnad i rum och tid, är replikativ märkning en kraftfull metod för exakt DNA-märkning, inte bara för studier av replikationsprocessen i sig, utan också för att diskriminera en specifik DNA-subfraktion med definierad transkriptionsaktivitet och komprimeringsnivå. Visualisering av replikerande kromatin utförs vanligtvis genom detektion av huvudproteinkomponenter i DNA-replikationsmaskiner (antingen genom immunfärgning eller genom uttryck av fluorescerande proteintaggar 5,6) eller genom införlivande av modifierade DNA-syntesprekursorer 7,8,9,10 . Av dessa möjliggör endast metoder baserade på införlivandet av modifierade nukleotider i nyligen replikerat DNA att fånga konformationsförändringar i kromatin under replikation och spåra beteendet hos replikativa domäner efter att deras replikation är klar.
I högre eukaryoter lägger DNA-förpackning i kromatin till en annan nivå av komplexitet till regleringen av grundläggande genetiska funktioner (transkription, replikation, reparation etc.). Kromatinveckning påverkar DNA: s tillgänglighet till regulatoriska transfaktorer och DNA-konformationsförändringar (dubbelhelixavlindning) som krävs för mallsyntesen. Därför är det allmänt accepterat att DNA-beroende syntetiska processer i cellkärnan kräver en strukturell övergång av kromatin från dess kondenserade, repressiva tillstånd till en mer tillgänglig, öppen konformation. Cytologiskt definieras dessa två kromatintillstånd som heterokromatin och eukromatin. Det finns emellertid fortfarande ingen enighet om sättet att DNA-vikas i kärnan. Hypoteserna sträcker sig från en "polymersmältningsmodell" 11, där nukleosomal fiber beter sig som en slumpmässig polymer för vilken förpackningsdensiteten styrs av fasseparationsmekanismer, till hierarkiska vikningsmodeller som postulerar sekventiell bildning av kromatinfiberliknande strukturer med ökande tjocklek12,13. Hierarkiska vikningsmodeller fick nyligen stöd från molekylära tillvägagångssätt baserade på analys av in situ DNA-DNA-kontakter (kromosomkonformationsfångst, 3C), vilket visar förekomsten av hierarkin för kromatinstrukturella domäner14. Det är viktigt att notera att replikationsenheter korrelerar mycket bra med dessa kromatindomäner15. Den största kritiken mot dessa modeller är baserad på potentiell artificiell kromatinaggregering orsakad av provberedningsförfaranden, såsom permeabilisering av cellmembran och avlägsnande av icke-kromatinkomponenter, för att förbättra kromatinkontrasten för ultrastrukturella studier samtidigt som kromatintillgängligheten för olika sonder förbättras (t.ex. antikroppar). De senaste tekniska framstegen inom selektiv DNA-färgning för elektronmikroskopi genom DNA-bindande fluoroformedierad fotooxidation av diaminobenzidin (ChromEMT6) har gjort det möjligt att eliminera detta hinder. Samma överväganden gäller emellertid för elektronmikroskopivisualisering av replikering av DNA17,18. Här beskriver vi en teknik som möjliggör samtidig högupplöst ultrastrukturell kartläggning av nysyntetiserat DNA och totalt kromatin i intakta aldehyd-tvärbundna celler. Tekniken kombinerar detektion av EdU-märkt DNA genom klickkemi med biotinylerade sonder och streptavidin-nanoguld och ChromEMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet är optimerat för vidhäftande celler och testades på HeLa-, HT1080- och CHO-cellinjer.
1. Cellmärkning och fixering
- Tallriksceller på syrarenade täckglas i en 3 cm petriskål. Odla cellerna i mediet som rekommenderas för cellinjen som används till 70% sammanflöde.
- Tillsätt EdU (5-etynyl-2'-deoxiuridin) från 10 mM-beståndet till 10 μM slutlig koncentration och placera cellerna i inkubatorn i 10 minuter eller längre (beroende på experimentmålet). För kortare pulser (upp till 2 min), förbered en petriskål med förvärmda färska odlingsmedier kompletterade med 10 μM EdU och överför täckglas i den, snarare än att tillsätta EdU direkt till cellerna.
OBS: Alla efterföljande steg utförs vid rumstemperatur om inte annat anges. - Fixera de märkta cellerna med 2,5% glutaraldehyd, nytillverkade genom att späda 25% lager i 100 mM kacodylatbuffert, i 1 timme.
OBS: De efterföljande EdU-detekteringsstegen är känsliga för fixeringstidpunkten. Längre fixeringstider kan påverka EdU-märkningen negativt, vilket orsakar lägre signal-brusförhållande. - Ta bort glutaraldehyd genom att tvätta proverna med PBS kompletterat med 5 mM MgCl2 (PBS* därefter). Tvätta tre gånger med en 10 min inkubation för varje tvätt.
- Permeabilisera plasmamembran med 1% Triton X-100 i PBS* (PBS*T därefter). Tvätta två gånger med en 5 min inkubation för varje tvätt.
- Tvätta provet i stor utsträckning med PBS*. Utför fem ändringar och inkubera i 5 min i varje förändring.
- Släck de restfria aldehydgrupperna med 20 mM glycin i PBS*, två gånger i 10 min vardera.
- Blockera proverna i 1% BSA i PBS * i 30 min.
2. Klickreaktion
OBS: Denna procedur är modifierad från ett tidigare publicerat protokoll19.
- Omedelbart före användning, förbered klickreaktionsblandning för EdU-detektion: i ett mikrocentrifugrör, blanda 430 μL 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL 100 mMCuSO4, 1,2 μL biotin-azid (10 mM i DMSO) och 50 μL 0,5 M askorbinsyra. För kvalitetskontroll av replikativ märkning och klickprocedur vid fluorescerande mikroskopi kan biotinazid ersättas med AlexaFluor 488-azid.
OBS: Tillsatsordningen för komponenter i ovanstående reaktion är viktig. - Utför klickreaktion i en fuktig kammare för att minimera avdunstningen och koncentrationsförskjutningarna i reaktionscocktailen. Förbered den fuktiga kammaren genom att placera ett vått ark filterpapper på botten av petriskålen och täcka den med en paraffinfilm. Placera täckglasen på filmens yta med cellerna vända uppåt och skikt 50-100 μL av reaktionscocktailen på täckglaset. Reaktionen tar 30 minuter vid rumstemperatur.
- Stoppa reaktionen genom att tvätta provet i 0,1% Triton X-100 i PBS* (PBS*T), fem gånger i 5 minuter vardera.
- Blockera i 1% BSA i PBS * T i 30 min vid rumstemperatur.
- Förbered streptavidin-Nanogold-lösningen med PBS * T innehållande 1% BSA. Inkubera provet med streptavidin, konjugerat med 1,4 nm nanoguldpartiklar (nanosonder) i 1% BSA + PBS * T över natten vid +4 ° C i den nyberedda fuktiga kammaren.
- Stoppa reaktionen och tvätta provet i PBS*T, fem gånger i 10 minuter vardera.
- Stabilisera biotin streptavidinkomplexet genom att postfixera i 1% glutaraldehyd i PBS* i 30 min.
- Ta bort glutaraldehyd genom intensiv tvättning med avjoniserat vatten och tvätta provet i PBS*, fem gånger i 20 minuter vardera.
- Släck fria aldehydgrupper med nyberedd 1 mg/ml NaBH4 i vatten, två gånger i 10 min vardera. Under inkubation bildas bubblor avH2 som kan lyfta täckglasen. Tryck försiktigt ner dem med pincetten.
- Tvätta med avjoniserat vatten fem gånger i 5 minuter vardera.
OBS: För kvalitetskontroll vid märkningssteget är det lämpligt att utföra kontrollmärkning med fluorescerande märkt streptavidin (Figur 2). Detta skulle ge en uppskattning av märkningsintensitet och bakgrundsnivå innan du byter till tråkiga och artefaktbenägna efterföljande steg.
3. Ag-förstärkning
OBS: Detta förfarande har ändrats från Gilerovitch et al., 1995 (se 20,21).
- Resuspend 50 g akaciapulver i 100 ml avjoniserat vatten. Lös upp i 3 dagar, degas och filtrera genom fyra lager ostduk. Förvara fryst i 5 ml alikvoter i 50 ml rör. Tina omedelbart före användning.
- Tillsätt 2 ml 1 M MES (pH = 6,1) till 5 ml tinad alikvot av akaciapulverlösning för att göra 7 ml 0,28 M MES (pH = 6,1) i akaciapulverlösning. Blanda genom att långsamt gunga röret i 30 min. Vik in röret med folie för att skydda mot ljus.
- Samtidigt med steg 3.2., tvätta täckglas med tvättbuffert (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM sackaros), tre gånger i 10 min vardera.
- Förbered den färska lösningen av N-propylgallat (NPG). Lös upp 10 mg NPG i ett 15 ml rör i 250 μL 96% etanol och justera till 5 ml med avjoniserat vatten.
- Lägg 36 mg silverlaktat i ett folielindat 15 ml rör.
- Efter steg 3.2. är klar, tillsätt 1,5 ml NPG-lösning till akaciapulverblandning och sten i ytterligare 3 minuter.
OBS: Alla efterföljande steg utförs i ett mörkrum. Använd icke-aktiniskt safelight (gult eller rött). - Balansera provet med tvättbuffert och fortsätt till det mörka rummet. Tillsätt samtidigt 5 ml avjoniserat vatten till silverlaktat och lös upp genom kraftig skakning i 1-2 min.
- Tillsätt 1,5 ml silverlaktatlösning till akaciapulverblandningen, rocka långsamt i 1 min. Undvik bubbelbildning, eftersom syre i blandningen kommer att sakta ner reaktionen.
- Töm lösningen från skålen med täckglas och häll 3 ml silverlaktat-akaciapulverblandning på cellerna. Rocka skålen flera gånger och inkubera i 2-5 min. Inkubationstiden beror på akaciapulversats och temperaturen. Detta bör definieras experimentellt.
OBS: En längre inkubationstid kan resultera i ospecifik silverbindning. - För att stoppa reaktionen, töm reaktionsblandningen och tvätta skålen i stor utsträckning med tre till fem förändringar av avjoniserat vatten, följt av ytterligare tre förändringar i 5 minuter vardera.
- Kontrollera färgningen under ljusfältmikroskopet. Bra färgning ska vara ljus till mörkbrun med en mycket svag gulaktig bakgrund.
OBS: Om färgningen inte utvecklas är det möjligt att upprepa omedelbart med den redan gjorda blandningen (blandningen är aktiv i ca 15 min om den hålls i mörkret). Färgningen i detta fall kan dock utvecklas för snabbt.
4. Guld toning
OBS: För att skydda silvernanopartiklar från upplösning genomOsO4-oxidation i de efterföljande förfarandena används en impregnering med guld vid detta steg (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Skölj täckglas med avjoniserat vatten.
- För att skydda silvernanopartiklar från upplösning genomOsO4-oxidation , inkubera proverna i 0,05% tetrakloraursyra i 2 min i mörkret.
- Tvätta noggrant med avjoniserat vatten i 10 min.
OBS: I detta skede tillsätts ytterligare kontrast till det DNA-innehållande materialet. Provets färg bör ändras från brunt till svart.
5. ChromEM
OBS: Detta protokoll ändrades från Ou et al., 201716.
- Inkubera täckglasen och mätta proverna i 10 μM DRAQ5 i PBS i 10 minuter i mörkret.
- Förbered 0,2 % diaminobensidintetrahydrokloridlösning (DAB) i 50 mM Tris eller PBS:
Lös upp DAB i 90% av den slutliga volymen genom att omröra kraftigt i mörkret och justera sedan pH till 7,0-7,4 med NaOH. Justera volymen till 100% och filtrera genom ett 0,22 μM filter, förvara inslaget i folie. - Tillsätt DAB-lösning till celler (2 ml per 3 cm petriskål) och inkubera i 1 min.
- Flytta täckglaset i glasbotten Petri-skålen och placera den i scenen i ett inverterat mikroskop. Bestråla provet (flera synfält) på ett inverterat mikroskop med metallhalogenidljuskälla och Cy5-filteruppsättning (640 nm, 1 W / cm2 vid fokalplanet) genom Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) lins i 10 min.
OBS: En indikation på framgångsrik DAB-fotokonvertering är fullständig DRAQ5-fotoblekning och mörk DAB-fällningsbildning i bestrålade kärnor. Det senare är dock inte alltid uppenbart över intensiv EdU-silver-guldsignal (särskilt när förlängda EdU-pulser används). - Tvätta med avjoniserat vatten tre gånger i 5 minuter vardera.
6. Inbäddning av uttorkning och epoxiharts
- I ett mikrocentrifugrör bereds delvis reducerad osmiumtetraoxidlösning genom att blanda 2% vattenlösning av K4Fe(CN)6 med en lika stor mängd 2% vattenlösning avOsO4 för att få 1% slutlig koncentration av båda komponenterna. Inkubera täckglas i reducerad OsO4 i 1 timme och tvätta i avjoniserat vatten tre gånger i 5 minuter vardera.
OBS: I detta skede reagerar den reducerade osmiumföreningen med DAB-avlagringar och ökar KONTRASTEN AV DNA.
VARNING: Osmium är giftigt, arbetar under en draghuva och hanterar avfall enligt lokala säkerhetsbestämmelser. - Dehydrera proverna i en serie graderade etanollösningar i ökande procentandelar: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
- För infiltration och inbäddning använd hartsformeln med komponentens volymetriska förhållande enligt följande: epoxihartsmonomer:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0,23 (w/w). Denna formel är blandbar med etanol.
- Inkubera täckglaset i etanol-hartsblandningen (3 delar 100% EtOH: 1 del epoxiharts) i 30 min.
- Inkubera täckglaset i etanol-hartsblandningen (1 del 100% EtOH: 1 del epoxiharts) i 2 timmar.
- Inkubera täckglaset i etanol-hartsblandningen (1 del 100% EtOH: 3 delar epoxiharts) över natten.
- Byt ut etanol-hartsblandning med nyberedd ren harts. Inkubera i ren hartsblandning i 8 timmar. Öppna skålen för att låta rester av etanol avdunsta.
- Överför täckglas till en ny skål med rent harts och inkubera i 2 timmar vid 37-42 °C.
- Fyll en kiselform med nyberedd harts. Placera täckglasen med cellerna vända nedåt på lämplig kiselform fylld med epoxiharts. Bota hartset i 24 timmar vid 37 °C, sedan vid 60 °C i minst 2 dagar.
VARNING: Komponenter i epoxihartsblandningen är potentiellt cancerframkallande. Använd handskar och arbeta under draghuven.
- Ta bort hartsplattan från formen, rengör ytan på täckglaset med skalpellen eller rakbladet. För att ta bort täckglaset, släpp täckglaset i flytande kväve och överför sedan plattan till kokande vatten. Upprepa vid behov.
- Leta reda på det bestrålade området under ett stereomikroskop och klipp ut det från plattan med en bågfil eller något annat lämpligt instrument. Förvärm plattan vid 70 °C på en värmeplatta, om det behövs.
- Fäst utskärningen i en ultramikrotom provhållare för slutlig blocktrimning. Förbered det pyramidformade provet med rakhyveln. Montera hållaren med pyramid på ultramikroromet och installera kniven.
- Trimma blocket så att de bestrålade cellerna med EdU-etikett ingår. Förbered en halvtunn sektion (250 nm tjocklek) lämplig för elektrontomografi.
OBS: Sektionstjockleken kan justeras för att passa de experimentella kraven.
- Trimma blocket så att de bestrålade cellerna med EdU-etikett ingår. Förbered en halvtunn sektion (250 nm tjocklek) lämplig för elektrontomografi.
- Lossa sektionen från knivens kant och placera dem på galler med en slits. För elektrontomografi plockas 250 nm sektioner på 1 mm enkelspåriga galler och efter torkning kan dessa sektioner kolbeläggas från båda sidor. Ingen ytterligare kontrast är nödvändig.
OBS: Eftersom sektionerna redan innehåller Au-Ag-partiklar med hög kontrast är det inte nödvändigt att tillsätta fiduciella guldpartiklar till sektionens yta. - Undersök gallren i ett transmissionselektronmikroskop vid låg förstoring (ca 600x) för att lokalisera cellerna med lämpliga replikationsmönster.
OBS: Detta protokoll genererar märkningsdensitet som är tillräckligt hög för enkel detektering av replikationsfokus även vid låg förstoring. Det är lämpligt att först skapa en karta över avsnittet för efterföljande navigering och vinkelprojektionssamling för tomografi. Byt till högre förstoring och ta högupplösta bilder.
7. Elektrontomografi
- Sätt in gallret i transmissionselektronmikroskopet med en höglutande hållare. Ladda provet i elektronmikroskopet och lokalisera det intressanta området.
- Rikta in mikroskopet i EFTEM-läge i nära parallellt belysningsläge. Ställ in energifiltret med 20 eV energivalande slits placerad vid nollförlusttopp.
- Förbestrålning av tomografiförvärvsområdet med en dosrat på 40 e/Å2/s i minst 1,5-2 min, vilket motsvarar den totala dosen minst 3000 e/Å2.
- Justera eucentrisk höjd med automatisk uppgift i SerialEM. Kontrollera autofokusuppgiften för att säkerställa att den fungerar korrekt vid noll lutningsvinkel och -0,8 mkm måldefokusvärde.
- Luta provhållaren till -60° med Walk-Up-uppgiften.
- Ställ in tomografiförvärvet från -60 till +60° med steg 2,0°. Exponeringen bör ställas in beroende på lutningsvinkeln för att hålla den genomsnittliga intensiteten på kameran. Begränsa bildförskjutningen om det orsakar ett energiskifte och därmed slits felinriktning. Tomografidata ska sparas som .mrc-fil.
- Importera .mrc-filen till IMOD-programvaran för tomografirekonstruktion. Ta bort de avvikande pixelvärdena på grund av röntgenstrålar.
- Rikta in lutningsserien. Utför initial korskorrelation och markera sedan manuellt 10-12 guldpartiklar som fiducialer. Spåra fiducialmodellen och kontrollera att varje fiducial spåras korrekt genom lutningsserien. Skapa provtomogram (skivor) och markera manuellt de tunna sektionsgränserna för att förhindra eventuell lutning av den rekonstruerade densiteten inuti volymen. Det genomsnittliga restfelet för finjustering var mindre än 1,2 pix.
- Rekonstruera tomogrammet med en filtrerad bakåtprojektionsalgoritm och trimma sedan utdata så att de passar det intressanta området i den slutliga volymen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Replikationsfoci i däggdjurscellkärnor visar distinkta distributionsmönster inom kärnan beroende på S-fasprogression. Dessa mönster korrelerar med transkriptionsaktiviteten för de loci som replikeras. Eftersom metoden som presenteras här använder ett ganska starkt fixeringsförfarande är det ganska enkelt att använda replikativ pulsmärkning för specifik detektion av kromatinloki i olika transkriptionstillstånd, även under förhållanden som erbjuder bästa strukturella bevarande av kromatin erhållet genom kemisk fixering vid rumstemperatur.
Kvalitetskontrollsteg är avsedda att säkerställa ett framgångsrikt slutförande av de viktigaste förfarandena i detta protokoll. Initialt bör framgångsrik EdU-märkning bekräftas genom klickreaktion med fluorescerande märkt azid, vilket visar typiska replikationsmönster om heterogen cellpopulation används (Figur 2). Det andra viktiga steget är streptavidinmärkning, som starkt kan påverkas av glutaraldehydfixering. För utvärdering av streptavidinbindningseffektivitet, använd AlexaFluor-488-konjugerad streptavidin under samma förhållanden som streptavidin-Nanogold (Figur 3). Vid denna tidpunkt förväntas viss bakgrund främst på grund av glutaraldehydautofluorescens samt ofullständig streptavidintvättning. Om signal-brusförhållandet är oacceptabelt kan du försöka öka antalet och varaktigheten av tvättstegen i steg 2.6. Alternativt kan du tillsätta glutaraldehydsläckning med NaBH4 (steg 2.9–2.10) efter steg 1.5.
Silverförbättringsförfarandet ger ofta inkonsekventa resultat och kräver optimering. För det första varierar reaktionshastigheten dramatiskt beroende på akaciapulverlösningssatsen. Lösningens viskositet är omvänt proportionell mot tiden för silverfärgningsutvecklingen. Det är en bra idé att ha flera alikvoter av samma sats och testa dem på kontrollproverna för att bestämma optimal reaktionstid. Eftersom temperaturen på reagenserna och miljön också har en signifikant inverkan på reaktionshastigheten, försök att utföra reaktionen vid exakt samma temperatur. Om du bearbetar mer än tre prover samtidigt är det lämpligt att starta reaktionen med 30 sekunders intervall för att få tillräckligt med tid för tvättsteg.
Ett bra resultat av silverförbättringsförfarandet är den mörkbruna färgningen av vissa (inte alla) kärnor med mycket svag gulaktig cytoplasmatisk färgning (Figur 4). Detta innebär att den genomsnittliga storleken på silverpartiklar är cirka 20 nm, vilket är lämpligt för enkel etikettdetektering i ett brett förstoringsområde av TEM över kromatinmotfärgningen. För tomografiexperiment bör partiklarnas storlek minskas till ca 10 nm genom att förkorta reaktionstiden. Färgen i detta fall ska vara ljusbrun eller rödaktig. Färgen på silverfärgning bör kontrolleras före guld toning.
DAB-fotokonvertering och osmifiering utförs efter guld toning för att skydda silverskal från upplösning. Vid otillräcklig guldimpregnering blir silvernanopartiklar eroderade och får oregelbunden form, men förblir fortfarande synliga under TEM. Kvaliteten på DAB-fotokonvertering övervakas först genom DRAQ5-blekning (i fluorescensläge), sedan i ett ljusfältsläge, när cellkärnorna i ett bestrålat fält blir mörkbruna (Figur 5). DAB-färgningsintensiteten bör inte vara särskilt hög så att Ag-Au-färgningen förblir väl detekterad för att möjliggöra val av celler med erforderlig replikationstiming för sektionering.
Ultratunna eller halvtunna sektioner kräver ingen ytterligare färgning och kan ses direkt under TEM. Lämplig märkning resulterar vanligtvis i väldefinierade kluster av Ag-nanopartiklar som avgränsar replikationsplatser (figur 6), medan bakgrundsmärkning är begränsad till några nanopartiklar per kvadratmikrometer. Halvtunna sektioner är redo för tomografi och kräver inte tillsats av guldnanopartiklar till sektionsytan, eftersom Ag-nanopartiklar som finns i en sektion kan användas som fiducialmärken (figur 7). I denna figur visas effekten av förlängd märkningstid: individuell replikationsfoci smälter samman i fiberliknande strukturer, vilket avgränsar kromatindomäner av högre ordning.
Figur 1. Metodöversikten. Celler som odlas på täckglas är märkta med EdU, fixerade med 2,5% glutaraldehyd, permeabiliserade och klickreaktion utförs med biotinylerad azid. Alternativt används fluorescerande märkta azider i ljus mikroskopisk observation. Platser för biotininkorporering är märkta med Nanogold-streptavidin (eller fluorescerande märkt streptavidin som kontroll), silverförbättrad och efter guldtoning utsatt för DRAQ5-medierad DAB-fotokonvertering och osmifiering. Proverna är inbäddade i epoxiharts, sektionerade, undersökta i TEM och utsatta för elektrontomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Replikationsmönster i däggdjursceller avslöjade av EdU-märkning och klickreaktion (grön). S-fasprogression från tidig till sen S-fas (från vänster till höger) manifesteras av en ordnad förändring av replikationsmönster: A,B - tidig S-fas, C - mitten av S-fasen, D,E - sen S-fas. DNA är färgat med DAPI (rött). Skalstång = 10 um. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Replikationsmönster i däggdjursceller avslöjade av EdU-märkning och tvåstegs Click-biotin och streptavidin-AlexaFluor 488-färgning efter glutaraldehydfixering. Kontrollprov märkt med streptavidin-AlexaFluor 488 visar optimal märkningseffektivitet och S / N-förhållande efter glutaraldehydfixering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Representativ bild av celler efter silverförbättringsprocedur (steg 3). Olika replikativa mönster (tidig S-fas, pilar; mitten av S-fasen, pilspetsen; sena, dubbla pilar) är lätt synliga i ett ljusfältsljusmikroskopiläge. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. Ett typiskt resultat av DRAQ5-medierade DAB-fotokonverteringar. (A) DRAQ5-färgning (streckad cirkel indikerar bestrålat område). Observera stark DRAQ5-blekning inuti cirkeln. (B) Samma område som ses i ljusfältsmikroskop. Notera starkare DAB-nederbörd i kärnorna i bestrålat område. Infälld: pilar indikerar tidiga S-faskärnor där replikationsmönster märkta med Ag-Au fortfarande är lätt detekterbara på bakgrunden av DRAQ5-fotooxidazerad DAB-färgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6. Replikationsfoci i däggdjurscellkärnor avslöjade av EdU-märkning och tvåstegs Click-biotin och streptavidin-Nanogold-färgning efter glutaraldehydfixering. Tunna 90 nm sektioner av en S-fascell som visar kluster av Ag-Au nanopartiklar vid replikationsfoci (A, röda cirklar). Bakgrundsnivån kan uppskattas i en icke-S-fascell (B). Pilspetsar indikerar kromatinfibrer av olika skala. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7. 0°-lutningsprojektion med 250 nm sektion. (A) och virtuell tomografisk sektion. (B) av en cellkärna märkt med EdU i 2 timmar. Se individuella replikationsfoci smälta in i fiberliknande strukturer (pilspetsar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrivs här har flera fördelar jämfört med tidigare publicerade protokoll. För det första eliminerar användningen av klickkemi för märkning av replikerat DNA nödvändigheten av DNA-denatureringsförutsättningsförutsättning för BrdU-detektion med antikroppar, vilket bättre bevarar kromatin ultrastruktur.
För det andra minimerar användningen av biotin som en sekundär ligand som genereras efter glutaraldehydfixering och korrekt släckning av obundna aldehydgrupper kemisk modifiering av målet, vilket förbättrar märkningseffektiviteten samtidigt som bakgrunden reduceras på grund av endogent biotin. Biotin-streptavidin lägger också till mångsidighet eftersom användningen av fluorescerande märkt streptavidin ger enkel kvalitetskontroll i det mycket tidiga skedet av proceduren. Protokollet kan förenklas ytterligare genom införande av FluoroNanogold-märkt streptavidin, men i våra händer gav dessa reagenser något högre bakgrund jämfört med Nanogold-streptavidin, kanske på grund av större storlek på sonderna.
För det tredje ger en kombination av små sonder, streptavidin-Nanogold som den största komponenten på cirka 5 nm, mycket god penetration i även glutaraldehyd-tvärbundna celler. Detta gör tekniken lämplig för förinbäddning av märkning av optimalt ultrastrukturellt bevarade celler och lätt kompatibel med olika 3D-elektronmikroskopitekniker, inklusive seriell sektionsrekonstruktion, arraytomografi, elektrontomografi, seriell block ansiktsavbildning och FIB-SEM.
Silverförbättring är det mest kritiska steget, vilket kräver exakt kontroll av reagensdiffusion och tvättsteg, vilket är lättare att utföra med vidhäftande celler. Å andra sidan, eftersom stark tvärbindning med glutaraldehyd också kan påverka silverförbättringen, bör fixeringsförhållandena finjusteras för att balansera kromatinstrukturbevarande och silverförbättringseffektivitet. Av denna anledning kan kryofixering/kryosubstitutionstekniker, som kräver utökad och dåligt kontrollerad efterfixering, även om de möjliggör ännu bättre strukturbevarande, inte vara helt kompatibla med den föreslagna märkningsstrategin23. Tekniken kan förbättras ytterligare genom att använda Au-amplifiering istället för silverförbättring24. Denna modifiering gör det möjligt att hoppa över guldteningsteget, men i våra händer ger det betydligt högre bakgrund.
Slutligen möjliggör förinbäddningsmärkning förval av målceller för ChromEM och sektionering baserat på replikationsmönstret som kan detekteras under ljusfält eller fluorescerande mikroskop. Dessutom kan metoden enkelt utvidgas till CLEM, inklusive olika superupplösningstekniker. Detta öppnar nya horisonter i studier av kromatin högre ordningsstruktur och dynamik i olika fysiologiska tillstånd. Tillvägagångssättet som vi beskrev här kan användas för studier av kromatinorganisation vid replikationsställen, för analys av postreplikativ omläggning av kromatin, inklusive högupplöst avbildning av kromatidsegregering i interfas, och för replikativ märkning av stora kromosomala domäner och studier av kromatinveckning av högre ordning kromatinveckning av specifika fraktioner av genomet (eukromatin eller heterokromatin, märkt baserat på replikationstid). Dessa typer av avbildningstekniker är också viktiga som referenspunkt för de data som genereras av alternativa metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av RSF (bidrag #17-15-01290) och RFBR (bidrag #19-015-00273). Författarna tackar Lomonosov Moscow State University utvecklingsprogram (PNR 5.13) och Nikon Center of Excellence i korrelativ avbildning vid Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology för tillgång till bildinstrumentering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C.
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
