Summary
Этот протокол представляет собой метод картирования участков репликации с высоким разрешением в структурно сохраненном хроматине in situ , который использует комбинацию предварительного встраивания маркировки EdU-стрептавидин-Nanogold и ChromEMT.
Abstract
Принципы сворачивания ДНК в ядре клетки и ее динамических превращений, происходящих при выполнении основных генетических функций (транскрипция, репликация, сегрегация и др.), остаются малоизученными, отчасти из-за отсутствия экспериментальных подходов к визуализации высокого разрешения специфических локусов хроматина в структурно сохранившихся ядрах. Здесь представлен протокол визуализации репликативных доменов в монослойной клеточной культуре in situ, путем объединения маркировки EdU вновь синтезированной ДНК с последующим обнаружением меток с Ag-амплификацией частиц Nanogold и окрашиванием ChromEM хроматина. Этот протокол обеспечивает высококонтрастную, высокоэффективную маркировку предварительного встраивания, совместимую с традиционной фиксацией глутаральдегида, которая обеспечивает наилучшую структурную сохранность хроматина для обработки образцов при комнатной температуре. Еще одним преимуществом маркировки предварительного встраивания является возможность предварительного выбора интересующих клеток для секционирования. Это особенно важно для анализа гетерогенных клеточных популяций, а также совместимости с электронно-томографическими подходами к 3D-анализу организации хроматина высокого разрешения в местах репликации и анализу пострепликативной перестройки хроматина и сестринского хроматидного разделения в интерфазе.
Introduction
Репликация ДНК является основным биологическим процессом, необходимым для точного копирования и передачи генетической информации во время деления клеток. У высших эукариот репликация ДНК подвергается жесткой пространственно-временной регуляции, которая проявляется в последовательной активации истоков репликации1. Соседние источники репликации, запускающие синхронно, образуют кластеры репликонов2. На уровне оптической микроскопии участки продолжающейся репликации ДНК обнаруживаются как очаги репликации различного количества и размера. Репликационные очаги демонстрируют специфические закономерности пространственного распределения внутри ядра клетки в зависимости от сроков репликации меченой ДНК 3,4, что, в свою очередь, тесно коррелирует с ее генной активностью. Благодаря четко определенной последовательности репликации ДНК, строго упорядоченной в пространстве и времени, репликативная маркировка является мощным методом точной маркировки ДНК не только для изучения процесса репликации как такового, но и для различения конкретной субфракции ДНК с определенной транскрипционной активностью и уровнем уплотнения. Визуализация реплицирующегося хроматина обычно выполняется путем обнаружения основных белковых компонентов механизма репликации ДНК (либо путем иммуноокрашивания, либо путем экспрессии флуоресцентных белковых меток 5,6) или путем включения модифицированных предшественников синтеза ДНК 7,8,9,10 . Из них только методы, основанные на включении модифицированных нуклеотидов во вновь реплицированную ДНК, позволяют улавливать конформационные изменения хроматина во время репликации и отслеживать поведение репликативных доменов после завершения их репликации.
У высших эукариот упаковка ДНК в хроматин добавляет еще один уровень сложности к регуляции основных генетических функций (транскрипция, репликация, репарация и т. Д.). Складчатость хроматина влияет на доступность ДНК к регуляторным транс-факторам и конформационным изменениям ДНК (размотка двойной спирали), необходимым для синтеза шаблона. Поэтому принято считать, что ДНК-зависимые синтетические процессы в ядре клетки требуют структурного перехода хроматина из его конденсированного, репрессивного состояния в более доступную, открытую конформацию. Цитологически эти два состояния хроматина определяются как гетерохроматин и эухроматин. Тем не менее, до сих пор нет единого мнения относительно способа складывания ДНК в ядре. Гипотезы варьируются от модели11 «полимерного расплава», где нуклеосомное волокно ведет себя как случайный полимер, для которого плотность упаковки контролируется механизмами разделения фаз, до иерархических моделей складывания, постулирующих последовательное формирование хроматиновых волокнистых структур увеличивающейся толщины12,13. Иерархические модели складывания недавно получили поддержку молекулярных подходов, основанных на анализе контактов ДНК-ДНК in situ (захват конформации хромосом, 3C), демонстрируя существование иерархии структурных доменов хроматина14. Важно отметить, что единицы репликации очень хорошо коррелируют с этими хроматиновыми доменами15. Основная критика этих моделей основана на потенциальной искусственной агрегации хроматина, вызванной процедурами пробоподготовки, такими как пермеабилизация клеточных мембран и удаление нехроматиновых компонентов, чтобы улучшить контраст хроматина для ультраструктурных исследований при одновременном улучшении доступности хроматина для различных зондов (например, антител). Последние технические достижения в области селективного окрашивания ДНК для электронной микроскопии путем ДНК-связывающего флуорофоро-опосредованного фотоокисления диаминобензидина (ChromEMT6) позволили устранить это препятствие. Тем не менее, те же соображения справедливы для электронной микроскопии визуализации реплицирующей днк17,18. Здесь мы описываем технику, которая позволяет одновременно проводить ультраструктурное картирование с высоким разрешением вновь синтезированной ДНК и общего хроматина в интактных альдегидно-сшитых клетках. Метод сочетает в себе обнаружение меченой EdU ДНК с помощью Click-химии с биотинилированными зондами и стрептавидином-нанозолотом, а также ChromEMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол оптимизирован для адгезивных клеток и был протестирован на клеточных линиях HeLa, HT1080 и CHO.
1. Маркировка и фиксация клеток
- Пластинчатые ячейки на очищенных кислотой крышках в чашке Петри 3 см. Вырастите клетки в среде, рекомендуемой для используемой клеточной линии, до 70% слияния.
- Добавьте EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин) из запаса 10 мМ до конечной концентрации 10 мкМ и поместите клетки в инкубатор на 10 мин или дольше (в зависимости от цели эксперимента). Для более коротких импульсов (до 2 мин) приготовьте чашку Петри с предварительно нагретой свежей питательной средой, дополненной 10 мкМ EdU, и переложите в нее покровы, а не добавляйте EdU непосредственно в клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы проводятся при комнатной температуре, если не указано иное. - Зафиксируйте меченые клетки 2,5% глутаровым альдегидом, свежеприготовленным путем разбавления 25% запаса в 100 мМ какодилатного буфера, в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие шаги обнаружения EdU чувствительны к времени фиксации. Более длительное время фиксации может негативно повлиять на маркировку EdU, вызывая более низкое отношение сигнал/шум. - Удалите глутаровый альдегид, промыв образцы PBS, дополненным 5 мМ MgCl2 (PBS* после этого). Мойте три раза с 10-минутной инкубацией для каждой стирки.
- Пермеабилизируйте плазматические мембраны 1% Тритоном X-100 в PBS* (PBS*T впоследствии). Мойте два раза с 5-минутной инкубацией для каждой стирки.
- Тщательно промывайте образец с помощью PBS*. Выполните пять изменений и инкубируйте в течение 5 минут в каждом изменении.
- Гасить остаточные альдегидные группы глицином 20 мМ в PBS*, два раза по 10 мин каждая.
- Блокируйте образцы в 1% BSA в PBS* в течение 30 мин.
2. Клик-реакция
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура изменена по сравнению с ранее опубликованным протоколом19.
- Непосредственно перед применением приготовьте Click-реакционную смесь для обнаружения ЭдУ: в микроцентрифужной пробирке смешайте 430 мкл 100 мМ Tris-HCl (рН = 8,5), 20 мкл 100 мМ CuSO4, 1,2 мкл биотин-азида (10 мМ в ДМСО) и 50 мкл 0,5 М аскорбиновой кислоты. Для контроля качества репликативной маркировки и Click-процедуры на уровне флуоресцентной микроскопии биотин-азид может быть заменен на AlexaFluor 488-азид.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важен порядок добавления компонентов в вышеуказанной реакции. - Выполняйте щелковые реакции во влажной камере, чтобы свести к минимуму испарение и сдвиги концентрации в реакционном коктейле. Подготовьте влажную камеру, поместив влажный лист фильтровальной бумаги на дно чашки Петри и покрыв его парафиновой пленкой. Поместите крышки на поверхность пленки ячейками вверх и наложите 50-100 мкл реакционного коктейля на крышку. Реакция занимает 30 мин при комнатной температуре.
- Остановите реакцию, промыв образец в 0,1% Triton X-100 в PBS* (PBS*T), пять раз по 5 мин каждый.
- Блокировать в 1% BSA в PBS*T в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Готовят раствор стрептавидина-нанозолоты с PBS*T, содержащим 1% BSA. Инкубируют образец стрептавидином, сопряженным с 1,4 нм нанозолотистыми частицами (нанозондами) в 1% BSA + PBS*T в течение ночи при +4 °C во вновь подготовленной влажной камере.
- Остановите реакцию и промыть образец в PBS*T, пять раз по 10 мин каждый.
- Стабилизируют комплекс биотина стрептавидина постфиксом в 1% глутаральдегиде в PBS* в течение 30 мин.
- Удалите глутаровый альдегид путем интенсивного промывания деионизированной водой и промыть образец в PBS*, пять раз по 20 минут каждый.
- Тушить свободные альдегидные группы свежеприготовленным 1 мг/мл NaBH4 в воде, два раза по 10 мин каждая. Во время инкубации образуются пузырькиН2 , которые могут поднимать покровы. Осторожно толкайте их вниз пинцетом.
- Промыть деионизированной водой пять раз по 5 мин каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля качества на этапе маркировки целесообразно проводить контрольную маркировку флуоресцентно меченым стрептавидином (рисунок 2). Это обеспечит оценку интенсивности маркировки и уровня фона перед переходом к утомительным и подверженным артефактам последующим шагам.
3. Ag-усиление
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура изменена из Gilerovitch et al., 1995 (см. 20,21).
- Повторно суспендировать 50 г порошка акации в 100 мл деионизированной воды. Растворить в течение 3 дней, деградировать и процедить через четыре слоя марли. Хранить замороженными в аликвотах по 5 мл в тубах по 50 мл. Разморозить непосредственно перед использованием.
- Добавьте 2 мл 1 M MES (pH = 6,1) к 5 мл размороженной аликвоты порошкового раствора акации, чтобы получить 7 мл 0,28 M MES (pH = 6,1) в растворе порошка акации. Перемешайте, медленно раскачивая трубку в течение 30 минут. Оберните трубку фольгой для защиты от света.
- Одновременно с шагом 3.2., стирайте крышки с промывочным буфером (50 мМ MES, рН = 5,8, 200 мМ сахарозы), трижды по 10 мин каждая.
- Готовят свежий раствор N-пропилгаллата (НПГ). В пробирке объемом 15 мл растворите 10 мг НПГ в 250 мкл 96% этанола и доведите до 5 мл с деионизированной водой.
- Поместите 36 мг лактата серебра в завернутую фольгой пробирку объемом 15 мл.
- После шага 3.2. завершается, добавляют 1,5 мл раствора НПГ в смесь порошкового акации и породы еще 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги выполняются в темной комнате. Используйте неактинический безопасный свет (желтый или красный). - Уравновешивайте образец с помощью промывочного буфера и переходите в темное помещение. Одновременно добавляют 5 мл деионизированной воды в лактат серебра и растворяют путем энергичного встряхивания в течение 1-2 мин.
- Добавьте 1,5 мл раствора лактата серебра в смесь порошка акации, медленно раскачивая в течение 1 мин. Избегайте образования пузырьков, так как кислород в смеси замедлит реакцию.
- Слейте раствор из посуды с помощью обложек и вылейте на ячейки 3 мл смеси порошка лактата серебра и акации. Прокачайте блюдо несколько раз и высиживайте в течение 2-5 мин. Время инкубации зависит от партии порошка акации и температуры. Это должно быть определено экспериментально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время инкубации может привести к неспецифическому связыванию серебра. - Чтобы остановить реакцию, слейте реакционную смесь и тщательно вымойте посуду с тремя-пятью изменениями деионизированной воды, а затем еще тремя изменениями в течение 5 минут каждая.
- Проверьте окрашивание под микроскопом Brightfield. Хорошее окрашивание должно быть от светло-коричневого до темно-коричневого с очень слабым желтоватым фоном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если окрашивание не развивается, можно сразу же повторить с уже сделанной смесью (смесь активна около 15 минут, если ее держать в темноте). Однако окрашивание в этом случае может развиваться слишком быстро.
4. Золотая тонировка
ПРИМЕЧАНИЕ: Для защиты наночастиц серебра от растворения путем окисления OsO4 в последующих процедурах на этом этапе используется пропитка золотом (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Промойте крышки деионизированной водой.
- Чтобы защитить наночастицы серебра от растворения путем окисления OsO4 , инкубируйте образцы в 0,05% тетрахлорауровой кислоты в течение 2 мин в темноте.
- Тщательно промойте деионизированной водой в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе к МАТЕРИАЛУ, содержащему ДНК, добавляется дополнительный контраст. Цвет образца должен измениться с коричневого на черный.
5. ХромЕМ
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был изменен из Ou et al., 201716.
- Инкубируйте крышки и насыщайте образцы 10 мкМ DRAQ5 в PBS в течение 10 мин в темноте.
- Приготовьте 0,2% раствор диаминобензидина тетрагидрохлорида (DAB) в 50 мМ Tris или PBS:
растворите DAB в 90% конечного объема, энергично перемешивая в темноте, затем отрегулируйте рН до 7,0-7,4 с NaOH. Отрегулируйте громкость до 100% и фильтруйте через фильтр 0,22 мкМ, храните завернутым в фольгу. - Добавить в клетки раствор DAB (2 мл на чашку Петри 3 см) и инкубировать в течение 1 мин.
- Переместите крышку в стеклянную нижнюю чашку Петри и поместите ее в стадию перевернутого микроскопа. Облучение образца (несколько полей зрения) на перевернутом микроскопе с металлогалогенным источником света и набором фильтров Cy5 (640 нм, 1 Вт/см2 в фокальной плоскости) через объектив Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Показателем успешной фотоконверсии DAB является полное фотоотбеливание DRAQ5 и образование темных осадков DAB в облученных ядрах. Однако последнее не всегда проявляется над интенсивным сигналом EdU-серебро-золото (особенно при использовании расширенных импульсов EdU). - Промыть деионизированной водой три раза по 5 мин каждый.
6. Обезвоживание и встраивание эпоксидной смолы
- В микроцентрифужной трубке готовят частично восстановленный раствор тетраоксида осмия путем смешивания 2% водного раствора K4Fe(CN)6 с равным количеством 2% водного раствора OsO4, чтобы получить 1% конечную концентрацию обоих компонентов. Инкубировать крышки в уменьшенном OsO4 в течение 1 ч и промывать в деионизированной воде три раза по 5 мин каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе восстановленное соединение осмия реагирует с отложениями DAB и увеличивает контраст ДНК.
ВНИМАНИЕ: Осмий токсичен, работает под вытяжным капотом и обрабатывает отходы в соответствии с местными правилами безопасности. - Обезвоживают образцы в серии градуированных растворов этанола в возрастающих процентах: 50% EtOH - 3 х 10 мин; 70% EtOH - 3 x 10 мин, 80% EtOH - 3 x 10 мин, 96% EtOH - 3 x 10 мин, 100% EtOH - 3 x 10 мин.
- Для инфильтрации и встраивания используют формулу смолы с объемным соотношением компонентов следующим образом: мономер эпоксидной смолы:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0,23 (w/w). Эта формула смешивается с этанолом.
- Инкубируйте крышку в смеси этанол-смола (3 части 100% EtOH:1 часть эпоксидной смолы) в течение 30 мин.
- Инкубировать крышку в смеси этанол-смола (1 часть 100% EtOH:1 часть эпоксидной смолы) в течение 2 ч.
- Инкубируйте крышку в смеси этанол-смола (1 часть 100% EtOH:3 части эпоксидной смолы) в течение ночи.
- Замените смесь этанол-смола свежеприготовленной чистой смолой. Инкубировать в чистой смоляной смеси в течение 8 ч. Откройте блюдо, чтобы остатки этанола испарились.
- Переложить крышки в новую посуду с чистой смолой и инкубировать в течение 2 ч при 37-42 °C.
- Заполните силиконовую форму свежеприготовленной смолой. Поместите крышки с ячейками лицом вниз на соответствующую силиконовую форму, заполненную эпоксидной смолой. Отверждают смолу в течение 24 ч при 37 °C, затем при 60 °C в течение не менее 2 дней.
ВНИМАНИЕ: Компоненты смеси эпоксидных смол являются потенциальными канцерогенами. Надевайте перчатки и работайте под вытяжным капюшоном.
- Снимите смоляную плиту с формы, очистите поверхность крышки скальпелем или лезвием бритвы. Чтобы удалить крышку, опустите крышку в жидкий азот, а затем переложите плиту в кипящую воду. При необходимости повторите.
- Расположите облученную область под стереомикроскопом и вырежьте ее из плиты ножовкой или любым другим подходящим инструментом. При необходимости предварительно прогрейте плиту при температуре 70 °C на конфорке.
- Закрепите вырез в держателе для ультрамикротомных образцов для окончательной обрезки блока. С помощью бритвы подготовьте образец пирамидальной формы. Установите держатель с пирамидой на ультрамикротом и установите нож.
- Обрежьте блок так, чтобы облученные ячейки с меткой EdU были включены. Подготовьте полутонкий срез (толщина 250 нм), пригодный для электронной томографии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина сечения может быть отрегулирована в соответствии с экспериментальными требованиями.
- Обрежьте блок так, чтобы облученные ячейки с меткой EdU были включены. Подготовьте полутонкий срез (толщина 250 нм), пригодный для электронной томографии.
- Отсоедините секции от края ножа и поместите их на однощелевые сетки. Для электронной томографии секции 250 нм подбираются на однощеловые сетки диаметром 1 мм и после высыхания эти участки могут быть покрыты углеродным покрытием с обеих сторон. Никаких дополнительных контрастов не требуется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку секции уже содержат высококонтрастные частицы Au-Ag, нет необходимости добавлять фидуциальные частицы золота на поверхность секции. - Исследуйте сетки в просвечивающем электронном микроскопе при низком увеличении (около 600x), чтобы найти клетки с соответствующими моделями репликации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол генерирует плотность маркировки, достаточно высокую для легкого обнаружения фокусов репликации даже при низком увеличении. Желательно сначала создать карту участка для последующей навигации и сбор угловых проекций для томографии. Переключитесь на более высокое увеличение и делайте изображения с высоким разрешением.
7. Электронная томография
- Вставьте сетку в просвечивающий электронный микроскоп с помощью держателя с высоким наклоном. Загрузите образец в электронный микроскоп и найдите интересующую область.
- Выровняйте микроскоп в режиме EFTEM в режиме почти параллельного освещения. Настройте энергетический фильтр с помощью щели 20 эВ, расположенной на пике с нулевыми потерями.
- Предварительно облучают область получения томографии при мощности дозы 40 е/Å2/с в течение не менее 1,5-2 мин, что соответствует общей дозе не менее 3000 е/Å2.
- Отрегулируйте высоту эйцентрика с помощью автоматической задачи в SerialEM. Проверьте задачу автофокусировки, чтобы убедиться, что она работает правильно при нулевом угле наклона и значении расфокусировки цели -0,8 мкм.
- Наклоните держатель образца до -60° с помощью задачи Walk-Up.
- Настройте томографию в диапазоне от -60 до +60° с шагом 2,0°. Экспозиция должна быть установлена в зависимости от угла наклона, чтобы сохранить среднюю интенсивность на камере. Ограничьте сдвиг изображения в случае, если он вызывает сдвиг энергии и, следовательно, смещение щели. Данные томографии должны быть сохранены в виде файла .mrc.
- Импортируйте файл .mrc в программное обеспечение IMOD для реконструкции томографии. Удалите значения пикселей из-за рентгеновских лучей.
- Выровняйте ряд наклона. Выполните начальную перекрестную корреляцию, затем вручную пометьте 10-12 частиц золота как фидуциалы. Отслеживайте фидуциальную модель и проверяйте, что каждый фидуциал отслеживается правильно через серии наклона. Создайте образцовые томограммы (срезы) и вручную пометьте тонкие границы сечения, чтобы предотвратить возможный наклон реконструированной плотности внутри объема. Средняя остаточная погрешность для точного выравнивания составляла менее 1,2 пикселя.
- Реконструируйте томограмму с помощью отфильтрованного алгоритма обратной проекции, а затем обрежьте выходные данные, чтобы вписать интересующую область в конечный объем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Очаги репликации в ядрах клеток млекопитающих демонстрируют отчетливые закономерности распределения внутри ядра в зависимости от прогрессирования S-фазы. Эти паттерны коррелируют с транскрипционной активностью реплицируемых локусов. Поскольку метод, представленный здесь, использует довольно сильную процедуру фиксации, довольно просто использовать репликативную импульсную маркировку для специфического обнаружения локусов хроматина в различных транскрипционных состояниях, даже в условиях, обеспечивающих наилучшую структурную сохранность хроматина, полученного путем химической фиксации при комнатной температуре.
Этапы контроля качества предназначены для обеспечения успешного завершения ключевых процедур в этом протоколе. Первоначально успешная маркировка EdU должна быть подтверждена Click-реакцией с флуоресцентно меченым азидом, демонстрируя типичные паттерны репликации, если используется гетерогенная клеточная популяция (рисунок 2). Вторым важным этапом является маркировка стрептавидина, на которую может сильно влиять фиксация глутаральдегида. Для оценки эффективности связывания стрептавидина используют AlexaFluor-488-конъюгированный стрептавидин в тех же условиях, что и стрептавидин-нанозолото (рисунок 3). В этот момент ожидается некоторый фон в основном из-за аутофлуоресценции глутаральдегида, а также неполного вымывания стрептавидина. Если отношение сигнал/шум неприемлемо, попробуйте увеличить количество и продолжительность шагов промывки на шаге 2.6. В качестве альтернативы добавляют закалку глутаровым альдегидом с NaBH4 (этапы 2.9-2.10) после шага 1.5.
Процедура увеличения серебра часто дает противоречивые результаты и требует оптимизации. Во-первых, скорость реакции резко варьируется в зависимости от партии раствора порошка акации. Вязкость раствора обратно пропорциональна времени развития окрашивания серебра. Рекомендуется иметь несколько аликвот одной партии и тестировать их на контрольных образцах для определения оптимальных сроков реакции. Поскольку температура реагентов и окружающей среды также оказывает значительное влияние на скорость реакции, старайтесь выполнять реакцию при точно такой же температуре. При обработке более трех образцов одновременно удобно начинать реакцию с интервалом в 30 секунд, чтобы иметь достаточно времени для этапов промывки.
Хорошим результатом процедуры увеличения серебра является темно-коричневое окрашивание некоторых (не всех) ядер с очень слабым желтоватым цитоплазматическим окрашиванием (рисунок 4). Это означает, что средний размер частиц серебра составляет около 20 нм, что подходит для легкого обнаружения меток в широком диапазоне увеличения TEM над встречным окрашиванием хроматина. Для томографических экспериментов размер частиц должен быть уменьшен примерно до 10 нм за счет сокращения времени реакции. Цвет в этом случае должен быть светло-коричневым или красноватым. Цвет серебристого окрашивания должен быть проверен перед золотой тонировкой.
Фотоконверсия и осмификация DAB выполняется после тонирования золота для защиты серебряных оболочек от растворения. В случае недостаточной пропитки золота наночастицы серебра размываются и приобретают неправильную форму, но все еще остаются видимыми под ТЭМ. Качество фотоконверсии DAB контролируется сначала отбеливанием DRAQ5 (в режиме флуоресценции), затем в режиме яркого поля, когда ядра клеток в облученном поле становятся темно-коричневыми (рисунок 5). Интенсивность окрашивания DAB не должна быть очень высокой, чтобы окрашивание Ag-Au оставалось хорошо обнаруженным, чтобы можно было выбрать клетки с требуемыми сроками репликации для секционирования.
Ультратонкие или полутонкие срезы не требуют дополнительного окрашивания и могут быть просмотрены непосредственно под ТЭМ. Соответствующая маркировка обычно приводит к четко определенным кластерам наночастиц Ag, разграничивающим участки репликации (рисунок 6), в то время как фоновая маркировка ограничена несколькими наночастицами на квадратный микрометр. Полутонкие срезы готовы к томографии и не требуют добавления наночастиц золота к поверхности сечения, так как присутствующие в сечении наночастицы Ag могут быть использованы в качестве фидуциальных меток (рисунок 7). На этом рисунке показан эффект длительного времени маркировки: отдельные очаги репликации сливаются в волокнистые структуры, очерчивая хроматиновые домены высшего порядка.
Рисунок 1. Обзор метода. Клетки, выращенные на покровных листах, маркируют EdU, фиксируют 2,5% глутаровым альдегидом, пермеабилизируют, а Click-реакцию проводят биотинилированным азидом. Альтернативно, флуоресцентно меченые азиды используются в световых микроскопических наблюдениях. Участки инкорпорации биотина маркируют нанозолотистым стрептавидином (или флуоресцентно меченым стрептавидином в качестве контроля), серебром усиленным, а после тонирования золота подвергаются DRAQ5-опосредованной DAB фотоконверсии и осмификации. Образцы встраиваются в эпоксидную смолу, секционируются, исследуются в ТЕА и подвергаются электронной томографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Паттерны репликации в клетках млекопитающих, выявленные с помощью маркировки EdU и Click-реакции (зеленый). Прогрессирование S-фазы от ранней до поздней S-фазы (слева направо) проявляется упорядоченным изменением паттернов репликации: A,B - ранняя S-фаза, C - средняя S-фаза, D,E - поздняя S-фаза. ДНК окрашивается DAPI (красный). Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Паттерны репликации в клетках млекопитающих, выявленные с помощью маркировки EdU и двухэтапного окрашивания Click-биотина и стрептавидина-AlexaFluor 488 после фиксации глутаральдегида. Контрольный образец, маркированный стрептавидином-AlexaFluor 488, отображает оптимальную эффективность маркировки и соотношение сигнал/шум после фиксации глутарового альдегида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Репрезентативное изображение клеток после процедуры увеличения серебра (Шаг 3). Различные репликативные паттерны (ранняя S-фаза, стрелки; средняя S-фаза, наконечник стрелы; поздние, двойные стрелки) легко видны в режиме световой микроскопии яркого поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Типичный результат DRAQ5-опосредованной DAB фотоконверсии. (A) Окрашивание DRAQ5 (пунктирный круг указывает на облученную область). Обратите внимание на сильное отбеливание DRAQ5 внутри круга. (B) Та же область, которая видна в ярко-полевом световом микроскопе. Отмечают более сильное осаждение DAB в ядрах в облученной области. Вставка: стрелки указывают на ранние ядра S-фазы, где паттерны репликации, помеченные Ag-Au, все еще легко обнаруживаются на фоне окрашивания DRAQ5-photo-oxidazed DAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6. Очаги репликации в ядрах клеток млекопитающих, выявленные путем маркировки EdU и двухэтапного окрашивания Click-биотином и стрептавидином-нанозолотом после фиксации глутаральдегида. Тонкие 90 нм участки S-фазовой ячейки, показывающие скопления наночастиц Ag-Au в очагах репликации (А, красные круги). Фоновый уровень может быть оценен в не-S-фазовой ячейке (B). Наконечники стрел указывают на хроматиновые волокна различного масштаба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7. 0°-наклонная проекция сечения 250 нм. (А) и виртуальный томографический раздел. (B) клеточного ядра, меченого EdU в течение 2 ч. См. отдельные фокусы репликации, слитые в волоконоподобные структуры (наконечники стрел). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь, имеет ряд преимуществ перед ранее опубликованными протоколами. Во-первых, использование Click-химии для маркировки реплицированной ДНК устраняет необходимость в предпосылке денатурации ДНК для обнаружения BrdU антителами, тем самым лучше сохраняя ультраструктуру хроматина.
Во-вторых, утилизация биотина в качестве вторичного лиганда, который образуется после фиксации глутаральдегида и правильного гашения несвязанных альдегидных групп, минимизирует химическую модификацию мишени, тем самым повышая эффективность маркировки при одновременном снижении фона за счет эндогенного биотина. Биотин-стрептавидин также добавляет универсальности, так как использование флуоресцентно меченого стрептавидина обеспечивает легкий контроль качества на самой ранней стадии процедуры. Протокол может быть дополнительно упрощен введением фторнаногольд-меченого стрептавидина, однако в наших руках эти реагенты давали несколько более высокий фон по сравнению с Nanogold-стрептавидином, возможно, из-за большего размера зондов.
В-третьих, комбинация небольших зондов, стрептавидин-нанозолото является самым крупным компонентом около 5 нм, обеспечивает очень хорошее проникновение даже в клетки, сшитые глутаровым альдегидом. Это делает технику подходящей для предварительного встраивания маркировки оптимально ультраструктурно сохраненных клеток и легко совместимой с различными методами 3D-электронной микроскопии, включая реконструкцию серийного сечения, массивную томографию, электронную томографию, последовательную блочную визуализацию лица и FIB-SEM.
Увеличение серебра является наиболее важным этапом, требующим точного контроля диффузии реагентов и этапов промывки, которые легче выполнять с адгезионными клетками. С другой стороны, поскольку сильное сшивание с глутаровым альдегидом также может влиять на увеличение серебра, условия фиксации должны быть точно настроены, чтобы сбалансировать сохранение структуры хроматина и эффективность повышения серебра. По этой причине методы криофиксации/криозамещения, которые требуют расширенной и плохо контролируемой постфиксации, хотя и позволяют еще лучше сохранить структуру, могут быть не полностью совместимы с предлагаемой стратегией маркировки23. Техника может быть дополнительно улучшена с помощью Au-усиления вместо серебряного усиления24. Данная модификация позволяет пропустить шаг тонирования золота, однако в наших руках она дает значительно более высокий фон.
Наконец, предварительное встраивание маркировки позволяет предварительно выбрать клетки-мишени для ChromEM и секционирования на основе паттерна репликации, обнаруживаемого под ярким полем или флуоресцентным микроскопом. Кроме того, метод может быть легко распространен на CLEM, включая различные методы сверхразрешения. Это открывает новые горизонты в исследованиях структуры и динамики хроматина высшего порядка в различных физиологических состояниях. Описанный здесь подход может быть использован для исследований организации хроматина в местах репликации, для анализа пострепликативной перестройки хроматина, включая визуализацию с высоким разрешением сегрегации хроматид в интерфазе, а также для репликативной маркировки крупных хромосомных доменов и исследований сворачивания хроматина более высокого порядка определенных фракций генома (эвхроматина или гетерохроматина, меченных на основе времени репликации). Эти типы методов визуализации также важны в качестве ориентира для данных, генерируемых альтернативными подходами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Эта работа была поддержана частично РНФ (грант No17-15-01290) и РФФИ (грант No19-015-00273). Авторы благодарят программу развития МГУ им. М.В. Ломоносова (ПНР 5.13) и Центр передового опыта «Никон» по корреляционной визуализации при Белозерском институте физико-химической биологии за доступ к приборам визуализации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C.
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
