Summary
Este protocolo presenta una técnica para el mapeo de alta resolución de sitios de replicación en cromatina estructuralmente preservada in situ que emplea una combinación de etiquetado EdU-streptavidin-Nanogold preincrustante y ChromEMT.
Abstract
Los principios del plegamiento del ADN en el núcleo celular y sus transformaciones dinámicas que ocurren durante el cumplimiento de las funciones genéticas básicas (transcripción, replicación, segregación, etc.) siguen siendo poco conocidos, en parte debido a la falta de enfoques experimentales para la visualización de alta resolución de loci de cromatina específicos en núcleos estructuralmente conservados. Aquí presentamos un protocolo para la visualización de dominios replicativos en cultivo celular monocapa in situ, combinando el etiquetado EdU de ADN recién sintetizado con la posterior detección de etiquetas con amplificación ag-amplificación de partículas Nanogold y tinción ChromEM de cromatina. Este protocolo permite el etiquetado preincrustante de alto contraste y alta eficiencia, compatible con la fijación tradicional de glutaraldehído que proporciona la mejor preservación estructural de la cromatina para el procesamiento de muestras a temperatura ambiente. Otra ventaja del etiquetado de preincrustación es la posibilidad de preseleccionar celdas de interés para el seccionamiento. Esto es especialmente importante para el análisis de poblaciones celulares heterogéneas, así como la compatibilidad con los enfoques de tomografía electrónica para el análisis 3D de alta resolución de la organización de la cromatina en los sitios de replicación, y el análisis del reordenamiento de la cromatina post-replicativa y la segregación de cromátidas hermanas en la interfase.
Introduction
La replicación del ADN es un proceso biológico básico requerido para la copia fiel y la transmisión de la información genética durante la división celular. En eucariotas superiores, la replicación del ADN está sometida a una estrecha regulación espacio-temporal, que se manifiesta en la activación secuencial de los orígenes de replicación1. Los orígenes de replicación vecinos que se activan sincrónicamente forman grupos de replicons2. A nivel de microscopía óptica, los sitios de replicación continua del ADN se detectan como focos de replicación de varios números y tamaños. Los focos de replicación muestran patrones específicos de distribución espacial dentro del núcleo celular dependiendo del momento de replicación del ADN marcado 3,4, que, a su vez, está estrechamente correlacionado con su actividad genética. Gracias a una secuencia bien definida de replicación de ADN, estrictamente ordenada en el espacio y el tiempo, el etiquetado replicativo es un método poderoso de etiquetado preciso de ADN no solo para el estudio del proceso de replicación per se, sino también para discriminar una subfracción específica de ADN con actividad de transcripción definida y nivel de compactación. La visualización de la cromatina replicante se realiza generalmente a través de la detección de los principales componentes proteicos de la maquinaria de replicación del ADN (ya sea por inmunotinción o por expresión de etiquetas de proteínas fluorescentes 5,6) o mediante la incorporación de precursores de síntesis de ADN modificados 7,8,9,10 . De estos, solo los métodos basados en la incorporación de nucleótidos modificados en el ADN recién replicado permiten la captura de cambios conformacionales en la cromatina durante la replicación, y rastrean el comportamiento de los dominios replicativos después de que se completa su replicación.
En los eucariotas superiores, el empaquetamiento del ADN en cromatina agrega otro nivel de complejidad a la regulación de las funciones genéticas básicas (transcripción, replicación, reparación, etc.). El plegamiento de la cromatina afecta la accesibilidad del ADN a los factores trans reguladores y a los cambios conformacionales del ADN (desenrollamiento de doble hélice) necesarios para la síntesis de la plantilla. Por lo tanto, generalmente se acepta que los procesos sintéticos dependientes del ADN en el núcleo celular requieren una transición estructural de la cromatina de su estado condensado y represivo a una conformación más accesible y abierta. Citológicamente, estos dos estados de cromatina se definen como heterocromatina y eucromatina. Sin embargo, todavía no hay consenso sobre el modo de plegamiento del ADN en el núcleo. Las hipótesis van desde un modelo11 de "fusión polimérica", donde la fibra nucleosómica se comporta como un polímero aleatorio para el cual la densidad de empaquetamiento está controlada por mecanismos de separación de fases, hasta modelos de plegamiento jerárquico que postulan la formación secuencial de estructuras similares a fibras de cromatina de espesor creciente12,13. Los modelos de plegamiento jerárquico recientemente obtuvieron apoyo de enfoques moleculares basados en el análisis de contactos ADN-ADN in situ (captura de conformación cromosómica, 3C), demostrando la existencia de la jerarquía de dominios estructurales de cromatina14. Es importante tener en cuenta que las unidades de replicación se correlacionan muy bien con estos dominios de cromatina15. La principal crítica de estos modelos se basa en la posible agregación artificial de cromatina causada por procedimientos de preparación de muestras, como la permeabilización de las membranas celulares y la eliminación de componentes que no son de cromatina, con el fin de mejorar el contraste de cromatina para estudios ultraestructurales al tiempo que mejora la accesibilidad de la cromatina para varias sondas (por ejemplo, anticuerpos). Los recientes avances técnicos en la tinción selectiva de ADN para microscopía electrónica mediante fotooxidación mediada por fluoróforos de unión al ADN de diaminobenzidina (ChromEMT6) han permitido la eliminación de este obstáculo. Sin embargo, las mismas consideraciones son válidas para la visualización de microscopía electrónica de la replicación del ADN17,18. Aquí describimos una técnica que permite el mapeo ultraestructural simultáneo de alta resolución del ADN recién sintetizado y la cromatina total en células intactas reticuladas por aldehído. La técnica combina la detección de ADN marcado con EdU por Click-chemistry con sondas biotiniladas y streptavidin-Nanogold, y ChromEMT.
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Protocol
El protocolo está optimizado para células adherentes y se probó en líneas celulares HeLa, HT1080 y CHO.
1. Etiquetado y fijación celular
- Celdas de placa en fundas limpias con ácido en una placa de Petri de 3 cm. Cultivar las células en los medios recomendados para la línea celular que se está utilizando al 70% de confluencia.
- Añadir EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) de 10 mM de stock a 10 μM de concentración final y colocar las células en la incubadora durante 10 min o más (dependiendo del objetivo del experimento). Para pulsos más cortos (hasta 2 min), prepare una placa de Petri con medios de cultivo frescos precalentados complementados con 10 μM EdU, y transfiera hojas de cubierta en ella, en lugar de agregar EdU a las células directamente.
NOTA: Todos los pasos posteriores se llevan a cabo a temperatura ambiente si no se indica lo contrario. - Fijar las células marcadas con glutaraldehído al 2,5%, recién hecho diluyendo el caldo al 25% en tampón de cacodilato de 100 mM, durante 1 h.
NOTA: Los pasos de detección de EdU posteriores son sensibles al tiempo de fijación. Los tiempos de fijación más largos pueden afectar negativamente al etiquetado EdU, causando una menor relación señal-ruido. - Elimine el glutaraldehído lavando las muestras con PBS suplementado con 5 mM MgCl2 (PBS* a partir de entonces). Lavar tres veces con una incubación de 10 minutos para cada lavado.
- Permeabilizar las membranas plasmáticas con 1% de Tritón X-100 en PBS* (PBS*T a partir de entonces). Lavar dos veces con una incubación de 5 minutos para cada lavado.
- Lave ampliamente la muestra con PBS*. Realiza cinco cambios e incuba durante 5 min en cada cambio.
- Apague los grupos de aldehído libre de residuos con 20 mM de glicina en PBS*, dos veces durante 10 min cada una.
- Bloquee las muestras en BSA al 1% en PBS* durante 30 min.
2. Reacción de clic
NOTA: Este procedimiento se modifica a partir de un protocolo19 publicado anteriormente.
- Inmediatamente antes de su uso, prepare la mezcla Click-reaction para la detección de EdU: en un tubo de microcentrífuga, mezcle 430 μL de 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 20 μL de 100 mM CuSO4, 1.2 μL de biotina-azida (10 mM en DMSO) y 50 μL de ácido ascórbico de 0.5 M. Para el control de calidad del etiquetado replicativo y el procedimiento Click-procedure a nivel de microscopía fluorescente, la biotina-azida puede ser reemplazada por AlexaFluor 488-azide.
NOTA: El orden de adición de componentes en la reacción anterior es importante. - Realice una reacción de clic en una cámara húmeda para minimizar la evaporación y los cambios de concentración en el cóctel de reacción. Prepare la cámara húmeda colocando una hoja húmeda de papel de filtro en el fondo de la placa de Petri y cubriéndola con una película de parafina. Coloque las cubiertas en la superficie de la película con las células hacia arriba y coloque una capa de 50-100 μL del cóctel de reacción sobre la cubierta. La reacción dura 30 min a temperatura ambiente.
- Detenga la reacción lavando la muestra en Tritón X-100 al 0,1% en PBS* (PBS*T), cinco veces durante 5 min cada una.
- Bloquee en BSA al 1% en PBS* T durante 30 min a temperatura ambiente.
- Prepare la solución de estreptavidina-nanogold con PBS*T que contenga 1% de BSA. Incubar la muestra con estreptavidina, conjugada con partículas nanogold de 1,4 nm (nanosondas) en BSA + PBS*T al 1% durante la noche a +4 °C en la cámara húmeda recién preparada.
- Detenga la reacción y lave la muestra en PBS*T, cinco veces durante 10 minutos cada una.
- Estabilizar el complejo de estreptavidina de biotina mediante la postfijación en glutaraldehído al 1% en PBS* durante 30 min.
- Retire el glutaraldehído mediante un lavado intenso con agua desionizada y lave la muestra en PBS*, cinco veces durante 20 minutos cada una.
- Apague los grupos de aldehídos libres con 1 mg/ml de NaBH4 recién preparado en agua, dos veces durante 10 minutos cada uno. Durante la incubación, se forman burbujas de H2 que pueden levantar las hojas de cubierta. Empujarlos con cuidado hacia abajo con las pinzas.
- Lavar con agua desionizada cinco veces durante 5 min cada una.
NOTA: Para el control de calidad en la etapa de etiquetado, es recomendable realizar el etiquetado de control con estreptavidina marcada fluorescentemente (Figura 2). Esto proporcionaría una estimación de la intensidad del etiquetado y el nivel de fondo antes de cambiar a pasos posteriores tediosos y propensos a artefactos.
3. Amplificación de Ag
NOTA: Este procedimiento se modifica a partir de Gilerovitch et al., 1995 (ver 20,21).
- Resuspendir 50 g de polvo de acacia en 100 ml de agua desionizada. Disolver durante 3 días, desgasificar y filtrar a través de cuatro capas de gasa. Almacenar congelado en alícuotas de 5 ml en tubos de 50 ml. Descongelar inmediatamente antes de su uso.
- Añadir 2 mL de 1 M MES (pH = 6,1) a 5 mL de alícuota descongelada de solución de polvo de acacia para hacer 7 mL de 0,28 M MES (pH = 6,1) en solución de polvo de acacia. Mezclar meciendo lentamente el tubo durante 30 min. Envuelva el tubo con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
- Simultáneamente con el paso 3.2., lave las fundas con tampón de lavado (50 mM MES, pH = 5.8, sacarosa de 200 mM), tres veces durante 10 min cada una.
- Prepare la solución fresca de galato de N-propilo (NPG). En un tubo de 15 ml, disuelva 10 mg de NPG en 250 μL de etanol al 96% y ajuste a 5 ml con agua desionizada.
- Ponga 36 mg de lactato de plata en un tubo de 15 ml envuelto en papel de aluminio.
- Después del paso 3.2. se completa, agregue 1.5 ml de solución de NPG a la mezcla de polvo de acacia y roca durante otros 3 minutos.
NOTA: Todos los pasos posteriores se llevan a cabo en un cuarto oscuro. Use luz segura no actínica (amarilla o roja). - Equilibre la muestra con el tampón de lavado y proceda a la habitación oscura. Simultáneamente, agregue 5 ml de agua desionizada al lactato de plata y disuelva agitando vigorosamente durante 1-2 min.
- Agregue 1.5 ml de solución de lactato de plata a la mezcla de polvo de acacia, mece lentamente durante 1 min. Evite la formación de burbujas, ya que el oxígeno en la mezcla ralentizará la reacción.
- Escurrir la solución del plato con fundas y verter 3 ml de mezcla de polvo de lactato de plata y acacia en las células. Mece el plato varias veces e incuba durante 2-5 min. El tiempo de incubación depende del lote de polvo de acacia y la temperatura. Esto debería definirse experimentalmente.
NOTA: Un tiempo de incubación más largo puede resultar en una unión de plata inespecífica. - Para detener la reacción, escurra la mezcla de reacción y lave el plato extensamente con tres a cinco cambios de agua desionizada, seguidos de tres cambios más durante 5 minutos cada uno.
- Revise la tinción bajo el microscopio de campo brillante. Una buena tinción debe ser de color marrón claro a oscuro con un fondo amarillento muy tenue.
NOTA: Si la tinción no se está desarrollando, es posible repetir inmediatamente con la mezcla ya hecha (la mezcla está activa durante aproximadamente 15 minutos si se mantiene en la oscuridad). Sin embargo, la tinción en este caso podría desarrollarse demasiado rápido.
4. Tonificación del oro
NOTA: Para proteger las nanopartículas de plata de la disolución por oxidación de OsO4 en los procedimientos posteriores, se utiliza una impregnación con oro en este paso (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Enjuague las fundas con agua desionizada.
- Para proteger las nanopartículas de plata de la disolución por oxidación de OsO4 , incubar las muestras en ácido tetracloroáurico al 0,05% durante 2 min en la oscuridad.
- Lavar bien con agua desionizada durante 10 min.
NOTA: En esta etapa se agrega contraste adicional al material que contiene ADN. El color de la muestra debe cambiar de marrón a negro.
5. ChromEM
NOTA: Este protocolo fue modificado de Ou et al., 201716.
- Incubar los coverslips y saturar las muestras en 10 μM DRAQ5 en PBS durante 10 min en la oscuridad.
- Preparar una solución de tetraclorhidrato de diaminobencidina (DAB) al 0,2% en Tris o PBS de 50 mM:
disuelva DAB en el 90% del volumen final agitando vigorosamente en la oscuridad, luego ajuste el pH a 7.0-7.4 con NaOH. Ajuste el volumen al 100% y filtre a través de un filtro de 0.22 μM, guárdelo envuelto en papel de aluminio. - Añadir solución DAB a las células (2 ml por placa de Petri de 3 cm) e incubar durante 1 min.
- Mueva el cubrehojas en la placa de Petri con fondo de vidrio y colóquelo en la etapa de un microscopio invertido. Irradiar la muestra (varios campos de visión) en un microscopio invertido con fuente de luz de halogenuros metálicos y conjunto de filtros Cy5 (640 nm, 1 W/cm2 en el plano focal) a través de la lente Plan Apo λ 40х (NA = 0.95) durante 10 min.
NOTA: Una indicación de fotoconversión DAB exitosa es el fotoblanqueo DRAQ5 completo y la formación de precipitados DAB oscuros en núcleos irradiados. Sin embargo, esto último no siempre es evidente sobre la intensa señal EdU-plata-oro (especialmente cuando se utilizan pulsos EdU extendidos). - Lavar con agua desionizada tres veces durante 5 min cada una.
6. Deshidratación e incrustación de resina epoxi
- En un tubo de microcentrífuga, prepare una solución de tetraóxido de osmio parcialmente reducida mezclando una solución acuosa al 2% de K4Fe(CN)6 con una cantidad igual de solución acuosa al 2% de OsO4, para obtener una concentración final del 1% de ambos componentes. Incubar los cubrehojas en OsO4 reducido durante 1 h y lavar en agua desionizada tres veces durante 5 min cada una.
NOTA: En esta etapa, el compuesto de osmio reducido reacciona con las deposiciones de DAB y aumenta el contraste del ADN.
PRECAUCIÓN: El osmio es tóxico, trabaje bajo una campana de humos y maneje los desechos de acuerdo con las normas de seguridad locales. - Deshidratar las muestras en una serie de soluciones de etanol graduadas en porcentajes crecientes: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
- Para la infiltración y la incrustación, utilice la fórmula de resina con la relación volumétrica del componente de la siguiente manera: monómero de resina epoxi: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0.23 (p / w). Esta fórmula es miscible con etanol.
- Incubar el coverslip en la mezcla etanol-resina (3 partes 100% EtOH:1 parte resina epoxi) durante 30 min.
- Incubar el coverslip en la mezcla etanol-resina (1 parte 100% EtOH:1 parte resina epoxi) durante 2 h.
- Incubar el coverslip en la mezcla de etanol-resina (1 parte 100% EtOH:3 partes resina epoxi) durante la noche.
- Reemplace la mezcla de etanol y resina con resina pura recién preparada. Incubar en mezcla de resina pura durante 8 h. Abra el plato para dejar que los restos de etanol se evaporen.
- Transfiera los recubiertos a un nuevo plato con resina pura e incube durante 2 h a 37-42 °C.
- Llene un molde de silicio con resina recién preparada. Coloque las fundas con las células hacia abajo en el molde de silicio apropiado lleno de resina epoxi. Curar la resina durante 24 h a 37 °C, luego a 60 °C durante al menos 2 días.
PRECAUCIÓN: Los componentes de la mezcla de resina epoxi son carcinógenos potenciales. Use guantes y trabaje debajo de la campana de humos.
- Retire la losa de resina del molde, limpie la superficie de la funda con el bisturí o la cuchilla de afeitar. Para quitar el coverslip, deje caer el coverslip en nitrógeno líquido y luego transfiera la losa al agua hirviendo. Repetir si es necesario.
- Localice el área irradiada debajo de un estereomicroscopio y córtela de la losa con una sierra o cualquier otro instrumento adecuado. Precaliente la losa a 70 °C en una placa caliente, si es necesario.
- Sujete el recorte en un soporte de muestra ultramicrotómico para el recorte final del bloque. Usando la maquinilla de afeitar, prepare la muestra en forma de pirámide. Monte el soporte con pirámide en el ultramicrotomo e instale el cuchillo.
- Recorte el bloque para que se incluyan las celdas irradiadas que llevan la etiqueta EdU. Preparar una sección semifina (250 nm de espesor) adecuada para la tomografía electrónica.
NOTA: El grosor de la sección se puede ajustar para adaptarse a los requisitos experimentales.
- Recorte el bloque para que se incluyan las celdas irradiadas que llevan la etiqueta EdU. Preparar una sección semifina (250 nm de espesor) adecuada para la tomografía electrónica.
- Separe la sección del filo de la navaja y colóquela en las rejillas de una sola ranura. Para la tomografía electrónica, las secciones de 250 nm se recogen en rejillas de una sola ranura de 1 mm y, después del secado, estas secciones se pueden recubrir con carbono desde ambos lados. No es necesario ningún contraste adicional.
NOTA: Dado que las secciones ya contienen partículas Au-Ag de alto contraste, no hay necesidad de agregar partículas de oro fiduciario a la superficie de la sección. - Examine las rejillas en un microscopio electrónico de transmisión a bajo aumento (aproximadamente 600x) para localizar las células con patrones de replicación apropiados.
NOTA: Este protocolo genera una densidad de etiquetado lo suficientemente alta como para una fácil detección de focos de replicación incluso con un aumento bajo. Es recomendable primero crear un mapa de la sección para la posterior navegación y la colección de proyecciones angulares para tomografía. Cambie a un aumento más alto y tome imágenes de alta resolución.
7. Tomografía electrónica
- Inserte la rejilla en el microscopio electrónico de transmisión con un soporte de alta inclinación. Cargue la muestra en el microscopio electrónico y localice la región de interés.
- Alinee el microscopio en modo EFTEM en modo de iluminación casi paralela. Ajuste el filtro de energía con una ranura de selección de energía de 20 eV colocada en el pico de pérdida cero.
- Pre-irradiar el área de adquisición de la tomografía a una tasa de dosis de 40 e/Å2/s durante al menos 1,5-2 min, lo que corresponde a la dosis total de al menos 3000 e/Å2.
- Ajuste la altura eucéntrica con la tarea automática en SerialEM. Compruebe la tarea de enfoque automático para asegurarse de que funciona correctamente en ángulo de inclinación cero y valor de desenfoque objetivo de -0,8 mkm.
- Incline el soporte de muestra a -60° con la tarea Walk-Up.
- Configure la adquisición de la tomografía de -60 a +60° con el paso 2.0°. La exposición debe ajustarse en función del ángulo de inclinación para mantener la intensidad media de la cámara. Limite el cambio de imagen en caso de que cause un cambio de energía y, por lo tanto, una desalineación de la ranura. Los datos de la tomografía deben guardarse como archivo .mrc.
- Importe el archivo .mrc en el software IMOD para la reconstrucción de tomografías. Elimine los valores de píxeles atípicos debido a los rayos X.
- Alinee la serie de inclinación. Realice una correlación cruzada inicial, luego marque manualmente 10-12 partículas de oro como fiduciales. Realice un seguimiento del modelo fiduciario e inspeccione que cada fiduciario se rastrea correctamente a través de la serie de inclinación. Cree tomogramas de muestra (cortes) y marque manualmente los bordes de la sección delgada para evitar la posible inclinación de la densidad reconstruida dentro del volumen. El error residual medio para la alineación fina fue inferior a 1,2 pix.
- Reconstruya el tomograma con un algoritmo de retroproyección filtrada y luego recorte la salida para que se ajuste a la región de interés en el volumen final.
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Representative Results
Los focos de replicación en los núcleos celulares de mamíferos muestran patrones distintos de distribución dentro del núcleo dependiendo de la progresión de la fase S. Estos patrones se correlacionan con la actividad transcripcional de los loci que se replican. Dado que el método presentado aquí utiliza un procedimiento de fijación bastante fuerte, es bastante sencillo utilizar el etiquetado de pulsos replicativos para la detección específica de loci de cromatina en varios estados transcripcionales, incluso en condiciones que ofrecen la mejor preservación estructural de la cromatina obtenida por fijación química a temperatura ambiente.
Los pasos de control de calidad están destinados a garantizar la finalización exitosa de los procedimientos clave en este protocolo. Inicialmente, el etiquetado exitoso de EdU debe confirmarse mediante la reacción Click-reaction con azida marcada fluorescentemente, demostrando patrones de replicación típicos si se utiliza una población celular heterogénea (Figura 2). El segundo paso importante es el etiquetado de estreptavidina, que puede estar fuertemente influenciado por la fijación de glutaraldehído. Para la evaluación de la eficiencia de unión a la estreptavidina, use la estreptavidina conjugada con AlexaFluor-488 en las mismas condiciones que la estreptavidina-Nanogold (Figura 3). En este punto, se esperan algunos antecedentes principalmente debido a la autofluorescencia de glutaraldehído, así como al lavado incompleto de estreptavidina. Si la relación señal-ruido es inaceptable, intente aumentar el número y la duración de los pasos de lavado en el paso 2.6. Alternativamente, agregue el enfriamiento de glutaraldehído con NaBH4 (pasos 2.9-2.10) después del paso 1.5.
El procedimiento de mejora de plata a menudo produce resultados inconsistentes y requiere optimización. Primero, la velocidad de reacción varía dramáticamente dependiendo del lote de solución de polvo de acacia. La viscosidad de la solución es inversamente proporcional al tiempo de desarrollo de la tinción de plata. Es una buena idea tener varias alícuotas del mismo lote y probarlas en las muestras de control para determinar el momento óptimo de reacción. Como la temperatura de los reactivos y el medio ambiente también tienen un impacto significativo en la velocidad de reacción, intente realizar la reacción exactamente a la misma temperatura. Si procesa más de tres muestras simultáneamente, es conveniente iniciar la reacción a intervalos de 30 segundos para tener tiempo suficiente para los pasos de lavado.
Un buen resultado del procedimiento de mejora de plata es la tinción de color marrón oscuro de algunos (no todos) los núcleos con tinción citoplasmática amarillenta muy débil (Figura 4). Esto significa que el tamaño medio de las partículas de plata es de aproximadamente 20 nm, lo que es adecuado para una fácil detección de etiquetas en un amplio rango de aumento de TEM sobre la contratinción de cromatina. Para los experimentos de tomografía, el tamaño de las partículas debe reducirse a aproximadamente 10 nm acortando el tiempo de reacción. El color en este caso debe ser marrón claro o rojizo. El color de la tinción de plata debe verificarse antes de la tonificación del oro.
La fotoconversión y osmificación DAB se realiza después de la tonificación del oro para proteger las conchas de plata de la disolución. En caso de impregnación insuficiente de oro, las nanopartículas de plata se erosionan y adquieren una forma irregular, pero aún permanecen visibles bajo TEM. La calidad de la fotoconversión DAB se monitorea primero mediante blanqueamiento DRAQ5 (en modo de fluorescencia), luego en modo de campo brillante, cuando los núcleos celulares en un campo irradiado se vuelven de color marrón oscuro (Figura 5). La intensidad de tinción DAB no debe ser muy alta para que la tinción de Ag-Au permanezca bien detectada para permitir la selección de las células con el tiempo de replicación requerido para la seccionamiento.
Las secciones ultrafinas o semidelgadas no requieren tinción adicional y se pueden ver directamente bajo TEM. El etiquetado apropiado generalmente da como resultado grupos bien definidos de nanopartículas de Ag que demarcan los sitios de replicación (Figura 6), mientras que el etiquetado de fondo se limita a unas pocas nanopartículas por micrómetro cuadrado. Las secciones semidelgadas están listas para la tomografía y no requieren la adición de nanopartículas de oro a la superficie de la sección, ya que las nanopartículas de Ag presentes en una sección se pueden usar como marcas fiduciales (Figura 7). En esta figura, se muestra el efecto del tiempo de etiquetado prolongado: los focos de replicación individuales se fusionan en estructuras similares a fibras, delineando dominios de cromatina de orden superior.
Figura 1. Descripción general del método. Las células cultivadas en hojas de cubierta se etiquetan con EdU, se fijan con glutaraldehído al 2,5%, se permeabilizan y la reacción Click se realiza con azida biotinilada. Alternativamente, las azidas marcadas fluorescentemente se utilizan en la observación microscópica ligera. Los sitios de incorporación de biotina se etiquetan con Nanogold-streptavidin (o estreptavidina marcada fluorescentemente como control), plata mejorada y después de la tonificación de oro sometida a fotoconversión y osmificación DAB mediada por DRAQ5. Las muestras se incrustan en resina epoxi, se seccionan, se examinan en TEM y se someten a tomografía electrónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Patrones de replicación en células de mamíferos revelados por el etiquetado EdU y la reacción click -reaction (verde). La progresión de la fase S de la fase S temprana a la tardía (de izquierda a derecha) se manifiesta por un cambio ordenado en los patrones de replicación: A, B - fase S temprana, C - fase S media, D, E - fase S tardía. El ADN se tiñe con DAPI (rojo). Barra de escala = 10 um. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Patrones de replicación en células de mamíferos revelados por el etiquetado EdU y la tinción de dos pasos de Click-biotina y estreptavidina-AlexaFluor 488 después de la fijación de glutaraldehído. La muestra de control etiquetada con estreptavidina-AlexaFluor 488 muestra una eficiencia de etiquetado óptima y una relación S / N después de la fijación de glutaraldehído. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imagen representativa de las células después del procedimiento de mejora de la plata (Paso 3). Varios patrones replicativos (fase S temprana, flechas; fase S media, punta de flecha; flechas dobles tardías) son fácilmente visibles en un modo de microscopía de luz de campo brillante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Un resultado típico de la fotoconversión DAB mediada por DRAQ5. (A) Tinción DRAQ5 (el círculo discontinuo indica el área irradiada). Tenga en cuenta el fuerte blanqueamiento DRAQ5 dentro del círculo. (B) La misma área vista en el microscopio de luz de campo brillante. Observe una precipitación DAB más fuerte en los núcleos en el área irradiada. Recuadro: las flechas indican núcleos de fase S temprana donde los patrones de replicación marcados con Ag-Au todavía son fácilmente detectables en el fondo de la tinción DAB fotooxidante DRAQ5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Focos de replicación en núcleos de células de mamíferos revelados por el etiquetado de EdU y tinción de dos pasos de Click-biotina y estreptavidina-Nanogold después de la fijación de glutaraldehído. Secciones delgadas de 90 nm de una célula en fase S que muestran grupos de nanopartículas de Ag-Au en focos de replicación (A, círculos rojos). El nivel de fondo se puede apreciar en una celda sin fase S (B). Las puntas de flecha indican fibras de cromatina de varias escalas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Proyección de inclinación de 0° de sección de 250 nm. (A) y sección tomográfica virtual. (B) de un núcleo celular marcado con EdU durante 2 h. Vea focos de replicación individuales fusionados en estructuras similares a fibras (puntas de flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método descrito aquí tiene varias ventajas sobre los protocolos publicados anteriormente. En primer lugar, el uso de Click-chemistry para etiquetar el ADN replicado elimina la necesidad de un requisito previo de desnaturalización del ADN para la detección de BrdU con anticuerpos, preservando así mejor la ultraestructura de la cromatina.
En segundo lugar, la utilización de la biotina como ligando secundario que se genera después de la fijación del glutaraldehído y el enfriamiento adecuado de los grupos aldehído no unidos minimiza la modificación química del objetivo, mejorando así la eficiencia del etiquetado al tiempo que reduce el fondo debido a la biotina endógena. La biotina-estreptavidina también agrega versatilidad, ya que el uso de estreptavidina marcada con fluorescencia proporciona un fácil control de calidad en la etapa muy temprana del procedimiento. El protocolo se puede simplificar aún más mediante la introducción de estreptavidina marcada con FluoroNanogold, sin embargo, en nuestras manos estos reactivos dieron un fondo algo más alto en comparación con Nanogold-streptavidin, tal vez debido al mayor tamaño de las sondas.
En tercer lugar, una combinación de pequeñas sondas, siendo la estreptavidina-Nanogold el componente más grande de aproximadamente 5 nm, proporciona una muy buena penetración incluso en las células reticuladas con glutaraldehído. Esto hace que la técnica sea adecuada para el etiquetado previo a la incrustación de células óptimamente conservadas ultraestructuralmente y sea fácilmente compatible con varias técnicas de microscopía electrónica 3D, incluida la reconstrucción de sección en serie, la tomografía de matriz, la tomografía electrónica, la imagen facial de bloque serie y FIB-SEM.
La mejora de la plata es el paso más crítico, que requiere un control preciso de la difusión del reactivo y los pasos de lavado, que es más fácil de realizar con células adherentes. Por otro lado, dado que la fuerte reticulación con glutaraldehído también puede afectar la mejora de la plata, las condiciones de fijación deben ajustarse para equilibrar la preservación de la estructura de cromatina y la eficiencia de mejora de la plata. Por esta razón, las técnicas de criofijación/criosustitución, que requieren una postfijación extendida y mal controlada, aunque permiten una preservación aún mejor de la estructura, podrían no ser totalmente compatibles con la estrategia de etiquetado propuesta23. La técnica se puede mejorar aún más mediante el uso de la amplificación de Au en lugar de la mejora de plata24. Esta modificación permite saltarse el paso de tonificación dorada, sin embargo, en nuestras manos, da un fondo considerablemente más alto.
Finalmente, el etiquetado de preincrustación permite la preselección de células objetivo para ChromEM y la seccionamiento en función del patrón de replicación detectable bajo microscopio de campo brillante o fluorescente. Además, el método se puede extender fácilmente a CLEM, incluidas varias técnicas de superresolución. Esto abre nuevos horizontes en los estudios de la estructura y dinámica de orden superior de la cromatina en diversos estados fisiológicos. El enfoque que describimos aquí se puede utilizar para estudios de organización de cromatina en sitios de replicación, para el análisis del reordenamiento post-replicativo de la cromatina, incluidas imágenes de alta resolución de la segregación de cromátidas en interfase, y para el etiquetado replicativo de grandes dominios cromosómicos y estudios de plegamiento de cromatina de orden superior de fracciones específicas del genoma (eucromatina o heterocromatina, etiquetados según el tiempo de replicación). Este tipo de técnicas de imagen también son importantes como punto de referencia para los datos generados por enfoques alternativos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por RSF (subvención #17-15-01290) y RFBR (subvención #19-015-00273). Los autores agradecen el programa de desarrollo de la Universidad Estatal lomonosov de Moscú (PNR 5.13) y el Centro de Excelencia Nikon en imágenes correlativas en el Instituto Belozersky de Biología Físico-Química por el acceso a la instrumentación de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
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