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Biology

इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल रूप से संरक्षित क्रोमैटिन में इमेजिंग रेप्लिकेटिव डोमेन

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/62803
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,3, 1,2, 1, 1, 1, 2, 4, 1,2,5
1Belozersky Institute of Physico-chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, 3Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 4National Research Center, Kurchatov Institute, 5V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology, and Perinatology
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल संरचनात्मक रूप से संरक्षित क्रोमैटिन इन सीटू में प्रतिकृति साइटों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मैपिंग के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है जो ईडीयू-स्ट्रेप्टाविडिन-नैनोगोल्ड लेबलिंग और क्रोमेएमटी को पूर्व-एम्बेडिंग के संयोजन को नियोजित करता है।

Abstract

सेल नाभिक में डीएनए तह के सिद्धांत और इसके गतिशील परिवर्तन जो बुनियादी आनुवंशिक कार्यों (प्रतिलेखन, प्रतिकृति, अलगाव, आदि) की पूर्ति के दौरान होते हैं, आंशिक रूप से संरचनात्मक रूप से संरक्षित नाभिक में विशिष्ट क्रोमैटिन लोकी के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की कमी के कारण खराब रूप से समझे जाते हैं। यहां हम सीटू में मोनोलेयर सेल संस्कृति में प्रतिकृति डोमेन के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, नैनोगोल्ड कणों के एजी-प्रवर्धन और क्रोमैटिन के क्रोमईएम स्टेनिंग के साथ बाद के लेबल का पता लगाने के साथ नए संश्लेषित डीएनए के ईडीयू लेबलिंग के संयोजन से। यह प्रोटोकॉल उच्च-विपरीत, उच्च-दक्षता पूर्व-एम्बेडिंग लेबलिंग के लिए अनुमति देता है, जो पारंपरिक ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण के साथ संगत है जो कमरे के तापमान के नमूने के प्रसंस्करण के लिए क्रोमैटिन का सबसे अच्छा संरचनात्मक संरक्षण प्रदान करता है। पूर्व एम्बेडिंग लेबलिंग का एक और लाभ सेक्शनिंग के लिए ब्याज की कोशिकाओं का पूर्व-चयन करने की संभावना है। यह विशेष रूप से विषम सेल आबादी के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही साथ प्रतिकृति की साइटों पर क्रोमैटिन संगठन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी दृष्टिकोण के साथ संगतता, और इंटरफेज में पोस्ट-रेप्लिकेटिव क्रोमैटिन पुनर्व्यवस्था और बहन क्रोमैटिड अलगाव का विश्लेषण।

Introduction

डीएनए प्रतिकृति एक बुनियादी जैविक प्रक्रिया है जो सेल विभाजन के दौरान आनुवंशिक जानकारी की वफादार प्रतिलिपि और संचरण के लिए आवश्यक है। उच्च यूकेरियोट्स में, डीएनए प्रतिकृति को तंग स्पैटियो-टेम्पोरल विनियमन के अधीन किया जाता है, जो प्रतिकृति मूल1 के अनुक्रमिक सक्रियण में प्रकट होता है। पड़ोसी प्रतिकृति मूल फायरिंग तुल्यकालिक रूप से replicons2 के क्लस्टर फार्म। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के स्तर पर, चल रहे डीएनए प्रतिकृति की साइटों को विभिन्न संख्या और आकार के प्रतिकृति फोकी के रूप में पाया जाता है। प्रतिकृति फोकी लेबल किए गए डीएनए 3,4 के प्रतिकृति समय के आधार पर सेल नाभिक के भीतर स्थानिक वितरण के विशिष्ट पैटर्न प्रदर्शित करती है, जो बदले में, इसकी जीन गतिविधि के साथ कसकर सहसंबद्ध है। डीएनए प्रतिकृति के अच्छी तरह से परिभाषित अनुक्रम के लिए धन्यवाद, अंतरिक्ष और समय में सख्ती से आदेश दिया गया है, प्रतिकृति लेबलिंग सटीक डीएनए लेबलिंग का एक शक्तिशाली तरीका है, न केवल प्रतिकृति प्रक्रिया के अध्ययन के लिए, बल्कि परिभाषित प्रतिलेखन गतिविधि और संघनन स्तर के साथ एक विशिष्ट डीएनए उप-अंश को भेदभाव करने के लिए भी। क्रोमैटिन की प्रतिकृति का विज़ुअलाइज़ेशन आमतौर पर डीएनए प्रतिकृति मशीनरी के प्रमुख प्रोटीन घटकों का पता लगाने के माध्यम से किया जाता है (या तो इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा या फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग 5,6 की अभिव्यक्ति द्वारा) या संशोधित डीएनए संश्लेषण अग्रदूतों 7,8,9,10 के निगमन द्वारा . इनमें से, केवल नए दोहराए गए डीएनए में संशोधित न्यूक्लियोटाइड्स के समावेश के आधार पर विधियां प्रतिकृति के दौरान क्रोमैटिन में संरचनात्मक परिवर्तनों को पकड़ने की अनुमति देती हैं, और उनकी प्रतिकृति पूरी होने के बाद प्रतिकृति डोमेन के व्यवहार का पता लगाती हैं।

उच्च यूकेरियोट्स में, क्रोमैटिन में डीएनए पैकेजिंग बुनियादी आनुवंशिक कार्यों (प्रतिलेखन, प्रतिकृति, क्षतिपूर्ति, आदि) के विनियमन में जटिलता का एक और स्तर जोड़ती है। क्रोमैटिन तह नियामक ट्रांस-कारकों और टेम्पलेट संश्लेषण के लिए आवश्यक डीएनए संरचनात्मक परिवर्तनों (डबल हेलिक्स अनवाइंडिंग) के लिए डीएनए की पहुंच को प्रभावित करता है। इसलिए, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि सेल नाभिक में डीएनए-निर्भर सिंथेटिक प्रक्रियाओं को क्रोमैटिन के संरचनात्मक संक्रमण की आवश्यकता होती है, इसकी संघनित, दमनकारी स्थिति से अधिक सुलभ, खुली संरचना के लिए। साइटोलॉजिकल रूप से, इन दो क्रोमैटिन राज्यों को हेटरोक्रोमैटिन और यूक्रोमैटिन के रूप में परिभाषित किया गया है। हालांकि, नाभिक में डीएनए तह के मोड के बारे में अभी भी कोई आम सहमति नहीं है। परिकल्पनाएं एक "बहुलक पिघल" मॉडल11 से लेकर हैं, जहां न्यूक्लियोसोमल फाइबर एक यादृच्छिक बहुलक के रूप में व्यवहार करता है जिसके लिए पैकिंग घनत्व को चरण पृथक्करण तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है, पदानुक्रमित तह मॉडल क्रोमैटिन फाइबर जैसी संरचनाओं के अनुक्रमिक गठन के बादबढ़ती मोटाई 12,13 के लिए। पदानुक्रमित तह मॉडल ने हाल ही में इन सीटू डीएनए-डीएनए संपर्कों (गुणसूत्र संरचना कैप्चर, 3 सी) के विश्लेषण के आधार पर आणविक दृष्टिकोण से समर्थन प्राप्त किया, जो क्रोमैटिन संरचनात्मक डोमेन14 के पदानुक्रम के अस्तित्व का प्रदर्शन करता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रतिकृति इकाइयां इन क्रोमैटिन डोमेन15 के लिए बहुत अच्छी तरह से सहसंबंधित हैं। इन मॉडलों की प्रमुख आलोचना नमूना तैयारी प्रक्रियाओं के कारण संभावित कृत्रिम क्रोमैटिन एकत्रीकरण पर आधारित है, जैसे कि सेल झिल्ली का permeabilization और गैर-क्रोमैटिन घटकों को हटाने, ताकि अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययनों के लिए क्रोमैटिन कंट्रास्ट में सुधार किया जा सके, जबकि विभिन्न जांचों (जैसे, एंटीबॉडी) के लिए क्रोमैटिन पहुंच में सुधार किया जा सके। डीएनए-बाइंडिंग फ्लोरोफोर-मध्यस्थता फोटो-ऑक्सीकरण द्वारा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए चयनात्मक डीएनए धुंधला में हाल ही में तकनीकी प्रगति डायमिनोबेन्जिडीन (क्रोमेएमटी6) ने इस बाधा के उन्मूलन के लिए अनुमति दी है। हालांकि, डीएनए17,18 की प्रतिकृति के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक ही विचार सच है। यहां हम एक ऐसी तकनीक का वर्णन करते हैं जो बरकरार एल्डिहाइड-क्रॉसलिंक्ड कोशिकाओं में नए संश्लेषित डीएनए और कुल क्रोमैटिन के एक साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रास्ट्रक्चरल मैपिंग की अनुमति देती है। तकनीक Biotinylated जांच और स्ट्रेप्टाविडिन-Nanogold, और क्रोमेएमटी के साथ क्लिक-रसायन विज्ञान द्वारा EdU-लेबल डीएनए का पता लगाने को जोड़ती है।

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Protocol

प्रोटोकॉल अनुयायी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है और HeLa, HT1080, और CHO सेल लाइनों पर परीक्षण किया गया था।

1. सेल लेबलिंग और निर्धारण

  1. एसिड पर प्लेट कोशिकाओं को एक 3 सेमी पेट्री पकवान में कवरlips साफ. 70% confluency के लिए उपयोग की जा रही सेल लाइन के लिए अनुशंसित मीडिया में कोशिकाओं को विकसित करें।
  2. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) को 10 mM स्टॉक से 10 μM अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और कोशिकाओं को 10 मिनट या उससे अधिक समय तक इनक्यूबेटर में रखें (प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर)। छोटी दालों (2 मिनट तक) के लिए, 10 μM EdU के साथ पूरक पूर्व-गर्म ताजा संस्कृति मीडिया के साथ एक पेट्री डिश तैयार करें, और सीधे कोशिकाओं में EdU जोड़ने के बजाय इसमें कवरलिप्स स्थानांतरित करें।
    नोट: सभी बाद के चरणों को कमरे के तापमान पर किया जाता है यदि अन्यथा इंगित नहीं किया जाता है।
  3. 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ लेबल कोशिकाओं को ठीक करें, ताजा 100 mM cacodylate बफर में 25% स्टॉक को पतला करके बनाया गया है, 1 घंटे के लिए।
    नोट:: बाद में EdU का पता लगाने के चरण निर्धारण समय के लिए संवेदनशील हैं। लंबे समय तक निर्धारण समय ईडीयू लेबलिंग को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकता है, जिससे कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात हो सकता है।
  4. 5 mM MgCl2 (PBS * उसके बाद) के साथ पूरक PBS के साथ नमूनों को धोकर glutaraldehyde निकालें। प्रत्येक धोने के लिए 10 मिनट के इनक्यूबेशन के साथ तीन बार धोएं।
  5. PBS * (PBS * T) में 1% Triton X-100 के साथ प्लाज्मा झिल्ली permeabilize. प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट के इनक्यूबेशन के साथ दो बार धोएं।
  6. बड़े पैमाने पर पीबीएस * के साथ नमूने को धोएं। पांच परिवर्तन करें और प्रत्येक परिवर्तन में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. पीबीएस * में 20 एमएम ग्लाइसिन के साथ अवशिष्ट मुक्त एल्डिहाइड समूहों को बुझाएं, प्रत्येक 10 मिनट के लिए दो बार।
  8. 30 मिनट के लिए PBS * में 1% बीएसए में नमूनों को ब्लॉक करें।

2. क्लिक करें प्रतिक्रिया

नोट:: यह कार्यविधि पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल19 से संशोधित किया गया है।

  1. उपयोग से तुरंत पहले, EdU का पता लगाने के लिए क्लिक-प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें: एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में, 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 100 mM CuSO4 के 20 μL, बायोटिन-एज़ाइड के 1.2 μL (DMSO में 10 mM), और 0.5 M ascorbic एसिड के 50 μL का मिश्रण करें। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के स्तर पर प्रतिकृति लेबलिंग और क्लिक-प्रक्रिया के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, बायोटिन-एज़ाइड को एलेक्साफ्लोर 488-एज़ाइड द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    नोट: उपर्युक्त प्रतिक्रिया में घटकों को जोड़ने का क्रम महत्वपूर्ण है।
  2. प्रतिक्रिया कॉकटेल में वाष्पीकरण और एकाग्रता बदलाव को कम करने के लिए एक नम कक्ष में क्लिक-प्रतिक्रिया करें। पेट्री डिश के नीचे फिल्टर पेपर की एक गीली शीट रखकर और इसे पैराफिन फिल्म के साथ कवर करके नम कक्ष तैयार करें। फिल्म की सतह पर कवरलिप्स रखें, जिसमें कोशिकाओं का सामना करना पड़ता है और कवरस्लिप पर प्रतिक्रिया कॉकटेल के 50-100 μL परत होती है। प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर 30 मिनट लेती है।
  3. PBS * (PBS * T) में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 में नमूने को धोकर प्रतिक्रिया को रोकें, प्रत्येक 5 मिनट के लिए पांच बार।
  4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस * टी में 1% बीएसए में ब्लॉक करें।
  5. पीबीएस * टी के साथ स्ट्रेप्टाविडिन-नैनोगोल्ड समाधान तैयार करें जिसमें 1% बीएसए होता है। स्ट्रेप्टाविडिन के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें, 1.4 एनएम नैनोगोल्ड कणों (नैनोप्रोब्स) के साथ संयुग्मित 1% बीएसए + पीबीएस * टी में रात भर में +4 डिग्री सेल्सियस पर नए तैयार किए गए नम कक्ष में।
  6. प्रतिक्रिया बंद करो और पीबीएस * टी में नमूना धोएं, प्रत्येक 10 मिनट के लिए पांच बार।
  7. 30 मिनट के लिए PBS * में 1% glutaraldehyde में postfixing द्वारा biotin streptavidin परिसर को स्थिर करें।
  8. विआयनीकृत पानी के साथ तीव्र धोने से ग्लूटाराल्डिहाइड को हटा दें और पीबीएस * में नमूने को धोएं, प्रत्येक 20 मिनट के लिए पांच बार।
  9. पानी में ताजा तैयार 1 मिलीग्राम / एमएल एनएबीएच4 के साथ मुक्त एल्डिहाइड समूहों को बुझाएं, प्रत्येक 10 मिनट के लिए दो बार। इनक्यूबेशन दौरान, एच2 के बुलबुले बनते हैं जो कवरलिप्स को उठा सकते हैं। चिमटी के साथ उन्हें सावधानी से नीचे धकेलें।
  10. विआयनीकृत पानी से 5 मिनट के लिए पांच बार धोएं।
    नोट:: लेबलिंग चरण पर गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, फ्लोरोसेंटली लेबल स्ट्रेप्टाविडिन (चित्रा 2) के साथ नियंत्रण लेबलिंग करने की सलाह दी जाती है। यह थकाऊ और आर्टिफैक्ट-प्रवण बाद के चरणों पर स्विच करने से पहले लेबलिंग तीव्रता और पृष्ठभूमि स्तर का अनुमान प्रदान करेगा।

3. एजी प्रवर्धन

नोट:: इस कार्यविधि से संशोधित किया गया है Gilerovitch et al., 1995 (देखें 20,21).

  1. विआयनीकृत पानी के 100 मिलीलीटर में बबूल पाउडर के 50 ग्राम को फिर से निलंबित करें। 3 दिनों के लिए भंग, degas, और cheesecloth की चार परतों के माध्यम से फ़िल्टर। 50 mL ट्यूबों में 5 mL ऐलीकोट में जमे हुए स्टोर। उपयोग करने से ठीक पहले पिघलना।
  2. बबूल पाउडर के घोल में 0.28 M MES (pH = 6.1) के 7 mL बनाने के लिए बबूल पाउडर समाधान के पिघले हुए एलीकोट के 5 mL में 1 M MES (pH = 6.1) के 2 mL जोड़ें। 30 मिनट के लिए ट्यूब को धीरे-धीरे हिलाकर मिलाएं। प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी के साथ ट्यूब लपेटें।
  3. साथ ही चरण 3.2., धोने बफर (50 mM MES, pH = 5.8, 200 mM सुक्रोज) के साथ कवरलिप को धोएं, प्रत्येक 10 मिनट के लिए तीन बार।
  4. एन-प्रोपिल गैलेट (एनपीजी) का ताजा समाधान तैयार करें। एक 15 मिली ट्यूब में, 96% इथेनॉल के 250 μL में 10 मिलीग्राम एनपीजी को भंग करें, और विआयनीकृत पानी के साथ 5 मिलीलीटर को समायोजित करें।
  5. एक पन्नी लपेटा 15 मिलीलीटर ट्यूब में चांदी लैक्टेट के 36 मिलीग्राम रखो.
  6. चरण 3.2 के बाद। पूरा हो गया है, बबूल पाउडर मिश्रण और एक और 3 मिनट के लिए रॉक करने के लिए NPG समाधान के 1.5 mL जोड़ें।
    नोट: सभी बाद के चरणों को एक अंधेरे कमरे में किया जाता है। गैर-एक्टिनिक सेफलाइट (पीला या लाल) का उपयोग करें।
  7. धोने बफर के साथ नमूने को संतुलित करें और अंधेरे कमरे में आगे बढ़ें। साथ ही, चांदी के लैक्टेट में 5 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी जोड़ें और 1-2 मिनट के लिए जोरदार हिलाकर भंग करें।
  8. बबूल पाउडर मिश्रण के लिए चांदी लैक्टेट समाधान के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें, 1 मिनट के लिए धीरे-धीरे रॉक। बुलबुला गठन से बचें, क्योंकि मिश्रण में ऑक्सीजन प्रतिक्रिया को धीमा कर देगा।
  9. कवरलिप्स के साथ पकवान से समाधान निकालें और कोशिकाओं पर चांदी लैक्टेट-बबूल पाउडर मिश्रण के 3 मिलीलीटर डालें। पकवान को कई बार रॉक करें और 2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन समय बबूल पाउडर बैच और तापमान पर निर्भर करता है। इसे प्रयोगात्मक रूप से परिभाषित किया जाना चाहिए।
    नोट:: एक लंबे समय इनक्यूबेशन समय अविशिष्ट चांदी बाइंडिंग में परिणाम हो सकता है।
  10. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, प्रतिक्रिया मिश्रण को सूखा दें और विआयनीकृत पानी के तीन से पांच परिवर्तनों के साथ पकवान को बड़े पैमाने पर धोएं, इसके बाद प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन और परिवर्तन होंगे।
  11. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के नीचे धुंधला की जाँच करें। अच्छा धुंधला एक बहुत ही बेहोश पीले रंग की पृष्ठभूमि के साथ गहरे भूरे रंग के लिए हल्का होना चाहिए।
    नोट: यदि धुंधला विकसित नहीं हो रहा है, तो पहले से ही बनाए गए मिश्रण के साथ तुरंत दोहराना संभव है (मिश्रण लगभग 15 मिनट के लिए सक्रिय है यदि अंधेरे में रखा जाता है)। हालांकि, इस मामले में धुंधला बहुत तेजी से विकसित हो सकता है।

4. गोल्ड टोनिंग

नोट: बाद की प्रक्रियाओं में ओएसओ4 ऑक्सीकरण द्वारा विघटन से चांदी के नैनोकणों की रक्षा करने के लिए, इस चरण में सोने के साथ एक गर्भाधान का उपयोग किया जाता है (सवादा, एसाकी, 1994)22।

  1. विआयनीकृत पानी के साथ कवरलिप्स कुल्ला।
  2. ओएसओ4 ऑक्सीकरण द्वारा विघटन से चांदी के नैनोकणों की रक्षा करने के लिए, अंधेरे में 2 मिनट के लिए 0.05% टेट्राक्लोरोरिक एसिड में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  3. 10 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी से अच्छी तरह से धोएं।
    नोट: इस स्तर पर अतिरिक्त कंट्रास्ट सामग्री युक्त डीएनए में जोड़ा जाता है। नमूने का रंग भूरे से काले रंग में बदलना चाहिए।

5. क्रोमेम

नोट:: इस प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था Ou et al., 201716.

  1. coverslips इनक्यूबेट और अंधेरे में 10 मिनट के लिए PBS में 10 μM DRAQ5 में नमूनों को संतृप्त.
  2. 50 mM Tris या PBS में 0.2% diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) समाधान तैयार करें:
    अंधेरे में सख्ती से सरगर्मी करके अंतिम मात्रा के 90% में डीएबी को भंग करें, फिर पीएच को NaOH के साथ 7.0-7.4 पर समायोजित करें। 100% करने के लिए मात्रा को समायोजित करें और एक 0.22 μM फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर, पन्नी में लिपटे स्टोर.
  3. कोशिकाओं के लिए DAB समाधान जोड़ें (2 mL प्रति 3 सेमी पेट्री डिश) और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. ग्लास के नीचे पेट्री-डिश में कवरस्लिप को स्थानांतरित करें और इसे एक उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण में रखें। धातु-हलाइड प्रकाश स्रोत और Cy5 फ़िल्टर सेट (640 nm, 1 W / cm2 फोकल प्लेन पर) के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर नमूना (दृश्य के कई क्षेत्रों) को 10 मिनट के लिए प्लान Apo π 40π (NA = 0.95) लेंस के माध्यम से विकिरणित करें।
    नोट: सफल DAB photoconversion का एक संकेत विकिरणित नाभिक में DRAQ5 photobleaching और अंधेरे DAB अवक्षेप गठन पूरा है। हालांकि, उत्तरार्द्ध हमेशा तीव्र ईडीयू-सिल्वर-गोल्ड सिग्नल पर स्पष्ट नहीं होता है (खासकर जब विस्तारित ईडीयू दालों का उपयोग किया जाता है)।
  5. विआयनीकृत पानी से 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।

6. निर्जलीकरण और epoxy राल एम्बेडिंग

  1. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, दोनों घटकों की 1% अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए, K4Fe (CN)6 के 2% जलीय घोल को OsO4 के 2% जलीय विलयन के साथ मिलाकर आंशिक रूप से कम ऑस्मियम टेट्राऑक्साइड समाधान तैयार करें। 1 घंटे के लिए कम ओएसओ4 में कवरलिप को इनक्यूबेट करें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार विआयनीकृत पानी में धोएं।
    नोट: इस चरण में कम ऑस्मियम यौगिक डीएबी जमाव के साथ प्रतिक्रिया करता है और डीएनए के विपरीत को बढ़ाता है।
    चेतावनी: ऑस्मियम विषाक्त है, एक धुएं के हुड के तहत काम करता है और स्थानीय सुरक्षा नियमों के अनुसार कचरे को संभालता है।
  2. बढ़ते प्रतिशत में वर्गीकृत इथेनॉल समाधान की एक श्रृंखला में नमूनों को निर्जलित करें: 50% EtOH - 3 x 10 मिनट; 70% EtOH - 3 x 10 मिनट, 80% EtOH - 3 x 10 मिनट, 96% EtOH - 3 x 10 मिनट, 100% EtOH - 3 x 10 मिनट।
  3. घुसपैठ और एम्बेडिंग के लिए घटक वॉल्यूमेट्रिक अनुपात के साथ राल सूत्र का उपयोग निम्नानुसार करें: एपॉक्सी राल मोनोमर: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0.23 (w / w)। यह सूत्र इथेनॉल के साथ गलत है।
    1. इथेनॉल-राल मिश्रण (3 भागों 100% EtOH: 1 भाग epoxy राल) में 30 मिनट के लिए coverslip इनक्यूबेट.
    2. इथेनॉल-राल मिश्रण (1 भाग 100% EtOH: 1 भाग epoxy राल) में coverslip incubate 2 ज के लिए.
    3. इथेनॉल-राल मिश्रण (1 भाग 100% EtOH: 3 भागों epoxy राल) में coverslip incubate रात भर.
    4. ताजा तैयार शुद्ध राल के साथ इथेनॉल राल मिश्रण की जगह. 8 ज के लिए शुद्ध राल मिश्रण में इनक्यूबेट. इथेनॉल के अवशेषों को वाष्पित करने के लिए पकवान खोलें।
    5. स्थानांतरण शुद्ध राल के साथ एक नए पकवान में coverslips और 37-42 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए इनक्यूबेट.
    6. ताजा तैयार राल के साथ एक सिलिकॉन मोल्ड भरें। epoxy राल के साथ भरा उचित सिलिकॉन मोल्ड पर नीचे का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ coverslips जगह. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए राल का इलाज करें, फिर कम से कम 2 दिनों के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर।
      सावधानी: epoxy राल मिश्रण के घटकों संभावित carcinogens हैं. दस्ताने पहनें और धुएं के हुड के नीचे काम करें।
  4. मोल्ड से राल स्लैब निकालें, scalpel या रेजर ब्लेड के साथ coverslip की सतह को साफ. कवरस्लिप को हटाने के लिए, कवरस्लिप को तरल नाइट्रोजन में छोड़ दें और फिर स्लैब को उबलते पानी में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो तो दोहराएं।
  5. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत विकिरणित क्षेत्र का पता लगाएं और इसे एक हैकसॉ या किसी अन्य उपयुक्त उपकरण के साथ स्लैब से काट दें। यदि आवश्यक हो, तो एक गर्म प्लेट पर 70 डिग्री सेल्सियस पर स्लैब को पूर्व-गर्म करें।
  6. अंतिम ब्लॉक ट्रिमिंग के लिए एक अल्ट्रामाइक्रोटोम नमूना धारक में कट-आउट को जकड़ना। रेजर का उपयोग करके, पिरामिड के आकार का नमूना तैयार करें। अल्ट्रामाइक्रोटोम पर पिरामिड के साथ धारक माउंट और चाकू स्थापित करें।
    1. ब्लॉक को ट्रिम करें ताकि ईडीयू लेबल वाले विकिरणित कोशिकाओं को शामिल किया जा सके। इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए उपयुक्त एक अर्ध-पतला खंड (250 एनएम मोटाई) तैयार करें।
      नोट:: अनुभाग मोटाई प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है।
  7. चाकू के किनारे से अनुभाग को अलग करें और उन्हें एकल-स्लॉट ग्रिड पर रखें। इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए, 250 एनएम वर्गों को 1 मिमी एकल-स्लॉट ग्रिड पर उठाया जाता है और सूखने के बाद इन वर्गों को दोनों तरफ से कार्बन-लेपित किया जा सकता है। कोई अतिरिक्त विपरीत आवश्यक नहीं है।
    नोट: चूंकि अनुभागों में पहले से ही उच्च कंट्रास्ट Au-Ag कण होते हैं, इसलिए अनुभाग की सतह पर फिड्यूशियल सोने के कणों को जोड़ने की कोई आवश्यकता नहीं है।
  8. उचित प्रतिकृति पैटर्न के साथ कोशिकाओं का पता लगाने के लिए कम आवर्धन (लगभग 600x) पर एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में ग्रिड की जांच करें।
    नोट:: इस प्रोटोकॉल भी कम आवर्धन पर प्रतिकृति foci का आसान पता लगाने के लिए पर्याप्त उच्च लेबलिंग घनत्व उत्पन्न करता है। टोमोग्राफी के लिए बाद के नेविगेशन और कोणीय अनुमानों के संग्रह के लिए अनुभाग का नक्शा बनाने के लिए पहले यह सलाह दी जाती है। उच्च आवर्धन पर स्विच करें और उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां लें।

7. इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी

  1. एक उच्च झुकाव धारक के साथ संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में ग्रिड डालें। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में नमूने को लोड करें और ब्याज के क्षेत्र का पता लगाएं।
  2. माइक्रोस्कोप को EFTEM मोड में निकट समानांतर रोशनी मोड में संरेखित करें। 20 eV ऊर्जा का चयन भट्ठा शून्य हानि चोटी पर रखा के साथ ऊर्जा फिल्टर ट्यून.
  3. कम से कम 1.5-2 मिनट के लिए 40 ई / Å2 / s की खुराक दर पर टोमोग्राफी अधिग्रहण क्षेत्र को पूर्व-विकिरणित करें, जो कम से कम 3000 ई / Å 2 की कुल खुराक से मेल खातीहै।
  4. SerialEM में स्वचालित कार्य के साथ eucentric ऊँचाई समायोजित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए ऑटोफोकस कार्य की जाँच करें कि यह शून्य झुकाव कोण और -0.8 mkm लक्ष्य defocus मान पर सही ढंग से काम कर रहा है।
  5. वॉक-अप कार्य के साथ -60° के लिए नमूना धारक झुकाव।
  6. चरण 2.0° के साथ -60 से +60° तक टोमोग्राफी अधिग्रहण सेट करें. कैमरे पर औसत तीव्रता रखने के लिए एक्सपोज़र को झुकाव कोण पर निर्भर किया जाना चाहिए। यदि यह एक ऊर्जा बदलाव का कारण बनता है और इस प्रकार भट्ठा misalignment स्लिट छवि बदलाव सीमित करें। टोमोग्राफी डेटा को .mrc फ़ाइल के रूप में सहेजा जाना चाहिए।
  7. टोमोग्राफी पुनर्निर्माण के लिए IMOD सॉफ़्टवेयर में .mrc फ़ाइल आयात करें. एक्स-रे के कारण बाहरी पिक्सेल मान ों को निकालें.
  8. झुकाव श्रृंखला संरेखित करें. प्रारंभिक क्रॉस-सहसंबंध का प्रदर्शन करें, फिर मैन्युअल रूप से 10-12 सोने के कणों को फिड्यूशियल के रूप में चिह्नित करें। Fiducial मॉडल को ट्रैक करें और निरीक्षण करें कि हर fiducial झुकाव श्रृंखला के माध्यम से सही ढंग से ट्रैक किया जाता है। नमूना tomograms (स्लाइस) बनाएँ और मैन्युअल रूप से वॉल्यूम के अंदर पुनर्निर्मित घनत्व के संभावित झुकाव को रोकने के लिए पतली अनुभाग सीमाओं को चिह्नित करें। ठीक संरेखण के लिए माध्य अवशिष्ट त्रुटि 1.2 पिक्स से कम थी।
  9. एक फ़िल्टर्ड बैक प्रोजेक्शन एल्गोरिथ्म के साथ टोमोग्राम का पुनर्निर्माण करें और फिर अंतिम मात्रा में ब्याज के क्षेत्र को फिट करने के लिए आउटपुट को ट्रिम करें।

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Representative Results

स्तनधारी कोशिका नाभिक में प्रतिकृति फोकी एस-चरण प्रगति के आधार पर नाभिक के भीतर वितरण के अलग-अलग पैटर्न प्रदर्शित करते हैं। ये पैटर्न लोकी की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के साथ सहसंबंधित हैं, जिसे दोहराया जा रहा है। चूंकि यहां प्रस्तुत विधि एक मजबूत निर्धारण प्रक्रिया का उपयोग करती है, इसलिए विभिन्न ट्रांसक्रिप्शनल राज्यों में क्रोमैटिन लोकी का विशिष्ट पता लगाने के लिए प्रतिकृति पल्स लेबलिंग का उपयोग करना काफी सरल है, यहां तक कि कमरे के तापमान रासायनिक निर्धारण द्वारा प्राप्त क्रोमैटिन के सर्वोत्तम संरचनात्मक संरक्षण की पेशकश करने वाली शर्तों के तहत भी।

गुणवत्ता नियंत्रण चरणों का उद्देश्य इस प्रोटोकॉल में प्रमुख प्रक्रियाओं के सफल समापन को सुनिश्चित करना है। प्रारंभ में, सफल EdU लेबलिंग फ्लोरोसेंटली लेबल azide के साथ क्लिक-प्रतिक्रिया द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए, विशिष्ट प्रतिकृति पैटर्न का प्रदर्शन अगर विषम सेल जनसंख्या का उपयोग किया जाता है (चित्रा 2). दूसरा महत्वपूर्ण कदम स्ट्रेप्टाविडिन लेबलिंग है, जिसे ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण से दृढ़ता से प्रभावित किया जा सकता है। स्ट्रेप्टाविडिन बाध्यकारी दक्षता के मूल्यांकन के लिए, एलेक्साफ्लोर-488-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग करें, जो स्ट्रेप्टाविडिन-नैनोगोल्ड (चित्रा 3) के समान परिस्थितियों में है। इस बिंदु पर, कुछ पृष्ठभूमि मुख्य रूप से ग्लूटाराल्डिहाइड ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ-साथ अपूर्ण स्ट्रेप्टाविडिन वॉश-आउट के कारण होने की उम्मीद है। यदि सिग्नल-टू-शोर अनुपात अस्वीकार्य है, तो चरण 2.6 पर धोने के चरणों की संख्या और अवधि बढ़ाने का प्रयास करें। वैकल्पिक रूप से, चरण 1.5 के बाद NaBH4 (चरण 2.9-2.10) के साथ ग्लूटाराल्डिहाइड शमन जोड़ें।

चांदी वृद्धि प्रक्रिया अक्सर असंगत परिणाम उत्पन्न करती है और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, प्रतिक्रिया की गति बबूल पाउडर समाधान बैच के आधार पर नाटकीय रूप से भिन्न होती है। समाधान की चिपचिपाहट चांदी के दाग के विकास के समय के व्युत्क्रमानुपाती है। एक ही बैच के कई एलीकोट होना और इष्टतम प्रतिक्रिया समय निर्धारित करने के लिए नियंत्रण नमूनों पर उनका परीक्षण करना एक अच्छा विचार है। चूंकि अभिकर्मकों और पर्यावरण के तापमान का भी प्रतिक्रिया की गति पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, इसलिए उसी तापमान पर प्रतिक्रिया करने का प्रयास करें। यदि एक साथ तीन से अधिक नमूनों को संसाधित किया जाता है, तो चरणों को धोने के लिए पर्याप्त समय के लिए 30 सेकंड के अंतराल पर प्रतिक्रिया शुरू करना सुविधाजनक है।

चांदी की वृद्धि प्रक्रिया का एक अच्छा परिणाम कुछ (सभी नहीं) नाभिक के गहरे भूरे रंग का धुंधला होना है, जिसमें बहुत बेहोश पीले रंग के साइटोप्लाज्मिक स्टेनिंग (चित्रा 4) होते हैं। इसका मतलब है कि चांदी के कणों का औसत आकार लगभग 20 एनएम है, जो क्रोमैटिन काउंटरस्टेनिंग पर टीईएम की एक व्यापक आवर्धन सीमा में आसान लेबल का पता लगाने के लिए उपयुक्त है। टोमोग्राफी प्रयोगों के लिए, कणों के आकार को प्रतिक्रिया समय को छोटा करके लगभग 10 एनएम तक कम किया जाना चाहिए। इस मामले में रंग हल्का भूरा या लाल होना चाहिए। सोने की टोनिंग से पहले सिल्वर स्टेनिंग के रंग की जांच की जानी चाहिए।

डीएबी photoconversion और osmification सोने toning के बाद प्रदर्शन किया जाता है विघटन से चांदी के गोले की रक्षा करने के लिए. अपर्याप्त सोने के गर्भाधान के मामले में, चांदी के नैनोकणों का क्षरण हो जाता है और अनियमित आकार प्राप्त होता है, लेकिन फिर भी टीईएम के तहत दिखाई देता है। डीएबी फोटोकनवर्ज़न की गुणवत्ता की निगरानी पहले DRAQ5 ब्लीचिंग (प्रतिदीप्ति मोड में) द्वारा की जाती है, फिर एक ब्राइटफील्ड मोड में, जब एक विकिरणित क्षेत्र में सेल नाभिक गहरे भूरे रंग के हो जाते हैं (चित्रा 5)। डीएबी स्टेनिंग तीव्रता बहुत अधिक नहीं होनी चाहिए ताकि एजी-एयू स्टेनिंग सेक्शनिंग के लिए आवश्यक प्रतिकृति समय के साथ कोशिकाओं के चयन के लिए अनुमति देने के लिए अच्छी तरह से पता लगाया जा सके।

अल्ट्राथिन या अर्ध-पतले वर्गों को अतिरिक्त धुंधला करने की आवश्यकता नहीं होती है और इसे सीधे टीईएम के तहत देखा जा सकता है। उपयुक्त लेबलिंग आमतौर पर एजी नैनोकणों के अच्छी तरह से परिभाषित समूहों में परिणाम प्रतिकृति साइटों (चित्रा 6) का सीमांकन करती है, जबकि पृष्ठभूमि लेबलिंग प्रति वर्ग माइक्रोमीटर कुछ नैनोकणों तक सीमित होती है। अर्ध-पतले खंड टोमोग्राफी के लिए तैयार हैं और अनुभाग की सतह पर सोने के नैनोकणों को जोड़ने की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि एक अनुभाग में मौजूद एजी नैनोकणों को फिड्यूशियल मार्क (चित्रा 7) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस आंकड़े में, लंबे समय तक लेबलिंग समय का प्रभाव दिखाया गया है: फाइबर जैसी संरचनाओं में व्यक्तिगत प्रतिकृति फोकी फ्यूज, उच्च-क्रम क्रोमैटिन डोमेन को चित्रित करता है।

Figure 1
चित्र 1. विधि अवलोकन. कवरलिप्स पर उगाई गई कोशिकाओं को ईडीयू के साथ लेबल किया जाता है, जो 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ तय किया जाता है, परमेबिलाइज्ड होता है, और क्लिक-प्रतिक्रिया बायोटिनिलेटेड एज़ाइड के साथ की जाती है। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एज़ाइड का उपयोग प्रकाश सूक्ष्म अवलोकन में किया जाता है। बायोटिन निगमन की साइटों को नैनोगोल्ड-स्ट्रेप्टाविडिन (या फ्लोरोसेंटली लेबल वाले स्ट्रेप्टाविडिन को एक नियंत्रण के रूप में) के साथ लेबल किया जाता है, चांदी को बढ़ाया जाता है, और सोने की टोनिंग के बाद DRAQ5-मध्यस्थता डीएबी फोटोकनवर्ज़न और ऑस्मिफिकेशन के अधीन होता है। नमूनों epoxy राल में एम्बेडेड कर रहे हैं, sectioned, TEM में जांच की, और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के अधीन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिकृति पैटर्न EdU लेबलिंग और क्लिक-प्रतिक्रिया (हरे रंग) द्वारा पता चला। शुरुआती से देर से एस-चरण (बाएं से दाएं) तक एस-चरण प्रगति प्रतिकृति पैटर्न में एक व्यवस्थित परिवर्तन द्वारा प्रकट होती है: ए, बी - प्रारंभिक एस-चरण, सी - मध्य एस-चरण, डी, ई - देर से एस-चरण। डीएनए DAPI (लाल) के साथ दाग दिया जाता है। स्केल बार = 10 um. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिकृति पैटर्न EdU लेबलिंग और दो कदम क्लिक-biotin और स्ट्रेप्टाविडिन-AlexaFluor 488 ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण के बाद धुंधला द्वारा पता चला। स्ट्रेप्टाविडिन-एलेक्साफ्लोर 488 के साथ लेबल किए गए नियंत्रण नमूना ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण के बाद इष्टतम लेबलिंग दक्षता और एस / एन अनुपात प्रदर्शित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. चांदी वृद्धि प्रक्रिया (चरण 3) के बाद कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवि। विभिन्न प्रतिकृति पैटर्न (प्रारंभिक एस-चरण, तीर; मध्य एस-चरण, एरोहेड; देर से, डबल तीर) एक ब्राइटफील्ड लाइट माइक्रोस्कोपी मोड में आसानी से दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. DRAQ5-मध्यस्थता DAB photoconversion का एक विशिष्ट परिणाम। (ए) DRAQ5 धुंधला (धराशायी सर्कल विकिरणित क्षेत्र को इंगित करता है)। नोट मजबूत DRAQ5 सर्कल के अंदर विरंजन. (बी) ब्राइटफील्ड प्रकाश माइक्रोस्कोप में देखा जाने वाला एक ही क्षेत्र। विकिरणित क्षेत्र में नाभिक में मजबूत डीएबी वर्षा नोट करें। इनसेट: तीर प्रारंभिक एस-चरण नाभिक को इंगित करते हैं जहां एजी-एयू के साथ लेबल किए गए प्रतिकृति पैटर्न अभी भी DRAQ5-फोटो-ऑक्सीडेज्ड डीएबी स्टेनिंग की पृष्ठभूमि पर आसानी से पता लगाने योग्य हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6. स्तनधारी सेल नाभिक में प्रतिकृति फोकी EdU लेबलिंग और दो कदम क्लिक-biotin और स्ट्रेप्टाविडिन-Nanogold glutaraldehyde निर्धारण के बाद धुंधला द्वारा पता चला. एक एस-फेज सेल के पतले 90 एनएम वर्गों में प्रतिकृति फोकी (ए, लाल हलकों) पर एजी-एयू नैनोकणों के समूहों को दिखाया गया है। पृष्ठभूमि स्तर को एक गैर-एस-चरण सेल (बी) में सराहना की जा सकती है। एरोहेड्स विभिन्न पैमाने के क्रोमैटिन फाइबर को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7. 250 एनएम अनुभाग के 0 °-झुकाव प्रक्षेपण. (ए) और आभासी टोमोग्राफिक अनुभाग। (बी) एक सेल नाभिक का जिसे 2 घंटे के लिए ईडीयू के साथ लेबल किया गया है। अलग-अलग प्रतिकृति फोकी को फाइबर जैसी संरचनाओं (एरोहेड्स) में फ्यूज्ड देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित विधि में पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं। सबसे पहले, दोहराए गए डीएनए को लेबल करने के लिए क्लिक-रसायन विज्ञान का उपयोग एंटीबॉडी के साथ बीआरडीयू का पता लगाने के लिए डीएनए विकृतीकरण शर्त की आवश्यकता को समाप्त करता है, इस प्रकार क्रोमैटिन अल्ट्रास्ट्रक्चर को बेहतर ढंग से संरक्षित करता है।

दूसरा, एक द्वितीयक लिगैंड के रूप में बायोटिन का उपयोग जो ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण के बाद उत्पन्न होता है और अनबाउंड एल्डिहाइड समूहों के उचित शमन लक्ष्य के रासायनिक संशोधन को कम करता है, इस प्रकार अंतर्जात बायोटिन के कारण पृष्ठभूमि को कम करते हुए लेबलिंग दक्षता में सुधार करता है। Biotin-streptavidin भी बहुमुखी प्रतिभा जोड़ता है क्योंकि फ्लोरोसेंटली लेबल वाले स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग प्रक्रिया के बहुत शुरुआती चरण में आसान गुणवत्ता नियंत्रण प्रदान करता है। प्रोटोकॉल को फ्लोरोनानोगोल्ड-लेबल वाले स्ट्रेप्टाविडिन की शुरुआत से और सरल बनाया जा सकता है, हालांकि, हमारे हाथों में इन अभिकर्मकों ने नैनोगोल्ड-स्ट्रेप्टाविडिन की तुलना में कुछ हद तक अधिक पृष्ठभूमि दी, शायद जांच के बड़े आकार के कारण।

तीसरा, छोटी जांच का एक संयोजन, स्ट्रेप्टाविडिन-नैनोगोल्ड लगभग 5 एनएम का सबसे बड़ा घटक होने के नाते, यहां तक कि ग्लूटाराल्डिहाइड-क्रॉसलिंक्ड कोशिकाओं में भी बहुत अच्छा प्रवेश प्रदान करता है। यह तकनीक को बेहतर रूप से अल्ट्रास्ट्रक्चरल रूप से संरक्षित कोशिकाओं के लेबलिंग को पूर्व-एम्बेड करने के लिए उपयुक्त बनाता है और आसानी से विभिन्न 3 डी-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ संगत होता है, जिसमें सीरियल सेक्शन पुनर्निर्माण, सरणी टोमोग्राफी, इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी, सीरियल ब्लॉक फेस इमेजिंग और एफआईबी-एसईएम शामिल हैं।

चांदी की वृद्धि सबसे महत्वपूर्ण कदम है, जिसमें अभिकर्मक प्रसार और धोने के चरणों के सटीक नियंत्रण की आवश्यकता होती है, जो अनुयायी कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन करना आसान है। दूसरी ओर, चूंकि ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ मजबूत क्रॉसलिंकिंग भी चांदी की वृद्धि को प्रभावित कर सकती है, इसलिए क्रोमैटिन संरचना संरक्षण और चांदी की वृद्धि दक्षता को संतुलित करने के लिए निर्धारण की स्थिति को ठीक किया जाना चाहिए। इस कारण से, क्रायो-फिक्सेशन / क्रायो-प्रतिस्थापन तकनीकें, जिन्हें विस्तारित और खराब रूप से नियंत्रित पोस्ट-फिक्सेशन की आवश्यकता होती है, हालांकि बेहतर संरचना संरक्षण की अनुमति देता है, प्रस्तावित लेबलिंग रणनीति23 के साथ पूरी तरह से संगत नहीं हो सकता है। चांदी वृद्धि24 के बजाय एयू-प्रवर्धन का उपयोग करके तकनीक को और बेहतर बनाया जा सकता है। यह संशोधन सोने के टोनिंग चरण को छोड़ने की अनुमति देता है, हालांकि, हमारे हाथों में, यह काफी अधिक पृष्ठभूमि देता है।

अंत में, पूर्व एम्बेडिंग लेबलिंग क्रोमईएम के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के पूर्व-चयन की अनुमति देता है और ब्राइटफील्ड या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत पता लगाने योग्य प्रतिकृति पैटर्न के आधार पर सेक्शनिंग करता है। इसके अलावा, विधि को आसानी से CLEM तक बढ़ाया जा सकता है, जिसमें विभिन्न सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकें शामिल हैं। यह विभिन्न शारीरिक राज्यों में क्रोमैटिन उच्च क्रम संरचना और गतिशीलता के अध्ययन में नए क्षितिज खोलता है। हमारे द्वारा यहां वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग प्रतिकृति की साइटों पर क्रोमैटिन संगठन के अध्ययन के लिए किया जा सकता है, क्रोमैटिन के पोस्ट-रेप्लिकेटिव पुनर्व्यवस्था के विश्लेषण के लिए, जिसमें इंटरफेज में क्रोमैटिड अलगाव की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग शामिल है, और बड़े क्रोमोसोमल डोमेन के प्रतिकृति लेबलिंग और जीनोम के विशिष्ट अंशों के उच्च-क्रम क्रोमैटिन तह के अध्ययन के लिए (यूक्रोमैटिन या हेटरोक्रोमैटिन, प्रतिकृति समय के आधार पर लेबल किया गया है)। इन प्रकार की इमेजिंग तकनीकें वैकल्पिक दृष्टिकोणों द्वारा उत्पन्न डेटा के लिए एक संदर्भ बिंदु के रूप में भी महत्वपूर्ण हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

इस काम को RSF (अनुदान # 17-15-01290) और RFBR (अनुदान # 19-015-00273) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। लेखकों Lomonosov मास्को राज्य विश्वविद्यालय विकास कार्यक्रम (PNR 5.13) और Nikon उत्कृष्टता के केंद्र को धन्यवाद Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology में correlative इमेजिंग में इमेजिंग इंस्ट्रूमेंटेशन तक पहुंच के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) Thermo Fisher A10044
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) Fisher Scientific BP300-100
AlexaFluor 555-azide Termo Fisher A20012
biotin-azide Lumiprobe C3730
Bovine Serum Albumine Boval LY-0080
DDSA SPI-CHEM 26544-38-7
DMP-30 SPI-CHEM 90-72-2
DRAQ5 Thermo Scientific 62251
Epoxy resin monomer SPI-CHEM 90529-77-4
Glutaraldehyde (25%, EM Grade) TED PELLA, INC 18426
Gum arabic ACROS Organics 258850010
Magnesium chloride Panreac 141396.1209
NaBH4 SIGMA-ALDRICH 213462
NMA SPI-CHEM 25134-21-8
N-propyl gallate SIGMA-ALDRICH P3130
PBS MP Biomedicals 2810305
Silver lactate ALDRICH 359750-5G
Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate Termo Fisher S11223
Streptavidin-Nanogold conjugate Nanoprobes 2016
tetrachloroauric acid SIGMA-ALDRICH HT1004
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) CHEM-IMPEX INT'L 298
Triton X-100 Fluka Chemica 93420
Instruments
Carbon Coater Hitachi
Copper single slot grids Ted Pella 1GC10H
Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) Nikon Cy5 HQ Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus
Diamond knife Ultra Wet 45o Diatome DU Alternatives: Ted Pella
Fluorescent microscope Nikon Ti-E Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus
High-tilt sample holder Jeol
Rotator Biosan Multi Bio RS-24
Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer Jeol JEM-2100 Alternatives: FEI, Hitachi
Tweezers Ted Pella 523
Ultramicrotome Leica UltraCut-E Alternatives: RMC
Software
Image acquisition Open Source SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
Image processing Open Source IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Sosnovskaya, S., Zakirov, A. N., Ryumina, E. D., Kharybina, E., Golyshev, S. A., Strelkova, O. S., Zhironkina, O. A., Moiseenko, A., Orekhov, A., Kireev, I. I. Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography. J. Vis. Exp. (183), e62803, doi:10.3791/62803 (2022).

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