Summary
Extracellulaire blaasjes (EV's) dragen bij aan cellulaire biologie en intercellulaire communicatie. Er is behoefte aan praktische testen om de opname van EV's door de cellen te visualiseren en te kwantificeren. Het huidige protocol stelt de EV-opnametest voor door gebruik te maken van driedimensionale fluorescentiebeeldvorming via confocale microscopie, na EV-isolatie door een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat.
Abstract
Er is behoefte aan praktische testen om de extracellulaire vesikelopname (EV) van de cellen te visualiseren en te kwantificeren. EV-opname speelt een rol in intercellulaire communicatie in verschillende onderzoeksgebieden; kankerbiologie, neurowetenschappen en medicijnafgifte. Veel EV-opnametests zijn gerapporteerd in de literatuur; er is echter een gebrek aan praktische, gedetailleerde experimentele methodologie. Ev-opname kan worden beoordeeld door EV's fluorescerend te labelen om hun locatie in cellen te detecteren. Onderscheid maken tussen geïnternaliseerde EV's in cellen en de oppervlakkige EV's op cellen is moeilijk, maar cruciaal, om de EV-opname nauwkeurig te bepalen. Daarom wordt in dit werk een test voorgesteld die de opname van EV efficiënt kwantificeert door middel van driedimensionale (3D) fluorescentie confocale microscopie. Fluorescerend gelabelde EV's werden voorbereid met behulp van een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat, gevisualiseerd door 3D confocale microscopie en vervolgens geanalyseerd via geavanceerde beeldverwerkingssoftware. Het protocol biedt een robuuste methodologie voor het analyseren van EV's op cellulair niveau en een praktische aanpak voor efficiënte analyse.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn nanogrote, lipidemembraangebonden deeltjes die zijn gecategoriseerd op basis van hun grootte: ectosomen (100-500 nm) en exosomen (50-150 nm)1. EV's bevatten verschillende biomoleculen, zoals eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. Deze biomoleculen zijn afkomstig uit de cellen voordat ze als lading worden ingekapseld en via EV's in de extracellulaire ruimte worden vrijgegeven1,2,3.
Vanwege de verscheidenheid van hun lading, worden EV's verondersteld een actieve rol te spelen in intercellulaire communicatie. De afgifte en opname van EV's door cellen maakt de overdracht van biomoleculen tussen de cellen mogelijk4,5. De introductie van EV-lading in een cel kan de functies en homeostatische toestand van de ontvangende cel veranderen4,5,6. EV's worden geïnternaliseerd via meerdere paden; de exacte mechanismen zijn echter niet nauwkeurig aangetoond.
De meerderheid van de EV-opnametests, zoals genetische tagging, labelt fluorescerend individuele EV's7. Het resulterende signaal kan worden gemeten met een microplaatfotometer, flowcytometrie of microscopie, waarbij elke technologie aanzienlijke beperkingen heeft. Microplaatfotometers, flowcytometrie of standaard tweedimensionale (2D) microscopie kunnen geen onderscheid maken tussen geïnternaliseerde en oppervlakkig bevestigde EV's8,9. Bovendien kan de noodzakelijke monstervoorbereiding voor elk van deze technieken extra problemen met zich meebrengen voor de evaluatie van de ev-opname. Het opheffen van aangehechte cellen met trypsine vóór ev-opnameanalyse kan bijvoorbeeld enkele oppervlakkig gehechte EV's op het oppervlak van de cel splijten10,11. Trypsine kan ook interageren met het celoppervlak, waardoor het cel- en EV-fenotype wordt beïnvloed. Bovendien kan trypsine oppervlakkige EV's niet volledig losmaken, waardoor geïsoleerde populaties scheeftrekken.
Om EV's nauwkeurig te labelen met fluorescerende kleurstoffen, zijn extra wasstappen nodig om de resterende kleurstof7 te verwijderen. Geaccepteerde isolatietechnieken kunnen ook bijdragen aan vals-positieve signalen als gevolg van stolling die optreedt tijdens EV-isolatie. Seriële ultracentrifugatie (UC) wordt bijvoorbeeld veel gebruikt om EV's te isoleren en de geïmmobiliseerde kleurstof te verwijderen. UC kan echter ev's co-neerslaan en de resterende kleurstof kan leiden tot een vals-positief signaal12,13. Andere nanofiltratiemethoden, zoals kolomgebaseerde filtratie, worden ook veel gebruikt voor niet-geïmmobiliseerde kleurstofverwijdering. De complexe aard van EV's en kleurstof die binnen de kolommatrix interageren, kan leiden tot onvolledige verwijdering van resterende kleurstof als gevolg van de moleculaire afsnijding van de kolom die wordt gewijzigd door de complexe input14,15,16.
Het huidige protocol stelt een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat voor om fluorescerend gelabelde geïsoleerde EV's te isoleren en te wassen. Het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat kan efficiënte filtratie bieden via vloeistofondersteunde scheidingstechnologie (FAST)17,18. FAST vermindert de drukval over het filter, waardoor de potentiële aggregatie tussen EV's en kleurstoffen wordt verminderd. Door restkleurstof efficiënt te verwijderen, is het mogelijk om de kwaliteit van fluorescerend gelabelde EV's en de specificiteit van de test te verbeteren.
Confocale microscopie kan onderscheid maken tussen geïnternaliseerde en oppervlakkig gehechte EV's op het celoppervlak en de cellulaire mechanismen van EV-opname uitgebreid onderzoeken in een spatiotemporale resolutie19,20,21,22,23,24,25. Sung et al. beschreven bijvoorbeeld de visualisatie van de exosoomlevenscyclus met behulp van hun ontwikkelde live-cell reporter. De locatie van de geïnternaliseerde EV's werd gedetecteerd en geanalyseerd met behulp van een confocale microscoop in driedimensionale (3D) en post-beeldverwerkingstools20. Hoewel de grootte van kleine EV's (40-200 nm) onder de resolutiegrens van de optische microscoop ligt, kunnen de fluorescerend gelabelde EV's worden gedetecteerd door confocale microscopie, omdat de fotodetector de verhoogde fluorescentie-emissie kan detecteren. Daarom kan de subcellulaire lokalisatie van de fluorescerend gelabelde EV's in een cel nauwkeurig worden bepaald door meerdere z-gestapelde beelden van de EV's en de omliggende cellulaire organellen te verkrijgen.
Daarnaast kunnen 3D-reconstructie en post-dataverwerking meer inzicht geven in de positionering van de geïnternaliseerde, oppervlakkige en vrij zwevende EV's. Door deze processen te gebruiken in combinatie met de time-lapse live-cell imaging die wordt aangeboden door confocale microscopie, kan het niveau van EV-opname nauwkeurig worden geëvalueerd en is het real-time volgen van EV-opname ook mogelijk. Verder kan ev-trafficking-analyse worden uitgevoerd met behulp van confocale microscopie door de co-lokalisatie van EV's met organellen te beoordelen, een eerste stap om te bepalen hoe geïnternaliseerde EV's betrokken zijn bij de intracellulaire functie. Dit protocol beschrijft de methodologie voor het uitvoeren van een EV-opnametest met behulp van het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat17,26, confocale microscopie en post-image analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EV-isolatie en immuno-fluorescerende EV-etikettering op de chip
- Verzameling van celkweekmedia (CCM) en voorbewerking van CCM voor EV-isolatie
- Zaai PC3-cellen met 30% confluentie in een celkweekkolf van 75 cm2 . Laat controlecellen groeien tot 90% confluentie (~ 48 uur) in standaardmedia en cellijnspecifieke supplementen.
OPMERKING: Om te voorkomen dat EV-bevattende componenten de cellulaire opname beïnvloeden (d.w.z. foetaal runderserum), gebruikt u exosoomarme media en supplementen. - Oogst de CCM.
- Centrifugeer de CCM bij 1000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) om eventuele niet-aangebonden cellen en groot vuil dat met de media is geoogst, te pelleteren. Breng het supernatant over naar een nieuwe conische buis.
- Centrifugeer in de nieuwe buis het supernatant bij 10.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om kleiner puin en apoptotische lichamen die in de media achterblijven te pelleteren. Sommige grotere EV's zullen pelleteren. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis.
- Filter het supernatant door een membraanspuitfilter van 0,45 μm hydrofiel polyvinylideenfluoride (PVDF).
OPMERKING: Als U CCM niet onmiddellijk verwerkt voor EV-isolatie, bewaart u de voorbewerkte CCM bij -80 °C totdat de isolatie is uitgevoerd. Indien bevroren, beperk vries-dooicycli tot één.
- Zaai PC3-cellen met 30% confluentie in een celkweekkolf van 75 cm2 . Laat controlecellen groeien tot 90% confluentie (~ 48 uur) in standaardmedia en cellijnspecifieke supplementen.
- EV-isolatie van CCM met behulp van een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat
- Indien bevroren, ontdooi CCM en vortex volledig gedurende 30 s vóór stap 1.2.2.
- Injecteer 1 ml voorbewerkte CCM (stap 1.1) in de monsterkamer van het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat (zie materiaaltabel)17,26.
OPMERKING: Volg de standaardwerkprocedure voor het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat17,26. - Draai gedurende 10 minuten bij 3000 tpm in de tafelspinmachine (zie Materiaaltabel) om het microfluïdische apparaat te bedienen.
OPMERKING: Als CCM na de eerste run op de monsterkamer blijft, voer dan extra spins uit totdat alle CCM uit de monsterkamer is geleegd. - Verwijder de vloeistof uit de afvalkamer door te pipetteren en herhaal stap 1.2.1, 1.2.2 en 1.2.3 tweemaal.
OPMERKING: In totaal wordt 3 ml CCM verwerkt voor EV-isolatie. - Injecteer 1 ml fosfaatbuffered saline (PBS) in de monsterkamer om de geïsoleerde EV's te wassen. Draai in de bench-top spinmachine voor het bedienen van de microfluïdische inrichting zoals vermeld in stap 1.2.3. Lokaliseer de pure EV's op het membraan van het apparaat.
OPMERKING: De kwaliteit van EV's geïsoleerd uit het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat, in het bijzonder, werd bevestigd en vergeleken met de conventionele UC-methode door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), scanning elektronenmicroscoop (SEM), nanodeeltjesvolganalyse (NTA), gestructureerde verlichtingsmicroscopie, enzymgebonden immunosorbenttest en real-time PCR in het vorige onderzoek17,26.
- Immunofluorescente etikettering van EV met behulp van op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparatuur (figuur 1)
- Selecteer een EV-specifiek antilichaam op basis van het doel van de test (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Bepaalde antilichamen kunnen interfereren met ligandbindingsplaatsen die specifiek zijn voor EV-opnameroutes (d.w.z. endocytose). - Injecteer 1 μg/ml van het EV-specifieke antilichaam in het elutiegat van het apparaat dat 100 μL geïsoleerde EV's bevat.
- Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij RT op een platenschudder om de gelijkmatige verdeling van het antilichaam over het monster te garanderen.
- Bevestig een plakband op het elutiegat. Injecteer 1 ml PBS in de monsterkamer om eventuele resterende antilichamen weg te spoelen.
- Draai het apparaat bij 3000 tpm totdat de monsterkamer leeg is. Verwijder alle vloeistof uit de afvalkamer door te pipetteren. Injecteer 1 ml PBS in de monsterkamer.
OPMERKING: Fluorescerend gelabelde EV's bevinden zich in de membraankamer. - Pipetteer de fluorescerend gelabelde EV's (figuur 2) van de membraankamer naar een amberkleurige buis. Blokkeer van licht tot gebruik.
- Selecteer een EV-specifiek antilichaam op basis van het doel van de test (zie Tabel met materialen).
2. Incubatie van de cellen met fluorescerend gelabelde EV's voor de EV-opnametest
- Doelcelzaaien en -kweek op de celkweekcompatibele gerechten.
- Zaai 1 x 104 PC3-cellen in de microslide 8-well plaat (9,4 x 10,7 mm voor elke put) met 0,2 ml media of 4 x 104 PC3-cellen in een 35 mm schaal met 1 ml media. Plaats de cellen in een celkweekcompatibele schaal bestaande uit een dunne coverslip (dikte: 0,18 mm).
OPMERKING: De dunne coverslip minimaliseert de nadelige verstrooiing van licht. - Laat cellen zich 's nachts hechten in optimale celkweekomstandigheden (37 °C, 5% CO2-concentratie , 90% vochtigheid).
- Was aangehechte cellen tweemaal met exosoom-uitgeputte media (beschreven in stap 1.1.1).
- Zaai 1 x 104 PC3-cellen in de microslide 8-well plaat (9,4 x 10,7 mm voor elke put) met 0,2 ml media of 4 x 104 PC3-cellen in een 35 mm schaal met 1 ml media. Plaats de cellen in een celkweekcompatibele schaal bestaande uit een dunne coverslip (dikte: 0,18 mm).
- Celincubatie met fluorescerend gelabelde EV's.
- Meet de concentratie van fluorescerend gelabelde EV's (stap 1.3.5) door nanodeeltjesvolganalyse (NTA, aanvullende figuur 1). Bepaal de optimale concentratie van fluorescerend gelabelde EV's die aan de gekweekte cellen moeten worden toegevoegd (stap 2.1.2.).
- Verdun de fluorescerend gelabelde EV's met exosoomarme media om overeen te komen met de gewenste concentratie gemeten in stap 2.2.1. (d.w.z. 7,80 x 109 EV's (in NTA-waarde) in 200 μL exosoomarme media.)
- Voeg de verdunde EV's (stap 2.2.2) toe aan de aangehechte doelcellen die in punt 2.1.2 zijn bereid. Incubeer voor experimentele tijd (d.w.z. 4, 8 of 12 uur).
- Was cellen driemaal met exosoomvrije media om niet-geïnternaliseerde EV's te verwijderen.
OPMERKING: Optioneel: Cellen kunnen na het wassen worden gefixeerd. - Label het cytoplasma van de aangehechte cellen met 1 μg/ml CMTMR ((5-(en-6)-((((4-chloormethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) (zie Materialentabel) en incubeer in optimale celkweekomstandigheden (37 °C, 5% CO2-concentratie , 90% vochtigheid).
OPMERKING: Kleurstoffen in het celoppervlak moeten afzonderlijk fluoresceren van gelabelde EV's om te helpen bij het bepalen van de ruimtelijke locatie (geïnternaliseerd of oppervlakkig) van de spiked EV's tijdens de EV-opnametest. - Was gelabelde cellen tweemaal met exosoom-uitgeputte media om de resterende kleurstof te verwijderen. Voeg verse exosoom-uitgeputte media toe aan de cellen ter voorbereiding op confocale beeldvorming van levende cellen.
3. Confocale microscopie
- Om live-cell imaging uit te voeren, gebruikt u een incubator op het podium om optimale celkweekomstandigheden te handhaven (37 °C, 5% CO2-concentratie , 90% vochtigheid).
- Plaats de voorbereide cellen in de incubator op het podium.
- Stel de beeldparameters in op basis van controlemonsters.
OPMERKING: Voorgestelde controlemonsters zijn: alleen fluorescerend gelabelde EV's, fluorescerend gelabelde cellen, niet-gelabelde EV's en niet-gelabelde cellen. - Bepaal de diepte van de doelcellen en het bereik van de stapelgrootte in de z-richting om 3D-confocale afbeeldingen te verkrijgen.
OPMERKING: De dikte van een Z-stack is 1 μm. De confocale 3D-beeldacquisitie duurde 2 min 34 s (elke Z-plane beeldacquisitie duurde ongeveer 8 s; in totaal twintig Z-stack beelden). - Stel beeldacquisitie in op meerdere z-gestapelde afbeeldingen van zowel celspecifieke kleurstof (d.w.z. rood) als EV-specifieke kleurstof (d.w.z. groen) tegelijkertijd (figuur 3 en figuur 4A).
4. Beeldverwerking
- Gebruik automatische beeldverwerkingssoftware om de onbewerkte z-gestapelde confocale beelden te analyseren en de EV-opname door cellen te bepalen (zie Tabel met materialen).
- Stel drempelparameters in op het fluorescerende signaal van de cellen en EV-specifieke kleurstoffen. Bouw de virtuele oppervlakken van cellen (Figuur 4A,B).
- Als u de virtuele oppervlakken van cellen wilt bouwen, klikt u op de knop Nieuwe oppervlakken toevoegen.
- Selecteer Berekening van de kortste afstand als "Algoritme-instellingen" om het meegeleverde algoritme van de software te gebruiken en klik vervolgens op Volgende: Bronkanaal.
- Selecteer Kanaal 2 - CMTMR als "Bronkanaal" in dit experiment.
- Selecteer Vloeiend en zet de juiste waarde in "Surfaces Detail" voor het gladstrijken van het oppervlak.
OPMERKING: 0,57 μm in dit experiment, aangezien 1 pixel 0,57 μm vertegenwoordigt in onbewerkte beeldgegevens. - Selecteer Absolute intensiteit als 'Drempel'.
- Als u het fluorescerende beeld automatisch wilt drempelwaarden door het opgegeven algoritme, klikt u op Drempel (absolute intensiteit): de waarde wordt automatisch ingesteld.
- Selecteer Inschakelen als 'Split touching Objects (Region Growing)' en zet de waarde van de geschatte celgrootte in 'Seed Points Diameter', 10,0 μm in dit experiment. Klik vervolgens op Volgende: Seed Points filteren.
- Als u de virtuele celoppervlakken wilt configureren, klikt u op de knop + Toevoegen en selecteert u Vervolgens Kwaliteit als 'Filtertype'. Drempelwaarde voor de juiste waarde (210 in dit experiment) voor de lage limiet door een visuele inspectie en de maximumwaarde (1485) voor de bovengrens en klik vervolgens op de knop Voltooien .
OPMERKING: Een visuele inspectie betekent dat een onderzoeker het cellulaire gebied kan onderscheiden van een onbewerkt fluorescerend beeld. - Om vervolgens de virtuele stippen van EV's te bouwen, klikt u op de knop Nieuwe spots toevoegen.
- Selecteer Verschillende spotgrootten (regiogroei) en berekening van de kortste afstand als 'Algoritme-instellingen' en klik op Volgende: Bronkanaal.
- Selecteer Kanaal 1 - Alexa Fluor 488 als "Bronkanaal" in dit experiment.
- Zet de juiste waarde in "Geschatte XY-diameter" voor de spotdetectie, 1 μm in dit experiment. Klik vervolgens op Volgende: vlekken filteren.
- Als u de virtuele EV-stippen wilt configureren, klikt u op + knop Toevoegen , selecteert u Kwaliteit als "Filtertype" en stelt u "Lagere drempel" in bij een visuele inspectie, 100 in dit experiment. Klik vervolgens op de knop Volgende: Type steungebied .
- Selecteer Absolute intensiteit als 'Type steungebied' en klik op Volgende: Gebieden spotten.
- Om te drempel, het gebied van EV-stippen, zet de juiste waarde in "Regiodrempel" door een visuele inspectie, 100 als "Regiodrempel" in dit experiment.
OPMERKING: Een visuele inspectie betekent dat een onderzoeker het EV-gebied kan onderscheiden van een onbewerkt fluorescerend beeld. - Selecteer Gebiedsvolume als 'Diameter van' en klik vervolgens op 'Voltooi'.
- Gebruik de meegeleverde algoritmen van de software om de gegroepeerde plekken in het gebouwde oppervlak te splitsen bij stap 4.2 (Figuur 4C, i-iv).
- Klik op de ingebouwde Spots en ga naar Filters.
- Klik op de knop + Toevoegen , selecteer vervolgens Kortste afstand tot oppervlakken = Oppervlak 1 als filtertype en klik vervolgens op de knop Selectie dupliceren naar nieuwe spots . De laagste drempel (-7,0 in dit experiment) voor de lage grens en de juiste waarde (-0,5) voor de bovengrens.
OPMERKING: Stel de bovengrens in met de geschatte straal van vlekken. In dit experiment werd de geschatte diameter van Spots, d.w.z. EV-stippen, ingesteld op 1 μm in stap 4.2.11.; de bovengrens kan dus 0,5 zijn.
- Automatisch aantal EV's in de cellen
OPMERKING: De software telt automatisch het aantal EV's in de cellen, wat het aantal aangeeft dat door de doelcellen is geïnternaliseerd.- Klik op de geselecteerde selectie van de gebouwde Spots 1 [Kortste afstand tot oppervlakken = Oppervlakken 1 tussen -7,00 en -0,500].
- Ga naar de statistieken en exporteer de waarde uit "Totaal aantal spots"
OPMERKING: De meegeleverde algoritmen van de software berekenen automatisch het aantal en het volume van cellen.
- Bepaal de opbrengst van ev-opname per incubatietijd op basis van de hierboven berekende waarden (figuur 5).
- Om het aantal cellen te verkrijgen, klikt u op de gebouwde Oppervlakken 1, gaat u naar de statistieken en exporteert u de waarde 'Totaal aantal oppervlakken' uit Algemeen.
- Ga naar Gedetailleerd in Statistieken om het volume uit Gedetailleerd te exporteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat werden EV's geïsoleerd uit PC3 CCM en gelabeld met een fluorofoor-geconjugeerd EV-specifiek (CD63) antilichaam (figuur 1). De gelabelde EV's werden met succes gevisualiseerd door de 3D confocale microscopie (figuur 2). De gelabelde EV's werden gedurende enkele uren geïncubeerd met cellen in exosoom-uitgeputte media. Na incubatie werden cellen gewassen met exosoom uitgeputte media. De resterende EV's werden geïnternaliseerd of gehecht aan cellen tijdens de incubatie. Het celgebied werd gelabeld. Geïnternaliseerde EV's werden gevisualiseerd als puncta19,20,24,27 en een individuele EV (figuur 3 en figuur 4A). Nabewerking van deze beelden maakt de visualisatie en kwantificering van EV-internalisatie in de cellen mogelijk (figuur 4). De stappen in combinatie maken een nauwkeurige EV-opnametest mogelijk die efficiënt wordt uitgevoerd. Figuur 5 toont de representatieve resultaten van de EV-opnametest. De test geeft aan dat het niveau van EV-opname afhankelijk is van de lengte van de incubatietijd. De procedure maakt het mogelijk om niet-geïnternaliseerde EV's systematisch uit te sluiten (figuur 4C) om het aantal geïnternaliseerde EV's nauwkeurig te meten. De grootteverdeling van geïnternaliseerde EV-stippen werd berekend (figuur 6). Bovendien kan het aantal geïnternaliseerde EV's worden genormaliseerd naar het volume van de ontvangende cellen om de werkelijke snelheid van EV-opname voor de specifieke cel te bepalen. Normalisatie houdt rekening met de heterogene celgrootte en vertegenwoordigt het aantal geïnternaliseerde EV's met betrekking tot het cellulaire oppervlak. Cellulair oppervlak wordt gedefinieerd als het celgebied in contact met EV-spiked, exosoom-uitgeputte cultuurmedia tijdens incubatie.
Figuur 1: Schematische illustratie van de EV-isolatie en on-chip etikettering met behulp van een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat. (A) EV's isoleren van CCM. (B) On-chip immunofluorescentie-etikettering van EV's. (C) Verwijdering van ongebonden antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beeldvorming van fluorescerend gelabelde EV's. De fluorescerend gelabelde (anti-CD63-Alexa Fluor 488) EV's werden gedetecteerd met behulp van de confocale microscoop (40x objectief). (A) Positief monster (anti-CD63-Alexa Fluor 488 gelabelde EV's). (B) Negatieve controle 1 voor de EV-etikettering (EV's met alleen 2e antilichaam (Alexa Fluor 488), zonder 1e antilichaam). (C) Negatieve controle 2 (EV's met de muis (MS) IgG-antilichaam en 2e antilichaam (Alexa Fluor 488)). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beeldvorming van de geïnternaliseerde EV's in cellen in een 2D-beeld. (A) De fluorescerend gelabelde (anti-CD63-Alexa Fluor 488, groen) EV's en de cellen (CMTMR, rood) werden gedetecteerd met behulp van de confocale microscoop (20x objectief) na de incubatie. (B) Alleen een afzonderlijke afbeelding van de fluorescerend gelabelde EV's. (C) Alleen een afzonderlijke afbeelding van de fluorescerend gelabelde cellen. De excitatie/emissie laser golflengten voor CMTMR en Alexa Fluor 488 zijn 560.6/595 (±50) nm en 487.8/525 (±50) nm. De energie-instellingen voor laser zijn 3,0% voor CMTMR en 10,0% voor Alexa Fluor 488. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering van de geïnternaliseerde EV's door het post-imaging proces. (A) Ruw confocaal beeld verkregen uit de EV-opnametest. (B) Virtuele weergave van de EV's als een punt (groen) en de cellen als een oppervlak (rood) met behulp van de beeldverwerkingssoftware. (C, i-iv) Discriminatie van de geïnternaliseerde EV's (gele stippen) en niet-geïnternaliseerde EV's (groene stippen, witte pijl) met behulp van het door software geleverde algoritme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De hoeveelheid EV-opname als functie van de incubatietijd. (A) Het aantal geïnternaliseerde EV's per cel. (B) Het aantal geïnternaliseerde EV's per celvolume. Het aantal geïnternaliseerde EV's werd verhoogd afhankelijk van de incubatietijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: De grootteverdeling van geïnternaliseerde EV-stippen. De grootte van EV-stippen werd gemeten en uitgezet tot een verdeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: NTA-meting van anti-CD63-Alex Fluor 488 ev's met het label. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: De hoeveelheid co-gelokaliseerde EV's met lysosomen als functie van de incubatietijd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: De hoeveelheid EV-opname als functie van de incubatietijd. (A) Het aantal geïnternaliseerde EV's per cel. (B) Het aantal geïnternaliseerde EV's per celvolume. Het aantal geïnternaliseerde EV's werd verhoogd afhankelijk van de incubatietijd. Het EV-monster werd gelabeld met RNA-kleurstof (zie Tabel met materialen). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een EV-opnametest op basis van 3D-fluorescentiebeeldvorming via confocale microscopie biedt een efficiënte methodologie en gevoelige analyse. Deze fluorescerende EV-etikettering vergemakkelijkt de visualisatie van EV's en voert met succes een nauwkeurige EV-opnametest uit. Eerdere methoden voor het labelen van EV's en het verwijderen van de resterende kleurstof zijn gemeld door neerslag te verwijderen met behulp van ultracentrifugatie (UC); UC kan echter ev's samen neerslaan en de geïmmobiliseerde kleurstof kan leiden tot een vals-positief signaal12,13. Op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaten elimineren deze co-neerslag van EV's en kleurstof, waardoor de kwaliteit van de fluorescerend gelabelde EV's en de specificiteit van de test worden verbeterd. Ev-opname werd gemeten door volumetrische analyse om de geïnternaliseerde EV's te onderscheiden en te kwantificeren die gescheiden zijn van oppervlakkige EV's op het celoppervlak. De volumetrische analyse van EV-opname maakt de normalisatie van EV-opname per celgrootte mogelijk. De live-cell EV-opnametest werd bereikt door gebruik te maken van de confocale microscoopincubator op het podium. Het protocol is van toepassing op studies die levende celculturen en EV's vereisen. Real-time intracellulaire EV-tracking kan worden uitgevoerd in een 3D-venster. Bovendien kan ev-trafficking-analyse van ruimtelijk-temporele resolutie samen met de co-lokalisatie van EV's met subcellulaire organellen worden bereikt via het protocol (aanvullende figuur 2). Het hier beschreven protocol is een krachtig hulpmiddel voor de cellulaire analyse van EV's.
Ondanks alle voordelen van het protocol zijn er mogelijke beperkingen. Het microfluïdische nanofiltratie-apparaat dat in deze studie wordt gebruikt, kan andere verontreinigingen co-isoleren tijdens EV-isolatie. Lipoproteïnen met lage dichtheid zijn qua grootte vergelijkbaar met EV's en kunnen tijdens isolatie in het membraan worden gevangen28. Hoewel EV-specifieke markers EV's kunnen specificeren, kunnen de co-geïsoleerde verontreinigingen de downstream-analyse beïnvloeden. In dit manuscript werden EV's gelabeld met een CD63 geconjugeerde Alexa Fluor 488 kleurstof. Deze etikettering verhoogt de specificiteit voor EV-detectie; het bindt echter ook het EV-oppervlaktemolecuul en verhoogt de concurrentiebinding. Bovendien kan het niveau van EV-opname afhankelijk zijn van de cellijn en CCM. De etiketteringsmethoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden aangepast aan andere kleurstoffen zoals lipofiele kleurstoffen, cytosolische kleurstoffen en RNA-kleurstoffen (aanvullende figuur 3). Het protocol maakt gebruik van een lichtscannende confocale microscoop (LSCM) om het kleine signaal van EV's te detecteren. LSCM is afhankelijk van intense lasers en als gevolg daarvan kunnen levende cellen worden beschadigd of veranderd door langdurige laserexcitatie. De snelle acquisitiesnelheid kan fotoschade verminderen door gebruik te maken van een draaiende schijf confocale microscoop (SDCM). SDCM kan ook worden gebruikt in EV-tracking die korte time-lapse-beeldvorming vereist om bewegingen op korte afstand te visualiseren.
Ondanks deze mogelijke beperkingen biedt het voorgestelde protocol een efficiënte methode voor ev-opnamebeoordeling en heeft het het potentieel voor verdere live-cell EV-tracking analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.-K. Cho is een uitvinder van de patenten op het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat Exodisc, die in licentie zijn gegeven aan Labspinner (Ulsan, Korea). Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NCI grant nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 en CA143055 naar K. J. P. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (subsidienummer: HI19C1122). Werk van J. Kim en Y.-K. Cho werd ondersteund door het Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), gefinancierd door de Koreaanse overheid. De auteurs bedanken de huidige en voormalige leden van het Brady Urological Institute, in het bijzonder leden van het Pienta-Amend laboratorium, voor de kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
