Summary
שלל חוץ-תאי (EVs) תורמים לביולוגיה תאית ולתקשורת בין-תאית. יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולתייג ספיגת EVs על ידי התאים. הפרוטוקול הנוכחי מציע את בדיקת ספיגת EV על ידי שימוש בהדמיית פלואורסצנטיות תלת ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל, לאחר בידוד EV על ידי מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון.
Abstract
יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולכומת את ספיגת ההדבקה החוץ-תאית (EV) של התאים. ספיגת EV ממלאת תפקיד בתקשורת בין-תאית בתחומי מחקר שונים; ביולוגיה של סרטן, מדעי המוח, ואספקת תרופות. ספרות דיווחו על ספיגת EV רבים; עם זאת, קיים חוסר במתודולוגיה ניסיונית מעשית ומפורטת. ניתן להעריך את ספיגת EV על ידי תיוג פלואורסצנטי של EVs כדי לזהות את מיקומם בתוך התאים. קשה להבחין בין EVs מופנמים בתאים לבין ה-EVs השטחיים בתאים, אך קריטיים, כדי לקבוע במדויק את ספיגת EV. לכן, בדיקה כי ביעילות כימות ספיגת EV באמצעות תלת מימדי (3D) פלואורסצנטיות קונפוקלית מיקרוסקופיה מוצעת בעבודה זו. כלי עבודה אלקטרוניים בעלי תווית פלואורסצנטית הוכנו באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, שנודע על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת-ממדית, ולאחר מכן נותחו באמצעות תוכנה מתקדמת לעיבוד תמונה. הפרוטוקול מספק מתודולוגיה חזקה לניתוח כלי עבודה אלקטרוניים ברמה התאית וגישה מעשית לניתוח יעיל.
Introduction
שלשולים חוץ-תאיים (EVs) הם חלקיקים ננו-בגודל ננו, הקשורים לקרום השומנים המסווגים לפי גודלם: אקטוזומים (100-500 ננומטר) ואקסוזומים (50-150 ננומטר)1. רכבים יפים מכילים ביומולקולים שונים, כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. ביומולקולים אלה מקורם בתאים לפני שהם עטופים כמטען ומשוחררים לחלל החוץ-תאי באמצעות EVs1,2,3.
בשל מגוון המטען שלהם, רכבים חשמליים הם האמינו לשחק תפקיד פעיל בתקשורת בין תאית. שחרור וספיגה של רכבים ותשובים על ידי תאים מאפשרים העברה של biomolecules בין התאים4,5. כניסת מטען EV לתא עשויה לשנות את הפונקציות של תא הנמען ואת המצב ההומיאוסטטי4,5,6. כלי ינוי מופנמים באמצעות מסלולים מרובים; עם זאת, המנגנונים המדויקים לא הוכחו במדויק.
רוב בדיקות ספיגת EV, כגון תיוג גנטי, תווית פלואורסצנטית EVs7 בודדים. האות המתקבל יכול להימדד על ידי פוטומטר מיקרו-לוחית, ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה, כאשר לכל טכנולוגיה יש מגבלות משמעותיות. מיקרו-לוח צילום, ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה דו-ממדית סטנדרטית (דו-ממדית) אינם יכולים להבחין בין EVs8,9 מופנם ומוצמד באופן שטחי. בנוסף, הכנת המדגם הדרושה לכל אחת מהטכניקות הללו עשויה להכניס בעיות נוספות להערכת ספיגת EV. לדוגמה, הרמת תאים דבוקים עם טריפסין לפני ניתוח ספיגת EV עשויה לבקע כמה EVs מחוברים באופן שטחי על פני השטח של התא10,11. טריפסין עשוי גם לקיים אינטראקציה עם פני השטח של התא, המשפיעים על פנוטיפ התא ו- EV. בנוסף, טריפסין לא יכול לנתק EVs שטחי לחלוטין, מוטה אוכלוסיות מבודדות.
כדי לסמן במדויק את ה-EVs בצבעים פלואורסצנטיים, נדרשים שלבי כביסה נוספים כדי להסיר את שאריות הצבע7. טכניקות בידוד מקובלות יכולות גם לתרום לאותות חיוביים כוזבים עקב קרישה המתרחשת במהלך בידוד EV. לדוגמה, אולטרה-צנטריפוגה טורית (UC) נמצאת בשימוש נרחב כדי לבודד רכבים אופן אלקטרוני ולהסיר את הצבע משותק. עם זאת, UC עשוי לזרז את ה- EVs, והצבע השיורי עלול להוביל לאות חיובי כוזב12,13. שיטות ננו-סינון אחרות, כגון סינון מבוסס טורים, נמצאות בשימוש נרחב גם להסרת צבע לא משותק. האופי המורכב של רכבים EVs וצבע אינטראקציה בתוך מטריצת העמודה עלול להוביל הסרה חלקית של צבע שיורית עקב החתך המולקולרי של העמודה משתנה על ידי קלט מורכב14,15,16.
הפרוטוקול הנוכחי מציע מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון כדי לבודד ולשטוף EVscented שכותרתו פלואורסצנטית מבודדת. ההתקן המיקרו-פלוידי מבוסס ננו-סינון יכול לספק סינון יעיל באמצעות טכנולוגיית הפרדה בסיוע נוזלים (FAST)17,18. FAST מפחית את ירידת הלחץ על-פני המסנן, ובכך מפחית את הצבירה הפוטנציאלית בין הרכבים החמוצים והצבעים. על ידי הסרת שיורי צבע ביעילות, ניתן לשפר את האיכות של EVs שכותרת פלואורסצנטית ואת הספציפיות של ה- assay.
מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה להבחין בין EVs מופנם ושטחי מחובר על פני התא ולחקור באופן מקיף את המנגנונים התאיים של ספיגת EV ברזולוציה spatiotemporal19,20,21,22,23,24,25. לדוגמה, סונג ואח ' תיארו את ההדמיה של מחזור החיים האקסויזום באמצעות כתב התא החי המפותח שלהם. המיקום של כלי העבודה האלקטרוניים שהופנמו זוהה ונותח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בכלי עיבוד תלת-ממדיים (3D) ופוסט-תמונה20. למרות שגודלם של כלי הרכב האלקטרוניים הקטנים (40-200 ננומטר) נמוך ממגבלת הרזולוציה של המיקרוסקופ האופטי, ניתן לזהות את הרכבים האלקטרוניים המסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מכיוון שצלם הצילום יכול לזהות את פליטת הפלואורסצנטיות המשופרת. לכן, לוקליזציה תת-תאית של EVs פלואורסצנטית בתוך תא ניתן לקבוע במדויק על ידי רכישת תמונות z-stacked מרובים של EVs ואת organelles הסלולר שמסביב.
בנוסף, שחזור תלת-ממד ועיבוד לאחר נתונים יכולים לספק תובנה נוספת לגבי המיקום של הרובוטים האלקטרוניים המופנמים, השטחיים והצפים בחינם. על ידי ניצול תהליכים אלה בשילוב עם הדמיית תאים חיים בזמן לשגות המוצעת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להעריך במדויק את רמת ספיגת EV, ואת המעקב בזמן אמת של ספיגת EV אפשרי גם. יתר על כן, ניתוח סחר EV יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית על ידי הערכת לוקליזציה משותפת של רכבים אופניים עם אברונים, צעד ראשון כדי לקבוע כיצד EVs מופנמים מעורבים בפונקציה התארית. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה לביצוע בדיקת ספיגת EV באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון17,26, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח לאחר התמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד EV ותיוג EV אימונו-פלואורסצנטי על שבב
- איסוף מדיה של תרבית תאים (CCM) ועיבוד מקדים של CCM לבידוד EV
- תאי PC3 זרע ב 30% השפעה בבקבוק תרבית תאים 75 ס"מ2 . אפשר לתאי בקרה לגדול ל-90% השפעה (~48 שעות) בתוספי מדיה סטנדרטיים ותוספי מזון ספציפיים לקו התא.
הערה: כדי למנוע מרכיבים המכילים EV להשפיע על ספיגת התא (כלומר, סרום בקר עוברי), להשתמש במדיה exosome מרוקן ותוספי מזון. - לקצור את CCM.
- צנטריפוגות CCM ב 1000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי גלולה כל תאים לא מחוברים ופסולת גדולה שנקטפו עם התקשורת. העבר את סופרנטנט לצינור חרוט חדש.
- בצינור החדש, צנטריפוגה supernatant ב 10,000 x g במשך 20 דקות ב 4 °C (75 °F) כדי גלולה פסולת קטנה יותר וגופים אפופטוטיים שנותרו בתקשורת. כמה כלי יווס גדולים יותר יזרקו. העבר את סופר-טבעי לצינור חדש.
- סנן את supernatant דרך 0.45 מיקרומטר פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) מסנן מזרק ממברנה.
הערה: אם לא מיד עיבוד CCM לבידוד EV, לאחסן את CCM מעובד מראש ב -80 °C (70 °F) עד לבידוד מבוצע. אם קפוא, להגביל מחזורי הפשרת הקפאה לאחד.
- תאי PC3 זרע ב 30% השפעה בבקבוק תרבית תאים 75 ס"מ2 . אפשר לתאי בקרה לגדול ל-90% השפעה (~48 שעות) בתוספי מדיה סטנדרטיים ותוספי מזון ספציפיים לקו התא.
- בידוד EV מ- CCM באמצעות מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון
- אם קפוא, להפשיר לחלוטין CCM ומערבולת עבור 30 s לפני שלב 1.2.2.
- הזרק 1 מ"ל של CCM מעובד מראש (שלב 1.1) לתא המדגם של התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון (ראה טבלת חומרים)17,26.
הערה: בצע את הליך ההפעלה הסטנדרטי עבור התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון17,26. - הסתובב ב-3,000 סל"ד למשך 10 דקות במכונת הספינינג העליונה (ראו טבלת חומרים) כדי להפעיל את המכשיר המיקרופלואידי.
הערה: אם CCM נשאר בתא המדגם לאחר ההפעלה הראשונית, בצע סיבובים נוספים עד שכל CCM התרוקן מתא המדגם. - הסר את הנוזל מתא הפסולת על ידי צנרת וחזרה על שלבים 1.2.1, 1.2.2 ו 1.2.3 פעמיים.
הערה: בסך הכל, 3 מ"ל של CCM יעובדו לבידוד EV. - הזריקו תמיסת מלח עם פוספט (PBS) מ"ל לתא הדגימה כדי לשטוף את ה-EVs המבודדים. ספין במכונת ספינינג ספסל העליון להפעלת המכשיר microfluidic כאמור בשלב 1.2.3. אתר את EVs הטהור על הממברנה של המכשיר.
הערה: איכות כלי ה-EV המבודדים מהתקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, באופן ספציפי, אושרה והושוותה לשיטת ה-UC הקונבנציונלית על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM), מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM), ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA), מיקרוסקופיית תאורה מובנית, בדיקת חיסונים הקשורה לאנזים ו- PCR בזמן אמת במחקר הקודם17,26.
- תיוג אימונופלואורסצנטי של EV באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון (איור 1)
- בחר נוגדן ספציפי EV בהתאם למטרת ההסתה (ראה טבלת חומרים).
הערה: נוגדנים מסוימים עלולים להפריע לאתרי כריכת ליגנד ספציפיים למסלולי ספיגת EV (כלומר, אנדוציטוזיס). - הזריקו 1 מיקרוגרם/מ"ל של הנוגדן הספציפי EV לתוך חור ההתחמקות של המכשיר המכיל 100 μL של EVs מבודדים.
- דגירה במשך שעה בחשיכה ב- RT על שייקר צלחת כדי להבטיח את ההפצה הזוגית של הנוגדן על פני הדגימה.
- חבר סרט הדבקה לחור ההתחמקות. הזריקו 1 מ"ל PBS לתא הדגימה כדי לשטוף את כל שאריות הנוגדנים.
- סובב את ההתקן במהירות של 3,000 סל"ד עד שתא הדגימה יהיה ריק. הסר כל נוזל מתא הפסולת על ידי צנרת. הזריקו 1 מ"ל PBS לתא המדגם.
הערה: EVs שכותרתו פלואורסצנטית ימוקמו בתא הממברנה. - פיפטה, ה-EVs המסומנים באופן פלואורסצנטי (איור 2) מתא הממברנה לצינור ענבר. חסמו מהאור עד לשימוש.
- בחר נוגדן ספציפי EV בהתאם למטרת ההסתה (ראה טבלת חומרים).
2. דגירה של התאים עם EVs פלואורסצנטרית לתיקון ספיגת EV
- תתמקד בזריעה ובתרבית של תאים על המנות התואמות לתרבות התאים.
- זרע 1 x 104 תאי PC3 לתוך צלחת מיקרו-מגלשה 8-well (9.4 x 10.7 מ"מ עבור כל באר) עם 0.2 מ"ל של מדיה או 4 x 104 PC3 תאים לתוך צלחת 35 מ"מ עם 1 מ"ל של מדיה. צלחת התאים לתוך צלחת תואמת תרבית התא המורכב כיסוי דק (עובי: 0.18 מ"מ).
הערה: כיסוי דק ממזער את הפיזור השלילי של האור. - אפשר לתאים לדבוק בן לילה בתנאי תרבית תאים אופטימליים (37 °C (37 °C), ריכוז CO2 של 5%, 90% לחות).
- לשטוף תאים דבקים פעמיים עם מדיה מרוקנת exosome (מתואר בשלב 1.1.1).
- זרע 1 x 104 תאי PC3 לתוך צלחת מיקרו-מגלשה 8-well (9.4 x 10.7 מ"מ עבור כל באר) עם 0.2 מ"ל של מדיה או 4 x 104 PC3 תאים לתוך צלחת 35 מ"מ עם 1 מ"ל של מדיה. צלחת התאים לתוך צלחת תואמת תרבית התא המורכב כיסוי דק (עובי: 0.18 מ"מ).
- דגירה של תאים עם EVs שכותרתו פלואורסצנטרית.
- מדדו את הריכוז של EVs המסומנים באופן פלואורסצנטרי (שלב 1.3.5) על ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקים ננו-חלקיקים (NTA, איור משלים 1). לקבוע את הריכוז האופטימלי של EVs פלואורסצנטית לתווסף לתאים בתרבית (שלב 2.1.2.).
- לדלל את כלי ה-EV המסומנים בפלואורסצנטיות עם מדיה מרוקנת אקסוזום כדי להתאים לריכוז הרצוי הנמדד בשלב 2.2.1. (כלומר, 7.80 x 109 EVs (בערך NTA) ב- 200 μL של מדיה מרוקנת אקסוזום.)
- הוסף את ה- EVs מדולל (שלב 2.2.2) לתאי היעד המודבקים שהוכנו ב- 2.1.2. דגירה לזמן ניסיוני (כלומר, 4, 8 או 12 שעות).
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם מדיה ללא אקסוזומים כדי להסיר את כל כלי ה-EV שאינם מופנמים.
הערה: אופציונלי: ניתן לקבע תאים לאחר הכביסה. - סמן את הציטופלסמה של התאים הדבוקים עם 1 מיקרוגרם/מ"ל של CMTMR ((5-(ו-6)-((4-כלורומתיל)בנזויל)אמינו) (ראה טבלת חומרים) ודגרה בתנאי תרבית תאים אופטימליים (37 °C (37 °C(5% ריכוז CO2 , 90% לחות).
הערה: צבעי אזור התא צריכים פלואורסצ'ים בנפרד מ- EVs שכותרתו כדי לסייע בקביעת המיקום המרחבי (מופנמים או שטחיים) של רכבים החולים המשודרגים במהלך בדיקות ספיגת EV. - לשטוף תאים מתויגים פעמיים עם מדיה מרוקנת exosome כדי להסיר את הצבע שיורית. הוסף מדיה מרוקנת exosome חדשה לתאים כהכנה להדמיה קונפוקלית של תאים חיים.
3. מיקרוסקופיה קונפוקלית
- כדי לבצע הדמיה של תאים חיים, השתמש באינקובטור על הבמה כדי לשמור על תנאי תרבית תאים אופטימליים (37 °C (37 °C (5%, ריכוז CO2 5%, 90% לחות).
- מניחים את התאים המוכנים באינקובטור על הבמה.
- הגדר את פרמטרי ההדמיה בהתבסס על דוגמאות בקרה.
הערה: דגימות בקרה מוצעות כוללות: EVs עם תווית פלואורסצנטית בלבד, תאים בעלי תווית פלואורסצנטית, EVs ללא תווית ותאים ללא תווית. - קבעו את עומק תאי היעד ואת טווח גודל הערימה בכיוון z כדי להשיג תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות.
הערה: העובי של ערימת Z הוא 1 מיקרומטר. רכישת התמונה 3D confocal נמשך 2 דקות 34 s (כל רכישת תמונת Z-plane לקח כ 8 s; סך של עשרים תמונות Z-stack). - הגדר רכישת תמונה לתמונות מרובות של צבע ספציפי לתא (כלומר, אדום) וצבע ספציפי ל-EV (כלומר, ירוק) בו-זמנית (איור 3 ואיור 4A).
4. עיבוד תמונה
- השתמש בתוכנת עיבוד תמונה אוטומטית כדי לנתח את התמונות הקונפוקליות הגולמיות המוערמות z ולקבוע את ספיגת EV על-ידי תאים (ראה טבלת חומרים).
- הגדר פרמטרי סף לאות הפלואורסצנטי של התאים וצבעים ספציפיים EV. בנה את המשטחים הווירטואליים של התאים (איור 4A,B).
- כדי לבנות את המשטחים הווירטואליים של התאים, לחץ על הלחצן הוסף משטחים חדשים.
- בחר חישוב המרחק הקצר ביותר כ"הגדרות אלגוריתם " כדי להשתמש באלגוריתם שסופק על-ידי התוכנה ולאחר מכן לחץ על הבא: ערוץ מקור.
- בחר ערוץ 2 - CMTMR כ"ערוץ מקור " בניסוי זה.
- בחרו ' החלק ' והכניסו את הערך המתאים ל'פרטי משטחים' להחלקת משטח.
הערה: 0.57 מיקרומטר בניסוי זה מאז 1 פיקסל מייצג 0.57 מיקרומטר בנתוני הדמיה גולמיים. - בחר עוצמה מוחלטת כ"סף".
- כדי לסף באופן אוטומטי את התמונה הפלואורסצנטית על-ידי האלגוריתם שסופק, לחץ על סף (עוצמה מוחלטת): הערך מוגדר באופן אוטומטי.
- בחר הפוך לזמין כ"פיצול אובייקטים נוגעים ללב (גידול אזור)" והכנס את הערך של גודל התא המשוער ל"קוטר נקודות הזרע", 10.0 מיקרומטר בניסוי זה. לאחר מכן לחץ על הבא: סינון נקודות זרע.
- כדי לקבוע את התצורה של משטחי התא הווירטואלי, לחץ על לחצן + הוסף ולאחר מכן בחר איכות כ"סוג מסנן". סף את הערך המתאים (210 בניסוי זה) עבור המגבלה הנמוכה על-ידי בדיקה חזותית והערך המרבי (1485) עבור הגבול העליון ולאחר מכן לחץ על לחצן סיום .
הערה: בדיקה חזותית פירושה שחוקר יכול להפלות את האזור התאי מתמונה פלואורסצנטית גולמית. - לאחר מכן, כדי לבנות את הנקודות הווירטואליות של EVs, לחץ על הלחצן הוסף כתמים חדשים.
- בחרו 'גדלי ספוט שונים' (גידול אזורים) ו'חישוב המרחק הקצר ביותר ' כ'הגדרות אלגוריתם', ולחצו על 'הבא:ערוץ מקור'.
- בחר ערוץ 1 - אלכסה פלור 488 כ"ערוץ מקור " בניסוי זה.
- שים את הערך המתאים לתוך "קוטר XY משוער" עבור זיהוי ספוט, 1 מיקרומטר בניסוי זה. לאחר מכן, לחץ על הבא: נקודות סינון.
- כדי לקבוע את התצורה של נקודות EV וירטואליות, לחץ על לחצן + הוסף , בחר איכות כ"סוג מסנן", והגדר את "סף תחתון" על-ידי בדיקה חזותית, 100 בניסוי זה. לאחר מכן, לחץ על לחצן הבא: סוג אזור ספוט .
- בחרו 'עוצמה מוחלטת ' כ'סוג אזורי ספוט', ולחצו על הבא: אזורי ספוט.
- כדי לסף, האזור של נקודות EV, לשים את הערך המתאים לתוך "סף אזור" על ידי בדיקה חזותית, 100 כמו "סף אזור" בניסוי זה.
הערה: בדיקה חזותית פירושה שחוקר יכול להפלות את אזור ה- EVs מתמונה פלואורסצנטית גולמית. - בחר עוצמת אזור כ"קוטר מ", ולאחר מכן לחץ על סיום.
- השתמש באלגוריתמים שסופקו על-ידי התוכנה כדי לפצל את הנקודות המקובצות בתוך המשטח הבנוי בשלב 4.2 (איור 4C, i-iv).
- לחץ על הנקודות המוכללות ולאחר מכן עבור למסננים.
- לחץ על לחצן + הוסף ולאחר מכן בחר מרחק קצר ביותר למשטחים = משטח 1 כסוג מסנן, ולאחר מכן לחץ על לחצן שכפל בחירה לנקודות חדשות. הסף הנמוך ביותר (-7.0 בניסוי זה) עבור המגבלה הנמוכה והערך המתאים (-0.5) עבור הגבול העליון.
הערה: הגדר את הגבול העליון עם הרדיוס המשוער של כתמים. בניסוי זה, הקוטר המשוער של כתמים, כלומר, נקודות EV, נקבע 1 מיקרומטר בשלב 4.2.11.; לכן, הגבול העליון יכול להיות 0.5.
- ספירה אוטומטית של 400 סובבים EV בתוך התאים
הערה: התוכנה תספור באופן אוטומטי את מספר ה- EVs בתוך התאים, המציינת את המספר שהופנם על-ידי תאי היעד.- לחץ על הבחירה המוכללת של כתמים 1 [המרחק הקצר ביותר למשטחים = משטחים 1 בין -7.00 ל- -0.500].
- עבור אל הסטטיסטיקה וייצוא הערך מתוך "מספר המקומות הכולל"
הערה: האלגוריתמים שסופקו על-ידי התוכנה יחשבו באופן אוטומטי את מספר התאים ואת נפחם.
- קבעו את התשואה של ספיגת EV לכל תקופת דגירה בהתבסס על הערכים המחושב לעיל (איור 5).
- כדי להשיג את מספר התאים, לחץ על המשטחים הבנויים 1 ולאחר מכן עבור אל סטטיסטיקה וייצוא הערך של "המספר הכולל של משטחים" מתוך כולל.
- עבור אל מפורט לתוך סטטיסטיקה כדי לייצא את אמצעי האחסון מתוך מפורט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, הושבים החמצוניים היו מבודדים מ-PC3 CCM ותויגו בנוגדן EV (CD63) ספוג פלואורופור (איור 1). ה-EVs המסומנים בתווית הוצגו בהצלחה על-ידי מיקרוסקופיית הקונפוקליים תלת-ממדית (איור 2). כלי ה-EV המסומנים דוגרו בתאים במשך מספר שעות במדיה מרוקנת אקסוזום. לאחר הדגירה, תאים נשטפו עם מדיה מרוקנת exosome. שאר ה-EVs הופנמו או דבקו בתאים במהלך הדגירה. אזור התא תויג. הודמיונים חשמליים מופנמים הוצגו כ-puncta19,20,24,27 ו-EV בודד (איור 3 ואיור 4A). לאחר עיבוד תמונות אלה, האפשרות חזותית וכימות של הפנמת EV לתאים (איור 4). השלבים בשילוב מאפשרים ספיגת EV מדויקת המבוצעת ביעילות. איור 5 מציג את התוצאות הייצוגיות של ספיגת EV. ההסתה מצביעה על כך שרמת ספיגת הרכב הרך תלויה באורך תקופת הדגירה. ההליך מאפשר החרגה שיטתית של כלי הפעלה אלקטרוניים לא מופנמים (איור 4C) כדי לוודא במדויק את מספר כלי ה-EV ההפנמה. התפלגות הגודל של נקודות EV מופנמות חושבה (איור 6). יתר על כן, ניתן לנרמל את מספר ה- EVs הפנמיים לאמצעי האחסון של תאי הנמען כדי לקבוע את הקצב בפועל של ספיגת EV עבור התא הספציפי. נורמליזציה מהווה את גודל התא ההטרוגני ומייצגת את מספר ה- EVs המופנמים לגבי שטח הפנים התאי. שטח הפנים התאי מוגדר כאזור התא במגע עם מדיה תרבותית ממוסמרת EV, מרוקנת אקסוזום במהלך הדגירה.
איור 1: איור סכמטי של בידוד EV ותיוג על שבב באמצעות מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון. (א) בידוד EVs מ- CCM. (ב) תיוג אימונופלואורסצנטי על שבב של EVs. (ג) הסרת נוגדנים לא מאוגדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיה של EVs שכותרתו פלואורסצנטית. ה- EVs שכותרתו פלואורסצנטרית (אנטי CD63-Alexa Fluor 488) זוהו באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי (המטרה 40x). (A) מדגם חיובי (אנטי CD63-Alexa Fluor 488 שכותרתו EVs). (B) שליטה שלילית 1 עבור תיוג EV (EVs עם נוגדן 2 ( אלכסה פלור 488) בלבד, ללא נוגדן 1). (ג) שליטה שלילית 2 (EVs עם העכבר (MS) נוגדן IgG ונוגדן 2 ( אלכסה פלור 488)). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה של רכבים החשמליים שהופנמו לתאים בתמונה דו-ממדית. (A) התוויות האלקטרוניות הפלואורסצנטיות (אנטי-CD63-Alexa Fluor 488, ירוק) והתאים (CMTMR, אדום) זוהו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (המטרה 20x) לאחר הדגירה. (B) תמונה נפרדת של EVs שכותרתו פלואורסצנטית בלבד. (ג) תמונה נפרדת של התאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בלבד. אורכי הגל של לייזר עירור/פליטה עבור CMTMR ואלכסה פלור 488 הם 560.6/595 (±50) nm ו 487.8/525 (±50) ננומטר. הגדרות צריכת הלייזר הן 3.0% עבור CMTMR ו- 10.0 % עבור Alexa Fluor 488. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כימות של ה-EVs המופנמים על ידי תהליך שלאחר ההדמיה. (א) תמונה קונפוקלית גולמית שהתקבלה מבחנת ספיגת EV. (ב) עיבוד וירטואלי של ה- EVs כנקודה (ירוקה) והתאים כמשטח (אדום) באמצעות תוכנת עיבוד התמונה. (ג, I-IV) אפליה של EVs מופנמים (נקודות צהובות) ו- EVs שאינם מופנמים (נקודות ירוקות, חץ לבן) באמצעות האלגוריתם שסופק על ידי התוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: כמות ספיגת EV כפונקציה של זמן הדגירה. (א) מספר כלי ה- EV ההפנמה לתא. (ב) מספר כלי האחסון האלקטרוניים הפנמו לכל אמצעי אחסון של תא. מספר ההפנימות הופנימו בהתאם לזמן הדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: התפלגות הגודל של נקודות EV מופנמות. גודלן של נקודות EV נמדד והתוות להתפלגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: מדידת NTA של אנטי CD63-אלכס פלור 488 שכותרתו EVs. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: כמות כלי הוורי המקומיים המשותפים עם ליזוזומים כפונקציה של זמן הדגירה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: כמות ספיגת EV כפונקציה של זמן הדגירה. (א) מספר כלי ה- EV ההפנמה לתא. (ב) מספר כלי האחסון האלקטרוניים הפנמו לכל אמצעי אחסון של תא. מספר ההפנימות הופנימו בהתאם לזמן הדגירה. דגימת EV תויגה על ידי צבע כתמי RNA (ראה טבלת חומרים). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדיקת ספיגת EV המבוססת על הדמיית פלואורסצנטיות תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת מתודולוגיה יעילה וניתוח רגיש. תיוג EV פלואורסצנטי זה מקל על הדמיה של EVs ומבצע בהצלחה בדיקה מדויקת של ספיגת EV. שיטות קודמות לתיוג EVs והסרת הצבע שיורית דווחו על ידי הסרת משקעים באמצעות ultracentrifugation (UC); עם זאת, UC עשוי לזרז רכבים אנרגיה אלקטרונית, והצבע המשותק עלול להוביל לאות חיובי כוזב12,13. התקנים מיקרופלואידיים מבוססי סינון ננו מבטלים משקעים משותפים אלה של EVs וצבע, ובכך משפרים את איכות ה- EVs המסומנים באופן פלואורסצנטרי ואת הספציפיות של ה- Assay. ספיגת EV נמדדה על ידי ניתוח נפחי כדי להבחין ולכמת את EVs מופנמים נפרדים EVs שטחי על פני התא. הניתוח הנפחי של ספיגת EV מאפשר נורמליזציה של ספיגת EV לפי גודל התא. ספיגת EV של תאים חיים הושגה על ידי שימוש בחממת המיקרוסקופ הקונפוקלית על הבמה. הפרוטוקול חל על מחקרים הדורשים תרביות תאים חיים ו- EVs. ניתן לבצע מעקב אחר EV תאי בזמן אמת על פני חלון תלת-ממד. בנוסף, ניתוח סחר EV של רזולוציה מרחבית-זמנית יחד עם לוקליזציה משותפת של רכבים אופן אלקטרוני עם אברונים תת-תאיים ניתן להשיג באמצעות הפרוטוקול (איור 2 משלים). הפרוטוקול המתואר כאן הוא כלי רב עוצמה לניתוח תאי של כלי עבודה אלקטרוניים.
למרות כל היתרונות של הפרוטוקול, יש מגבלות פוטנציאליות. התקן מיקרופלואידי ננו-סינון בשימוש במחקר זה עשוי לבודד מזהמים אחרים במהלך בידוד EV. ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה דומים בגודלם ל- EVs ועלולים להיתפס בממברנה במהלך בידוד28. למרות סמנים ספציפיים EV יכול לציין EVs, מזהמים מבודדים שיתוף עשוי להשפיע על ניתוח במורד הזרם. בכתב יד זה, EVs היו מסומנים עם CD63 מצומד אלכסה פלור 488 צבע. תיוג זה מגדיל את הספציפיות לזיהוי EV; עם זאת, הוא גם קושר את מולקולת פני השטח של EV ומגביר את הכריכה התחרותית. בנוסף, רמת ספיגת הרכב הרך EV עשויה להיות תלויה בקו התא וב- CCM. ניתן להתאים את שיטות התיוג המפורטות בפרוטוקול זה לצבעי כתמים אחרים כגון צבעים ליפופיליים, צבעים ציטסוליים וצבעי RNA (איור 3 משלים). הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק אור (LSCM) כדי לזהות את האות הזעיר של EVs. LSCM מסתמך על לייזרים אינטנסיביים, וכתוצאה מכך, תאים חיים עלולים להיפגע או להשתנות על ידי עירור לייזר לטווח ארוך. מהירות הרכישה המהירה יכולה להפחית פוטודאם על ידי שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב (SDCM). ניתן להשתמש ב-SDCM גם במעקב אחר EV הדורש הדמיה קצרה בזמן כדי לדמיין תנועות למרחקים קצרים.
למרות מגבלות פוטנציאליות אלה, הפרוטוקול המוצע מספק שיטה יעילה להערכת ספיגת EV ויש לו פוטנציאל לניתוח נוסף של מעקב אחר EV של תאים חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.-K. Cho הוא ממציא של הפטנטים על מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, Exodisc, אשר מורשים Labspinner (אולסן, קוריאה). לכל הסופרים האחרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NCI מענק nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 ו- CA143055 ל- K. J. P. מחקר זה נתמך על ידי מענק של פרויקט מו"פ טכנולוגיית הבריאות של קוריאה באמצעות המכון לפיתוח תעשיית הבריאות בקוריאה (KHIDI), במימון משרד הבריאות והרווחה, הרפובליקה של קוריאה (מספר מענק: HI19C1122). עבודה של ג'יי קים וי-קיי. צ'ו נתמך על ידי המכון למדע בסיסי (IBS-R020-D1), במימון ממשלת קוריאה. המחברים מודים לחברי המכון האורולוגי הנוכחי והעבר של המכון האורולוגי בריידי, במיוחד חברי המעבדה פינטה-תיקון, על הקריאה הביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
