Summary
Extrazelluläre Vesikel (EVs) tragen zur Zellbiologie und interzellulären Kommunikation bei. Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die Aufnahme von Elektrofahrzeugen durch die Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Das aktuelle Protokoll schlägt den EV-Aufnahmeassay vor, indem eine dreidimensionale Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie verwendet wird, nachdem die EV-Isolierung durch ein mikrofluidisches Gerät auf Nanofiltrationsbasis erfolgt.
Abstract
Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die extrazelluläre Vesikelaufnahme (EV) der Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Die Aufnahme von Elektrofahrzeugen spielt eine Rolle bei der interzellulären Kommunikation in verschiedenen Forschungsbereichen; Krebsbiologie, Neurowissenschaften und Arzneimittelabgabe. Viele EV-Aufnahmeassays wurden in der Literatur berichtet; Es fehlt jedoch an einer praktischen, detaillierten experimentellen Methodik. Die EV-Aufnahme kann durch fluoreszierende Markierung von EVs beurteilt werden, um ihre Position in Zellen zu erkennen. Die Unterscheidung zwischen internalisierten EVs in Zellen und den oberflächlichen EVs auf Zellen ist schwierig, aber kritisch, um die EV-Aufnahme genau zu bestimmen. Daher wird in dieser Arbeit ein Assay vorgeschlagen, der die EV-Aufnahme durch dreidimensionale (3D) Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie effizient quantifiziert. Fluoreszenzmarkierte EVs wurden mit einem auf Nanofiltration basierenden mikrofluidischen Gerät hergestellt, durch konfokale 3D-Mikroskopie visualisiert und dann durch fortschrittliche Bildverarbeitungssoftware analysiert. Das Protokoll bietet eine robuste Methodik für die Analyse von Elektrofahrzeugen auf zellulärer Ebene und einen praktischen Ansatz für eine effiziente Analyse.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanogroße, lipidmembrangebundene Partikel, die nach ihren Größen kategorisiert werden: Ektosomen (100-500 nm) und Exosomen (50-150 nm)1. EVs enthalten verschiedene Biomoleküle wie Proteine, Nukleinsäuren und Lipide. Diese Biomoleküle stammen aus den Zellen, bevor sie als Fracht eingekapselt und über EVs in den extrazellulären Raum freigesetzt werden1,2,3.
Aufgrund der Vielfalt ihrer Ladung wird angenommen, dass Elektrofahrzeuge eine aktive Rolle in der interzellulären Kommunikation spielen. Die Freisetzung und Aufnahme von EVs durch Zellen ermöglicht den Transfer von Biomolekülen zwischen den Zellen4,5. Die Einführung von EV-Ladung in eine Zelle kann die Funktionen und den homöostatischen Zustand der Empfängerzelle verändern4,5,6. EVs werden über mehrere Wege verinnerlicht; Die genauen Mechanismen wurden jedoch nicht genau demonstriert.
Die Mehrheit der EV-Aufnahmeassays, wie z. B. genetische Markierungen, markiert fluoreszierend einzelne EVs7. Das resultierende Signal kann per Mikroplattenphotometer, Durchflusszytometrie oder Mikroskopie gemessen werden, wobei jede Technologie erhebliche Einschränkungen aufweist. Mikroplattenphotometer, Durchflusszytometrie oder zweidimensionale Standardmikroskopie (2D) können nicht zwischen internalisierten und oberflächlich angebrachten EVs unterscheiden8,9. Darüber hinaus kann die notwendige Probenvorbereitung für jede dieser Techniken zusätzliche Probleme bei der Bewertung der EV-Aufnahme mit sich bringen. Zum Beispiel kann das Anheben von anhaftenden Zellen mit Trypsin vor der EV-Aufnahmeanalyse einige oberflächlich angebrachte EVs auf der Zelloberfläche spalten10,11. Trypsin kann auch mit der Zelloberfläche interagieren und den Zell- und EV-Phänotyp beeinflussen. Darüber hinaus kann Trypsin oberflächliche EVs nicht vollständig lösen, wodurch isolierte Populationen verzerrt werden.
Um EVs genau mit Fluoreszenzfarbstoffen zu kennzeichnen, sind zusätzliche Waschschritte erforderlich, um den Restfarbstoff zu entfernen7. Akzeptierte Isolationstechniken können auch zu falsch-positiven Signalen aufgrund der Koagulation beitragen, die während der EV-Isolierung auftritt. Zum Beispiel wird die serielle Ultrazentrifugation (UC) häufig verwendet, um EVs zu isolieren und den immobilisierten Farbstoff zu entfernen. UC kann jedoch EVs mitverfälschen, und der Restfarbstoff kann zu einem falsch-positiven Signal führen12,13. Andere Nanofiltrationsmethoden, wie die säulenbasierte Filtration, werden ebenfalls häufig für die nicht immobilisierte Farbstoffentfernung verwendet. Die komplexe Natur von EVs und Farbstoffen, die innerhalb der Säulenmatrix interagieren, kann zu einer unvollständigen Entfernung des Restfarbstoffs führen, da der molekulare Cut-off der Säule durch den komplexen Input verändert wird14,15,16.
Das aktuelle Protokoll schlägt ein nanofiltrationsbasiertes mikrofluidisches Gerät vor, um fluoreszenzmarkierte isolierte EVs zu isolieren und zu waschen. Das auf Nanofiltration basierende mikrofluidische Gerät kann eine effiziente Filtration über die flüssigkeitsunterstützte Trenntechnologie (FAST)17,18 ermöglichen. FAST reduziert den Druckabfall über den Filter und reduziert so die potenzielle Aggregation zwischen Elektrofahrzeugen und Farbstoffen. Durch die effiziente Entfernung von Restfarbstoffen ist es möglich, die Qualität fluoreszenzmarkierter EVs und die Spezifität des Assays zu verbessern.
Die konfokale Mikroskopie kann zwischen internalisierten und oberflächlich angebrachten EVs auf der Zelloberfläche unterscheiden und die zellulären Mechanismen der EV-Aufnahme in einer raumzeitlichen Auflösung umfassend untersuchen19,20,21,22,23,24,25. Zum Beispiel beschrieben Sung et al. die Visualisierung des Exosomen-Lebenszyklus mit ihrem entwickelten Live-Cell-Reporter. Die Position der verinnerlichten EVs wurde mit einem konfokalen Mikroskop in dreidimensionalen (3D) und Post-Bildverarbeitungswerkzeugen erkannt und analysiert20. Obwohl die Größe kleiner EVs (40-200 nm) unter der Auflösungsgrenze des optischen Mikroskops liegt, können die fluoreszenzmarkierten EVs durch konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden, da der Photodetektor die verstärkte Fluoreszenzemission nachweisen kann. Daher kann die subzelluläre Lokalisation der fluoreszenzmarkierten EVs innerhalb einer Zelle präzise bestimmt werden, indem mehrere z-gestapelte Bilder der EVs und der umgebenden Zellorganellen aufgenommen werden.
Darüber hinaus können die 3D-Rekonstruktion und die Nachdatenverarbeitung weitere Einblicke in die Positionierung der verinnerlichten, oberflächlichen und frei schwebenden Elektrofahrzeuge geben. Durch die Verwendung dieser Prozesse in Verbindung mit der Zeitraffer-Live-Cell-Bildgebung, die die konfokale Mikroskopie bietet, kann der Grad der EV-Aufnahme genau bewertet werden, und die Echtzeitverfolgung der EV-Aufnahme ist ebenfalls möglich. Darüber hinaus kann die EV-Trafficking-Analyse unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie durchgeführt werden, indem die Co-Lokalisation von EVs mit Organellen bewertet wird, ein erster Schritt, um zu bestimmen, wie internalisierte EVs an der intrazellulären Funktion beteiligt sind. Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur Durchführung eines EV-Aufnahmeassays unter Verwendung des nanofiltrationsbasierten mikrofluidischen Geräts17,26, der konfokalen Mikroskopie und der Post-Image-Analyse.
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Protocol
1. EV-Isolierung und On-Chip-Immunfluoreszenz-EV-Markierung
- Sammlung von Zellkulturmedien (CCM) und Vorverarbeitung von CCM zur EV-Isolierung
- Seed PC3-Zellen bei 30% Konfluenz in einem 75 cm2 Zellkulturkolben. Lassen Sie Die Kontrollzellen in Standardmedien und zelllinienspezifischen Nahrungsergänzungsmitteln auf 90% Konfluenz (~ 48 h) wachsen.
HINWEIS: Um zu verhindern, dass EV-haltige Komponenten die zelluläre Aufnahme beeinflussen (z. B. fötales Rinderserum), verwenden Sie exosomenarme Medien und Nahrungsergänzungsmittel. - Ernten Sie das CCM.
- Zentrifugieren Sie das CCM bei 1000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT), um nicht angebrachte Zellen und große Ablagerungen, die mit dem Medium geerntet werden, zu pelletieren. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues konisches Rohr.
- Im neuen Röhrchen zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 x g für 20 min bei 4 °C, um kleinere Ablagerungen und apoptotische Körper, die im Medium verbleiben, zu pelletieren. Einige größere EVs werden pelletiert. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr.
- Filtern Sie den Überstand durch einen 0,45 μm hydrophilen Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membranspritzenfilter.
HINWEIS: Wenn CCM nicht sofort für die EV-Isolierung verarbeitet wird, lagern Sie das vorverarbeitete CCM bei -80 °C, bis die Isolierung durchgeführt ist. Wenn eingefroren, begrenzen Sie die Gefrier-Tau-Zyklen auf eins.
- Seed PC3-Zellen bei 30% Konfluenz in einem 75 cm2 Zellkulturkolben. Lassen Sie Die Kontrollzellen in Standardmedien und zelllinienspezifischen Nahrungsergänzungsmitteln auf 90% Konfluenz (~ 48 h) wachsen.
- EV-Isolierung von CCM mit einem mikrofluidischen Gerät auf Nanofiltrationsbasis
- Wenn eingefroren, CCM und Wirbel vor Schritt 1.2.2 30 s vollständig auftauen.
- Injizieren Sie 1 ml vorbearbeitetes CCM (Schritt 1.1) in die Probenkammer des mikrofluidischen Geräts auf Nanofiltrationsbasis (siehe Materialtabelle)17,26.
HINWEIS: Befolgen Sie die Standardarbeitsanweisung für das mikrofluidische Gerät auf Nanofiltrationsbasis17,26. - Drehen Sie mit 3000 U / min für 10 minuten in der Tischspinnmaschine (siehe Materialtabelle), um das mikrofluidische Gerät zu betreiben.
HINWEIS: Wenn CCM nach dem ersten Durchlauf auf der Probenkammer verbleibt, führen Sie zusätzliche Drehungen durch, bis das gesamte CCM aus der Probenkammer entleert ist. - Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren aus der Abfallkammer und wiederholen Sie die Schritte 1.2.1, 1.2.2 und 1.2.3 zweimal.
HINWEIS: Insgesamt werden 3 ml CCM für die EV-Isolierung verarbeitet. - Injizieren Sie 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Probenkammer, um die isolierten EVs zu waschen. Drehen Sie in der Tischspinnmaschine zum Betrieb der mikrofluidischen Vorrichtung gemäß Schritt 1.2.3. Lokalisieren Sie die reinen EVs auf der Membran des Geräts.
HINWEIS: Die Qualität der aus dem nanofiltrationsbasierten mikrofluidischen Gerät isolierten EVs wurde insbesondere durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterelektronenmikroskop (REM), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), strukturierte Beleuchtungsmikroskopie, enzymgebundenen Immunosorbent-Assay und Real-Time-PCR in der vorherigen Forschung bestätigt und verglichen17,26.
- Immunfluoreszenzmarkierung von ELEKTROFAHRZEUGEN mit einem mikrofluidischen Gerät auf Nanofiltrationsbasis (Abbildung 1)
- Wählen Sie einen EV-spezifischen Antikörper entsprechend dem Zweck des Assays aus (siehe Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Bestimmte Antikörper können Ligandenbindungsstellen stören, die für EV-Aufnahmewege spezifisch sind (d. H. Endozytose). - Injizieren Sie 1 μg/ml des EV-spezifischen Antikörpers in das Elutionsloch des Geräts, das 100 μL isolierte EVs enthält.
- Inkubieren Sie für 1 h im Dunkeln bei RT auf einem Plattenschüttler, um die gleichmäßige Verteilung des Antikörpers über die Probe zu gewährleisten.
- Befestigen Sie ein Klebeband am Elutionsloch. Injizieren Sie 1 ml PBS in die Probenkammer, um alle verbleibenden Antikörper auszuwaschen.
- Drehen Sie das Gerät mit 3000 U / min, bis die Probenkammer leer ist. Entfernen Sie jegliche Flüssigkeit aus der Abfallkammer durch Pipettieren. Injizieren Sie 1 ml PBS in die Probenkammer.
HINWEIS: Fluoreszenzmarkierte EVs befinden sich in der Membrankammer. - Pipettieren Sie die fluoreszierend markierten EVs (Abbildung 2) aus der Membrankammer in eine bernsteinfarbene Röhre. Vom Licht bis zum Gebrauch blockieren.
- Wählen Sie einen EV-spezifischen Antikörper entsprechend dem Zweck des Assays aus (siehe Tabelle der Materialien).
2. Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten EVs für den EV-Aufnahmeassay
- Zielzellsaat und -kultur auf den zellkulturkompatiblen Schalen.
- Säen Sie 1 x 104 PC3-Zellen in die Mikrorutsch-8-Well-Platte (9,4 x 10,7 mm für jede Vertiefung) mit 0,2 ml Medien oder 4 x 104 PC3-Zellen in eine 35-mm-Schale mit 1 ml Medien. Die Zellen zu einer zellkulturverträglichen Schale aus einem dünnen Deckglas (Dicke: 0,18 mm) plattieren.
HINWEIS: Der dünne Deckglas minimiert die nachteilige Streuung des Lichts. - Lassen Sie die Zellen über Nacht unter optimalen Zellkulturbedingungen (37 °C, 5% CO2-Konzentration , 90% Luftfeuchtigkeit) haften.
- Adhärenzierte Zellen zweimal mit Exosomen-depletierten Medien waschen (beschrieben in Schritt 1.1.1).
- Säen Sie 1 x 104 PC3-Zellen in die Mikrorutsch-8-Well-Platte (9,4 x 10,7 mm für jede Vertiefung) mit 0,2 ml Medien oder 4 x 104 PC3-Zellen in eine 35-mm-Schale mit 1 ml Medien. Die Zellen zu einer zellkulturverträglichen Schale aus einem dünnen Deckglas (Dicke: 0,18 mm) plattieren.
- Zellinkubation mit fluoreszenzmarkierten EVs.
- Messen Sie die Konzentration fluoreszenzmarkierter EVs (Schritt 1.3.5) durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA, ergänzende Abbildung 1). Bestimmung der optimalen Konzentration fluoreszenzmarkierter EVs, die den kultivierten Zellen zugesetzt werden sollen (Schritt 2.1.2.).
- Verdünnen Sie die fluoreszierend markierten EVs mit Exosomen-depletierten Medien, um der in Schritt 2.2.1 gemessenen gewünschten Konzentration zu entsprechen. (d. h. 7,80 x 109 EVs (in NTA-Wert) in 200 μL exosomengereicherter Medien.)
- Die verdünnten EVs (Schritt 2.2.2) werden zu den nach 2.1.2 hergestellten anhaftenden Zielzellen gegeben. Inkubieren Sie für experimentelle Zeit (dh 4, 8 oder 12 h).
- Waschen Sie zellen dreimal mit exosomenfreien Medien, um nicht internalisierte EVs zu entfernen.
HINWEIS: Optional: Zellen können nach dem Waschen fixiert werden. - Markieren Sie das Zytoplasma der adhärenten Zellen mit 1 μg/ml CMTMR ((5-(und-6)-((((4-chlormethyl)benzoyl)amino) Tetramethylrhodamin) (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie unter optimalen Zellkulturbedingungen (37 °C, 5% CO2-Konzentration , 90% Luftfeuchtigkeit).
HINWEIS: Zellflächenfarbstoffe sollten getrennt von markierten EVs fluoreszieren, um die bestimmung der räumlichen Lage (internalisiert oder oberflächlich) der spiked EVs während des EV-Aufnahmeassays zu unterstützen. - Waschen Sie markierte Zellen zweimal mit Exosomen-depletierten Medien, um den Restfarbstoff zu entfernen. Fügen Sie den Zellen frische Exosomen-erschöpfte Medien hinzu, um sich auf die konfokale Bildgebung mit lebenden Zellen vorzubereiten.
3. Konfokale Mikroskopie
- Um Live-Cell-Imaging durchzuführen, verwenden Sie einen Inkubator auf der Bühne, um optimale Zellkulturbedingungen (37 °C, 5% CO2-Konzentration , 90% Luftfeuchtigkeit) aufrechtzuerhalten.
- Legen Sie die vorbereiteten Zellen in den Inkubator auf der Bühne.
- Legen Sie die Bildgebungsparameter basierend auf Kontrollproben fest.
HINWEIS: Zu den empfohlenen Kontrollproben gehören: Nur fluoreszenzmarkierte EVs, fluoreszenzmarkierte Zellen, nicht markierte EVs und nicht markierte Zellen. - Bestimmen Sie die Tiefe der Zielzellen und den Bereich der Stapelgröße in Z-Richtung, um konfokale 3D-Bilder zu erfassen.
HINWEIS: Die Dicke eines Z-Stacks beträgt 1 μm. Die konfokale 3D-Bildaufnahme dauerte 2 min 34 s (jede Z-Ebene-Bildaufnahme dauerte ca. 8 s; insgesamt zwanzig Z-Stack-Bilder). - Stellen Sie die Bildaufnahme auf mehrere z-gestapelte Bilder von zellspezifischem Farbstoff (d. h. Rot) und EV-spezifischem Farbstoff (d. h. Grün) gleichzeitig ein (Abbildung 3 und Abbildung 4A).
4. Bildverarbeitung
- Verwenden Sie eine automatische Bildverarbeitungssoftware, um die rohen z-gestapelten konfokalen Bilder zu analysieren und die EV-Aufnahme durch Zellen zu bestimmen (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie Schwellenwertparameter für das Fluoreszenzsignal der Zellen und EV-spezifische Farbstoffe ein. Erstellen Sie die virtuellen Oberflächen von Zellen (Abbildung 4A,B).
- Um die virtuellen Flächen von Zellen zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Flächen hinzufügen.
- Wählen Sie Berechnung der kürzesten Entfernung als "Algorithmuseinstellungen", um den von der Software bereitgestellten Algorithmus zu verwenden, und klicken Sie dann auf Weiter: Quellkanal.
- Wählen Sie in diesem Experiment Kanal 2 - CMTMR als "Quellkanal" aus.
- Wählen Sie "Glätten " und geben Sie den entsprechenden Wert in "Oberflächendetails" ein, um die Oberfläche zu glätten.
HINWEIS: 0,57 μm in diesem Experiment, da 1 Pixel 0,57 μm in Rohbilddaten darstellt. - Wählen Sie Absolute Intensität als "Schwellenwert".
- Um das Fluoreszenzbild automatisch durch den bereitgestellten Algorithmus zu schmollen, klicken Sie auf Schwellenwert (Absolute Intensität): Der Wert wird automatisch festgelegt.
- Wählen Sie Aktivieren als "Sich berührende Objekte aufteilen (Region wachsen)" und geben Sie den Wert der geschätzten Zellgröße in "Seed Points Diameter", 10,0 μm in diesem Experiment, ein. Klicken Sie dann auf Weiter: Seed Points filtern.
- Um die virtuellen Zellenoberflächen zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche + Hinzufügen und wählen Sie dann Qualität als "Filtertyp" aus. Schwellenwert für den entsprechenden Wert (210 in diesem Experiment) für den niedrigen Grenzwert durch eine Visuelle Inspektion und den Höchstwert (1485) für den oberen Grenzwert, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Fertig stellen .
HINWEIS: Eine visuelle Inspektion bedeutet, dass ein Forscher den Zellbereich von einem rohen Fluoreszenzbild unterscheiden kann. - Um die virtuellen Punkte von Elektrofahrzeugen zu erstellen, klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Neue Spots hinzufügen.
- Wählen Sie verschiedene Spotgrößen (Region wächst) und Berechnung der kürzesten Entfernung als "Algorithmuseinstellungen" aus und klicken Sie dann auf Weiter: Quellkanal.
- Wählen Sie in diesem Experiment Kanal 1 - Alexa Fluor 488 als "Quellkanal" aus.
- Geben Sie den entsprechenden Wert in "Geschätzter XY-Durchmesser" für die Spot-Detektion ein, 1 μm in diesem Experiment. Klicken Sie dann auf Weiter: Spots filtern.
- Um die virtuellen EV-Punkte zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche + Hinzufügen , wählen Sie Qualität als "Filtertyp" und legen Sie "Unterer Schwellenwert" durch eine visuelle Inspektion fest, 100 in diesem Experiment. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Weiter: Spot-Bereichstyp .
- Wählen Sie Absolute Intensität als "Punktbereichstyp" aus, und klicken Sie dann auf Weiter: Punktbereiche.
- Um den Bereich der EV-Punkte zu minimieren, geben Sie den entsprechenden Wert durch eine visuelle Inspektion in "Region Threshold" ein, 100 als "Region Threshold" in diesem Experiment.
HINWEIS: Eine visuelle Inspektion bedeutet, dass ein Forscher den EVs-Bereich von einem rohen Fluoreszenzbild unterscheiden kann. - Wählen Sie Bereichsvolumen als "Durchmesser von" aus, und klicken Sie dann auf Fertig stellen.
- Verwenden Sie die von der Software bereitgestellten Algorithmen, um die gruppierten Punkte innerhalb der bebauten Oberfläche in Schritt 4.2 aufzuteilen (Abbildung 4C, i-iv).
- Klicken Sie auf die erstellten Spots und gehen Sie dann zu Filter.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche + Hinzufügen , wählen Sie dann Kürzeste Entfernung zu Flächen Flächen = Fläche 1 als Filtertyp aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Auswahl auf neue Spots duplizieren . Der niedrigste Schwellenwert (-7,0 in diesem Experiment) für den niedrigen Grenzwert und der entsprechende Wert (-0,5) für den oberen Grenzwert.
HINWEIS: Legen Sie die Obergrenze mit dem geschätzten Radius von Spots fest. In diesem Experiment wurde der geschätzte Durchmesser von Spots, d.h. EV-Punkten, in Schritt 4.2.11 auf 1 μm gesetzt; somit kann die Obergrenze 0,5 betragen.
- Automatische Zählung von Elektrofahrzeugen in den Zellen
HINWEIS: Die Software zählt automatisch die Anzahl der EVs in den Zellen und gibt die Anzahl an, die von den Zielzellen verinnerlicht wird.- Klicken Sie auf die Ausgewählte "Erstellte Spots 1" [Kürzeste Entfernung zu Flächenflächen = Flächen 1 zwischen -7,00 und -0,500].
- Gehen Sie zu den Statistiken und exportieren Sie den Wert aus "Gesamtzahl der Spots"
HINWEIS: Die von der Software bereitgestellten Algorithmen berechnen automatisch die Anzahl und das Volumen der Zellen.
- Bestimmen Sie die Ausbeute der EV-Aufnahme pro Inkubationszeit basierend auf den oben berechneten Werten (Abbildung 5).
- Um die Anzahl der Zellen zu erhalten, klicken Sie auf die erstellten Flächen 1, gehen Sie dann zu Statistik und exportieren Sie den Wert "Gesamtzahl der Flächen" aus Gesamt.
- Gehen Sie zu Detailed in Statistics , um das Volume aus Detailed zu exportieren.
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Representative Results
Unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts auf Nanofiltrationsbasis wurden EVs aus PC3 CCM isoliert und mit einem fluorophorkonjugierten EV-spezifischen (CD63) Antikörper markiert (Abbildung 1). Die markierten EVs wurden erfolgreich durch die konfokale 3D-Mikroskopie visualisiert (Abbildung 2). Die markierten EVs wurden mehrere Stunden lang mit Zellen in Exosomen-depletierten Medien inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit Exosomen-depletierten Medien gewaschen. Die restlichen EVs wurden während der Inkubation verinnerlicht oder an Zellen geklebt. Der Zellbereich wurde beschriftet. Internalisierte EVs wurden als puncta19,20,24,27 und ein individuelles EV visualisiert (Abbildung 3 und Abbildung 4A). Die Nachbearbeitung dieser Bilder ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der EV-Internalisierung in die Zellen (Abbildung 4). Die Schritte in Verbindung ermöglichen eine genaue Ev-Aufnahmeuntersuchung, die effizient durchgeführt wird. Abbildung 5 zeigt die repräsentativen Ergebnisse des EV-Aufnahmetests. Der Assay zeigt, dass die Höhe der EV-Aufnahme von der Länge der Inkubationszeit abhängt. Das Verfahren ermöglicht den systematischen Ausschluss von nicht internalisierten Elektrofahrzeugen (Abbildung 4C), um die Anzahl der internalisierten Elektrofahrzeuge genau zu messen. Die Größenverteilung der verinnerlichten EV-Punkte wurde berechnet (Abbildung 6). Darüber hinaus kann die Anzahl der internalisierten EVs auf das Volumen der Empfängerzellen normalisiert werden, um die tatsächliche Rate der EV-Aufnahme für die spezifische Zelle zu bestimmen. Die Normalisierung berücksichtigt die heterogene Zellgröße und stellt die Anzahl der internalisierten EVs in Bezug auf die Zelloberfläche dar. Die Zelloberfläche ist definiert als die Zellfläche, die während der Inkubation mit EV-spiked, exosomen-depleted Kulturmedien in Kontakt kommt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der EV-Isolierung und On-Chip-Markierung mit einem nanofiltrationsbasierten mikrofluidischen Gerät. (A) Isolierung von Elektrofahrzeugen von CCM. (B) On-Chip-Immunfluoreszenzkennzeichnung von Elektrofahrzeugen. (C) Entfernung von ungebundenen Antikörpern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Abbildung von fluoreszierend markierten Elektrofahrzeugen. Die fluoreszenzmarkierten (Anti-CD63-Alexa Fluor 488) EVs wurden mit dem konfokalen Mikroskop (40x Objektiv) nachgewiesen. (A) Positive Probe (Anti-CD63-Alexa Fluor 488 gekennzeichnete EVs). (B) Negativkontrolle 1 für die EV-Markierung (nur EVs mit 2. Antikörper (Alexa Fluor 488), ohne 1. Antikörper). (C) Negativkontrolle 2 (EVs mit dem Maus (MS) IgG-Antikörper und dem 2. Antikörper (Alexa Fluor 488)). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Abbildung der internalisierten EVs in Zellen in einem 2D-Bild. (A) Die fluoreszierend markierten (Anti-CD63-Alexa Fluor 488, grün) EVs und die Zellen (CMTMR, rot) wurden nach der Inkubation mit dem konfokalen Mikroskop (20x Objektiv) nachgewiesen. (B) Nur ein separates Bild der fluoreszenzmarkierten EVs. (C) Nur ein separates Bild der fluoreszierend markierten Zellen. Die Anregungs-/Emissionslaserwellenlängen für CMTMR und Alexa Fluor 488 betragen 560,6/595 (±50) nm und 487,8/525 (±50) nm. Die Laserleistungseinstellungen betragen 3,0 % für CMTMR und 10,0 % für Alexa Fluor 488. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantifizierung der internalisierten EVs durch das Post-Imaging-Verfahren. (A) Konfokales Rohbild aus dem EV-Aufnahmeassay. (B) Virtuelle Darstellung der Elektrofahrzeuge als Punkt (grün) und der Zellen als Oberfläche (rot) unter Verwendung der Bildverarbeitungssoftware. (C, i-iv) Unterscheidung der verinnerlichten EVs (gelbe Punkte) und nicht internalisierten EVs (grüne Punkte, weißer Pfeil) mit dem von der Software bereitgestellten Algorithmus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die Menge der EV-Aufnahme als Funktion der Inkubationszeit. (A) Die Anzahl der internalisierten EVs pro Zelle. (B) Die Anzahl der internalisierten EVs pro Zellvolumen. Die Anzahl der internalisierten EVs wurde in Abhängigkeit von der Inkubationszeit erhöht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Die Größenverteilung von internalisierten EV-Punkten. Die Größe der EV-Punkte wurde gemessen und zu einer Verteilung aufgetragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: NTA-Messung von Anti-CD63-Alex Fluor 488 gekennzeichneten Elektrofahrzeugen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Die Anzahl der kolokalisierten EVs mit Lysosomen als Funktion der Inkubationszeit. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Die Menge der EV-Aufnahme in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. (A) Die Anzahl der internalisierten EVs pro Zelle. (B) Die Anzahl der internalisierten EVs pro Zellvolumen. Die Anzahl der internalisierten EVs wurde in Abhängigkeit von der Inkubationszeit erhöht. Die EV-Probe wurde mit RNA-Färbefarbstoff markiert (siehe Materialtabelle). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Ein EV-Aufnahmeassay, der auf 3D-Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie basiert, bietet eine effiziente Methodik und empfindliche Analyse. Diese fluoreszierende EV-Markierung erleichtert die Visualisierung von Elektrofahrzeugen und führt erfolgreich einen präzisen EV-Aufnahmeassay durch. Frühere Methoden zur Kennzeichnung von Elektrofahrzeugen und zur Entfernung des Restfarbstoffs wurden durch Entfernen der Fällung mittels Ultrazentrifugation (UC) berichtet; UC kann jedoch EVs mitausfällen, und der immobilisierte Farbstoff kann zu einem falsch-positiven Signal führen12,13. Nanofiltrationsbasierte mikrofluidische Geräte eliminieren diese co-fällung von EVs und Farbstoffen und verbessern so die Qualität der fluoreszenzmarkierten EVs und die Spezifität des Assays. Die EV-Aufnahme wurde durch volumetrische Analyse gemessen, um die internalisierten EVs getrennt von oberflächlichen EVs auf der Zelloberfläche zu unterscheiden und zu quantifizieren. Die volumetrische Analyse der EV-Aufnahme ermöglicht die Normalisierung der EV-Aufnahme nach Zellgröße. Der Live-Cell EV Uptake Assay wurde durch die Verwendung des konfokalen Mikroskop-Inkubators auf der Bühne erreicht. Das Protokoll gilt für Studien, die lebende Zellkulturen und EVs erfordern. Intrazelluläres EV-Tracking in Echtzeit kann über ein 3D-Fenster hinweg durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die EV-Trafficking-Analyse der räumlich-zeitlichen Auflösung zusammen mit der Kolokalisierung von EVs mit subzellulären Organellen durch das Protokoll erreicht werden (ergänzende Abbildung 2). Das hier beschriebene Protokoll ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die zelluläre Analyse von Elektrofahrzeugen.
Trotz aller Vorteile des Protokolls gibt es mögliche Einschränkungen. Das in dieser Studie verwendete mikrofluidische Nanofiltrationsgerät kann während der EV-Isolierung andere Verunreinigungen co-isolieren. Low-Density-Lipoproteine sind ähnlich groß wie EVs und können während der Isolierung in der Membran eingefangen werden28. Obwohl EV-spezifische Marker EVs spezifizieren können, können die co-isolierten Verunreinigungen die nachgeschaltete Analyse beeinflussen. In diesem Manuskript wurden EVs mit einem CD63 konjugierten Alexa Fluor 488 Farbstoff beschriftet. Diese Kennzeichnung erhöht die Spezifität für die EV-Erkennung; Es bindet jedoch auch das EV-Oberflächenmolekül und erhöht die Kompetitionsbindung. Darüber hinaus kann der Grad der EV-Aufnahme von der Zelllinie und CCM abhängen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Markierungsmethoden können an andere Färbefarbstoffe wie lipophile Farbstoffe, zytosolische Farbstoffe und RNA-Farbstoffe angepasst werden (ergänzende Abbildung 3). Das Protokoll verwendet ein lichtscannendes konfokales Mikroskop (LSCM), um das winzige Signal von Elektrofahrzeugen zu erkennen. LSCM beruht auf intensiven Lasern und infolgedessen können lebende Zellen durch langfristige Laseranregung beschädigt oder verändert werden. Die schnelle Erfassungsgeschwindigkeit kann photoschäden durch die Verwendung eines spinnenden konfokalen Scheibenmikroskops (SDCM) verringern. SDCM kann auch im EV-Tracking verwendet werden, das eine kurze Zeitraffer-Bildgebung erfordert, um Bewegungen auf kurze Entfernungen zu visualisieren.
Trotz dieser potenziellen Einschränkungen bietet das vorgeschlagene Protokoll eine effiziente Methode zur Bewertung der EV-Aufnahme und hat das Potenzial für eine weitere Live-Cell-EV-Tracking-Analyse.
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Disclosures
Y.-K. Cho ist ein Erfinder der Patente auf das nanofiltrationsbasierte mikrofluidische Gerät Exodisc, die an Labspinner (Ulsan, Korea) lizenziert sind. Alle anderen Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch NGI-Fördernummern unterstützt. U54CA143803, CA163124, CA093900 und CA143055 an K. J. P. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, das vom Ministerium für Gesundheit und Soziales der Republik Korea finanziert wurde (Fördernummer: HI19C1122). Arbeiten von J. Kim und Y.-K. Cho wurde vom Institute for Basic Science (IBS-R020-D1) unterstützt, das von der koreanischen Regierung finanziert wurde. Die Autoren danken den aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Brady Urological Institute, insbesondere den Mitgliedern des Pienta-Amend-Labors, für die kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
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