Summary
세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.
Abstract
세포의 세포 외 소포 (EV) 섭취량을 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이가 필요합니다. EV 섭취량은 다양한 연구 분야에서 세포간 통신에 중요한 역할을 합니다. 암 생물학, 신경 과학 및 약물 전달. 많은 EV 섭취량 은 문학에서 보고되었습니다. 그러나 실용적이고 상세한 실험 방법론이 부족합니다. EV 섭취량은 형광 라벨을 부착하여 세포 내의 위치를 감지하여 평가할 수 있습니다. 세포의 내이화 된 전기와 셀의 피상적 인 전기를 구별하는 것은 EV 섭취량을 정확하게 결정하는 것이 어렵지만 중요합니다. 따라서, 3차원(3D) 형광 공초점 현미경을 통해 EV 의 섭취를 효율적으로 정량화하는 분석이 이 작품에서 제안된다. 형광 라벨이 부착된 전기는 나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여 제조되었으며, 3D 공초점 현미경검사법에 의해 시각화된 다음 고급 이미지 처리 소프트웨어를 통해 분석하였다. 이 프로토콜은 셀룰러 수준에서 전기를 분석하기 위한 강력한 방법론과 효율적인 분석을 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
세포외 소포(EV)는 나노 크기의 지질 막 결합 입자로, 이독(100-500 nm) 및 엑소좀(50-150 nm)1의 크기로 분류된다. 전기 는 단백질, 핵산 및 지질과 같은 다양한 생체 분자를 포함합니다. 이 생체 분자는 화물로 캡슐화 되고 EVs1,2,3을 통해 세포 외 공간으로 방출되기 전에 세포에서 유래합니다.
그들의 화물의 다양성때문에, 전기는 세포 간 통신에 적극적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 세포별 전기자동차의 방출 및 섭취는 세포 4,5 사이의 생체 분자의 전달을 허용한다. 셀에 EV 화물을 도입하면 수신자 셀의 기능 및 근종 상태를 변경할 수 있습니다4,5,6. 전기 자동차는 여러 경로를 통해 내면화됩니다. 그러나 정확한 메커니즘은 정확하게 입증되지 않았습니다.
유전 적 태깅, 형광 라벨 개별 EVs7과 같은 EV 섭취량 소의 대다수. 결과 신호는 마이크로 플레이트 광미터, 유동 세포측정법 또는 현미경 검사법으로 측정할 수 있으며 각 기술은 상당한 한계를 가지고 있습니다. 마이크로 플레이트 광계, 유동 세포측정, 또는 표준 2차원(2D) 현미경 검사는 내재및 피상적으로 부착된 EV8,9을 구별할 수 없다. 또한 이러한 각 기술에 필요한 샘플 준비는 EV uptake 평가에 추가 적인 문제를 야기할 수 있습니다. 예를 들어, EV 섭취량 분석 전에 트립신으로 부착된 셀을 리프팅하면 셀 표면에 일부 피상적으로 부착된 EV가 갈라질 수 있습니다10,11. 트립신은 또한 세포 표면과 상호 작용할 수 있습니다., 세포 및 EV 표현형에 영향을 미치는. 또한 트립신은 피상적 인 전기 를 완전히 분리하여 격리 된 인구를 왜곡하지 않을 수 있습니다.
형광염염으로 전기자동차에 정확하게 라벨을 붙이려면 잔류 염료7을 제거하기 위해 추가 세척 단계가 필요합니다. 허용된 격리 기술은 EV 격리 중에 발생하는 응고로 인한 거짓 긍정 신호에도 기여할 수 있습니다. 예를 들어, 직렬 초원심분리(UC)는 널리 전기를 분리하고 고정된 염료를 제거하는 데 사용된다. 그러나, UC는 전기자동차를 공동 침전시킬 수 있으며, 잔류염은 거짓 양성 신호12,13로 이어질 수 있다. 컬럼 계 여과와 같은 다른 나노 여과 방법도 비 고정 염료 제거에 널리 사용됩니다. 컬럼 매트릭스 내에서 상호 작용하는 전기 및 염료의 복잡한 특성은 복잡한 입력14,15,16에 의해 변경되는 컬럼의 분자 차단으로 인해 잔류 염료의 불완전한 제거로 이어질 수 있다.
현재 프로토콜은 형광 으로 표시된 절연 된 전기 를 분리하고 세척하기 위해 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치를 제안합니다. 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치는 유체 보조 분리 기술 (FAST)17,18을 통해 효율적인 여과를 제공 할 수 있습니다. FAST는 필터 전체의 압력 강하를 줄여 EV와 염료 간의 잠재적 집계를 줄입니다. 잔류 염료를 효율적으로 제거함으로써 형광라벨이 부착된 EV의 품질과 분석의 특이성을 향상시킬 수 있습니다.
공초점 현미경 검사는 세포 표면에 내재화 및 피상적으로 부착된 EV를 구별하고 지각 측량 해상도19,20,21,22,23,24,25에서 EV 섭취량의 세포 메커니즘을 포괄적으로 조사할 수 있다. 예를 들어, Sung et al.은 개발된 라이브 셀 리포터를 사용하여 엑소솜 라이프사이클의 시각화를 설명했습니다. 내부화된 전기자동차의 위치는 공초점 현미경을 3차원(3D) 및 후이미지 처리 툴20으로 검출및 분석하였다. 소형 전기자동차(40-200nm)의 크기는 광학 현미경의 해상도 한계 미만이지만, 광검출기가 향상된 형광 방출을 감지할 수 있기 때문에 형광표시 전기자동차는 공초점 현미경으로 검출될 수 있다. 따라서, 세포 내형 표지된 전기자동차의 세포세포 소중화는 전기자동차와 주변 세포 기관의 여러 z-stacked 이미지를 획득함으로써 정확하게 결정될 수 있다.
또한 3D 재구성 및 사후 데이터 처리는 내부화, 피상적 및 자유 부동 EV의 위치에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. 공초점 현미경 검사법에 의해 제공되는 시간 경과 라이브 셀 이미징과 함께 이러한 프로세스를 활용하여 EV 섭취량의 수준을 정확하게 평가할 수 있으며 EV 섭취량의 실시간 추적도 가능합니다. 또한, EV 인신 매매 분석은 세포내 기능에 내재된 전기자동차가 어떻게 관여하는지 결정하는 첫 번째 단계인 세포기관과 함께 전기자동차의 공동 국소화를 평가함으로써 공초점 현미경을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치17,26, 공초점 현미경 검사법 및 사후 이미지 분석을 사용하여 EV 섭취량 분석을 수행하는 방법론을 설명합니다.
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Protocol
1. EV 절연 및 온칩 면역 형광 EV 라벨링
- EV 절연을 위한 세포 배양 매체(CCM) 및 CCM의 사전 처리
- 종자 PC3 세포는 75cm2 세포 배양 플라스크에서 30% 합류한다. 제어 세포가 표준 미디어 및 세포 선별 보충제에서 90%의 합류(~48h)로 증가하도록 허용합니다.
참고: EV 함유 성분이 세포 섭취(즉, 태아 소 혈청)에 영향을 미치지 않도록 하려면 외성 고갈된 미디어와 보충제를 사용하십시오. - CCM을 수확하십시오.
- CCM을 실온(RT)에서 10 분 동안 10분 동안 원심분리하여 부착되지 않은 세포와 미디어로 수확한 큰 파편을 펠렛합니다. 상체를 새로운 원식 튜브로 옮는다.
- 새로운 튜브에서, 원심 분리는 미디어에 남아있는 작은 파편과 자멸 체를 펠릿4 °C에서 20 분 동안 10,000 x g 에서 상류체를 분리합니다. 일부 더 큰 전기 자동차는 펠릿 것입니다. 상체를 새 튜브로 옮기습니다.
- 0.45 μm 수성 소수성 폴리비닐리덴 불소(PVDF) 멤브레인 주사기 필터를 통해 상체를 필터링합니다.
참고: EV 절연을 위해 CCM을 즉시 처리하지 않을 경우, 격리가 수행될 때까지 미리 처리된 CCM을 -80°C에 저장합니다. 동결된 경우 동결 해동 주기를 하나로 제한합니다.
- 종자 PC3 세포는 75cm2 세포 배양 플라스크에서 30% 합류한다. 제어 세포가 표준 미디어 및 세포 선별 보충제에서 90%의 합류(~48h)로 증가하도록 허용합니다.
- 나노 여과 기반 미세 유체 장치를 사용하여 CCM에서 EV 절연
- 동결된 경우 1.2.2단계 전에 CCM및 소용돌이를 30초로 완전히 해동합니다.
- 나노 여과 계 미세 유체 장치의 샘플 챔버에 미리 처리 된 CCM (1.1 단계)의 1 mL을 주입 (재료의 표 참조)17,26.
참고: 나노 여과 계 미세 유체 장치에 대한 표준 작동 절차를 따르십시오17,26. - 3000 rpm에서 10분 동안 벤치 탑 방적 기계( 재료 표 참조)에서 미세 유체 장치를 작동시킵니다.
참고: CCM이 초기 실행 후 샘플 챔버에 남아 있는 경우 모든 CCM이 샘플 챔버에서 비워지때까지 추가 회전을 수행합니다. - 파이프팅을 통해 폐기물 챔버에서 유체를 제거하고 1.2.1, 1.2.2 및 1.2.3 단계를 두 번 반복합니다.
참고: EV 격리를 위해 총 3mL의 CCM이 처리됩니다. - 1mL 인산염 완충식식염(PBS)을 샘플 챔버에 주입하여 격리된 전기를 세척합니다. 1.2.3 단계에서 언급한 바와 같이 미세 유체 장치를 작동하기 위한 벤치 탑 방적 기계에서 회전하십시오. 장치의 멤브레인에서 순수 한 전기 를 찾습니다.
참고: 나노 여과 계 미세 유체 장치로부터 분리된 전기의 품질, 구체적으로는 전염 전자 현미경(TEM), 스캐닝 전자 현미경(SEM), 나노 입자 추적 분석(NTA), 구조화된 조명 현미경 검사, 효소-연결된 면역제 분석 및 실시간 PCR에 의해 종래의 UC 방법과 비교하여 확인되었다.
- 나노 여과 기반 미세 유체 장치를 사용하여 EV의 면역 형광 라벨링 (도 1)
- 분석의 목적에 따라 EV 특이적 항체를 선택 합니다(재료표 참조).
참고: 특정 항체는 EV-uptake 통로(즉, 내세포증)에 특정한 리간드 결합 부위를 방해할 수 있다. - 절연 된 전기 의 100 μL을 포함하는 장치의 용출 구멍에 EV 특이적 항체의 1 μg /mL을 주입합니다.
- 플레이트 셰이커에서 RT에서 어둠 속에서 1h를 배양하여 시료를 가로질러 항체의 균일한 분포를 보장합니다.
- 용출 구멍에 접착제 테이프를 부착합니다. 1mL PBS를 샘플 챔버에 주입하여 잔류 항체를 씻어내도록 한다.
- 샘플 챔버가 비어 날 때까지 장치를 3000 rpm에서 회전합니다. 파이펫팅을 통해 폐기물 챔버에서 유체를 제거합니다. 샘플 챔버에 1 mL PBS를 주입합니다.
참고: 형광 표시 된 전기 는 멤브레인 챔버에 위치합니다. - 피펫은 멤브레인 챔버에서 호박색 튜브로 형광 표시 된 전기 자동차 (그림 2)를 피펫. 사용까지 빛에서 차단합니다.
- 분석의 목적에 따라 EV 특이적 항체를 선택 합니다(재료표 참조).
2. EV-uptake 분석에 대한 형광 라벨 이드 EV를 가진 세포의 인큐베이션
- 세포 배양 호환 접시에 세포 종자 및 배양을 대상으로 합니다.
- 종자 1 x 104 PC3 셀 마이크로 슬라이드 8 웰 플레이트 (각 우물에 대 한 9.4 x 10.7 mm) 와 함께 0.2 mL 미디어 또는 4 x 104 PC3 셀 35 mm 접시에 1 mL 미디어. 얇은 커버슬립(두께: 0.18mm)으로 구성된 세포 배양 호환 접시에 세포를 플레이트한다.
참고: 얇은 커버슬립은 빛의 불리한 산란을 최소화합니다. - 세포가 최적의 세포 배양 조건(37°C, 5% CO2 농도, 습도 90%)에서 하룻밤 동안 부착할 수 있도록 합니다.
- 부착된 세포를 외성 고갈 된 매체로 두 번 세척하십시오 (1.1.1 단계에서 설명됨).
- 종자 1 x 104 PC3 셀 마이크로 슬라이드 8 웰 플레이트 (각 우물에 대 한 9.4 x 10.7 mm) 와 함께 0.2 mL 미디어 또는 4 x 104 PC3 셀 35 mm 접시에 1 mL 미디어. 얇은 커버슬립(두께: 0.18mm)으로 구성된 세포 배양 호환 접시에 세포를 플레이트한다.
- 형광 라벨이 부착된 전기 를 가진 세포 잠복기.
- 나노입자 추적 분석(NTA, 보충도 1)에 의한 형광 표지 된 전기 자동차 (단계 1.3.5)의 농도를 측정합니다. 배양된 세포에 첨가할 형광표지 EV의 최적 농도를 결정한다(단계 2.1.2.).
- 2.2.1 단계에서 측정된 원하는 농도에 맞게 형광라벨이 부착된 전기를 외성 고갈된 매체로 희석시켰다. (즉, 외종 고갈 된 미디어의 200 μL에서 7.80 x 109 EV (NTA 값).
- 2.1.2에서 제조된 부착된 표적 셀에 희석된 전기자동차(2.2.2단계)를 추가한다. 실험 시간(예: 4, 8 또는 12h)을 위해 배양합니다.
- 세포는 외성 이없는 매체로 세 번 씻어 내면화되지 않은 전기 를 제거합니다.
참고: 선택 사항: 세척 후 셀을 고정할 수 있습니다. - CMTMR의 1 μg/mL((5-(및-6)-((4-클로로메틸)벤조딘)의 아미노)를 부착한 세포의 세포질에 라벨을 부착하고 최적의 세포 배양 조건(37°C, 5% CO2 농도, 90%의 습도)에서 배양한다.
참고: 세포 영역 염료는 EV 섭취량 분석 중에 스파이크 된 EV의 공간 위치 (내부 화 또는 피상적)를 결정하는 데 도움이되기 위해 레이블이 부착 된 전기 와 별도로 형광해야합니다. - 잔류 염료를 제거하기 위해 외성 고갈 된 매체로 두 번 표지 된 세포를 씻으면. 살아있는 세포 공초점 화상 진찰을 위한 준비에 있는 세포에 신선한 엑소좀 고갈된 매체를 추가합니다.
3. 공초점 현미경 검사법
- 라이브 셀 이미징을 수행하려면 단계별 인큐베이터를 활용하여 최적의 세포 배양 조건(37°C, 5% CO2 농도, 습도 90%)을 유지합니다.
- 준비된 셀을 단계 인큐베이터에 놓습니다.
- 제어 샘플을 기반으로 이미징 매개 변수를 설정합니다.
참고: 제안된 대조군 샘플은 다음과 같습니다: 형광 표지된 전기 전용, 형광 표시 셀, 라벨이 없는 전기 자동차 및 표지되지 않은 세포. - 3D 공초점 이미지를 획득하기 위해 대상 셀의 깊이와 z 방향으로 스태킹 크기 범위를 결정합니다.
참고: Z 스택의 두께는 1 μm입니다. 공초점 3D 이미지 수집은 2분 34초(각 Z-평면 이미지 수집은 약 8s, 총 20개의 Z 스택 이미지)를 지속했습니다. - 셀 별 염료(즉, 빨간색) 및 EV 특이적 염료(즉, 녹색)의 여러 z 스택 이미지로 이미지 수집을 동시에 설정합니다(그림 3 및 도 4A).
4. 이미지 처리
- 자동 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 원시 z 스택 된 공초점 이미지를 분석하고 셀별 EV 조리를 결정합니다 ( 재료 표 참조).
- 세포 및 EV 특이적 염료의 형광 신호로 임계값 매개변수를 설정합니다. 셀의 가상 표면을 빌드합니다(그림 4A,B).
- 셀의 가상 표면을 빌드하려면 새 Surface를 추가하는 단추를 클릭합니다.
- 소프트웨어에서 제공된 알고리즘을 사용하여 "알고리즘 설정"으로 최단 거리 계산 을 선택한 다음 : 소스 채널을 클릭합니다.
- 이 실험에서 채널 2 - CMTMR 을 "소스 채널"로 선택합니다.
- 매끄럽게 선택하고 적절한 값을 표면 스무딩을 위해 "표면 세부 사항"에 넣습니다.
참고: 이 실험에서 0.57 μm은 1픽셀 이후 원시 이미징 데이터에서 0.57 μm을 나타낸다. - 절대 강도를 "임계값"으로 선택합니다.
- 제공된 알고리즘에 의해 형광 이미지를 자동으로 임계값을 설정하려면 임계값(절대 강도)을 클릭합니다.
- "분할 접촉 객체(영역 성장)"로 사용하려면 이 실험에서 추정 셀 크기의 값을 "시드 포인트 직경"에 10.0 μm로 넣습니다. 그런 다음 을 클릭합니다: 시드 포인트를 필터링합니다.
- 가상 셀 표면을 구성하려면 버튼을 클릭한 다음 품질을 "필터 유형"으로 선택합니다. 육안 검사에 의해 낮은 제한에 대한 적절한 값(210)과 상한에 대한 최대 값(1485)을 임계값으로 임계값을 정한 다음 완료 단추를 클릭 합니다 .
참고: 육안 검사는 연구원이 원시 형광 이미지에서 세포 영역을 구별할 수 있음을 의미합니다. - 다음으로, EV의 가상 점을 구축하려면 버튼을 클릭하여 새 스팟 추가를 클릭합니다.
- 다른 스팟 크기(영역 증가) 및 최단 거리 계산을 "알고리즘 설정"으로 선택한 다음: 소스 채널을 클릭합니다.
- 채널 1선택 - 알렉사 플루어 488을 이 실험에서 "소스 채널"로 선택합니다.
- 이 실험에서 현물 검출을 위한 "추정 된 XY 직경 "에 적절한 값을 넣습니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다: 반점을 필터링합니다.
- 가상 EV 점을 구성하려면 버튼을 클릭하고 품질을 "필터 유형"으로 선택하고 육안으로 검사하여 "낮은 임계값 "을 설정 합니다. 그런 다음 : 스팟 리전 유형 단추를 클릭합니다.
- 절대 강도를 "스팟 리전 유형"으로 선택한 다음: 스팟 리전을 클릭합니다.
- 임계값에 따라 EV 점 영역은 육안으로 검사하여 적절한 값을 "지역 임계값"에 넣고 100 을 이 실험에서 "지역 임계값"으로 설정합니다.
참고: 육안 검사는 연구원이 원시 형광 이미지에서 EV 영역을 구별할 수 있음을 의미합니다. - 지역 볼륨을 "직경에서"로 선택한 다음 마무리를 클릭합니다.
- 소프트웨어의 제공된 알고리즘을 사용하여 4.2단계에서 내장된 표면 내부의 그룹화 된 스팟을 분할합니다(그림 4C, i-iv).
- 내장된 스팟을 클릭한 다음 필터로 이동 합니다.
- 클릭 + 추가 버튼을 클릭한 다음 표면 표면에 가장 짧은 거리를 선택한 다음 표면 1을 필터 유형으로 선택한 다음 중복 선택을 새 스팟 버튼으로 클릭합니다. 낮은 제한에 대한 최저 임계값(-7.0)과 상한에 대한 적절한 값(-0.5)입니다.
참고: 스팟의 예상 반지름으로 상한을 설정 합니다. 이 실험에서, 스팟의 추정 직경, 즉, EV 점, 단계 4.2.11에서 1 μm 로 설정되었다. 따라서 상한은 0.5일 수 있다.
- 셀 내부의 자동 전기 자동차 수
참고: 소프트웨어는 셀 내부의 전기 자동차 수를 자동으로 계산하여 대상 셀에 의해 내부화된 숫자를 나타냅니다.- 구축된 스팟 1 선택 영역을 클릭합니다[서피스에 대한 가장 짧은 거리 = -7.00과 -0.500 사이의 서피스 1]을 클릭합니다.
- 통계로 이동하여 "총 반점 수"에서 값을 내보냅니다.
참고: 소프트웨어가 제공한 알고리즘은 셀의 수와 볼륨을 자동으로 계산합니다.
- 위에서 계산한 값에 따라 인큐베이션 기간당 EV 섭취량의 수익률을 결정합니다(그림 5).
- 셀 수를 얻으려면 빌드된 Surfaces 1을 클릭한 다음 통계로 이동하여 전체에서 "총 표면 수"의 값을 내보냅니다.
- 자세한 통계로 세부으로 이동하여 세부에서 볼륨을 내보냅니다.
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Representative Results
나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여, 전기는 PC3 CCM에서 분리되고 불소 -컨쥬게이트 EV 특이적 (CD63) 항체로 표시되었다 (도 1). 표지된 EV는 3D 공초점 현미경 검사법(그림 2)에 의해 성공적으로 시각화되었습니다. 표지된 전기 는 엑소좀 고갈된 매체에서 몇 시간 동안 세포로 배양되었다. 배양 후, 세포는 엑소좀 고갈된 매체로 세척하였다. 나머지 EV는 인큐베이션 중에 내부화되거나 세포에 부착되었습니다. 셀 영역이 레이블이 지정되었습니다. 내화 된 전기는 말장난19,20,24,27 및 개별 EV (그림 3 및 그림 4A)로 시각화되었습니다. 이러한 이미지의 후처리는 EV 내재화의 시각화 및 정량화를 셀로 할 수 있게 한다(도 4). 이와 함께 하는 단계는 정확한 EV 업테이크 분석이 효율적으로 수행될 수 있도록 합니다. 도 5는 EV 섭취량 분석의 대표적인 결과를 나타낸다. 분석은 EV 섭취량수준이 잠복기의 길이에 따라 달라지음을 나타냅니다. 이 절차를 통해 내부화되지 않은 EV(그림 4C)를 체계적으로 배제하여 내부화된 EV의 수를 정확하게 파악할 수 있습니다. 내부화된 EV 도트의 크기 분포가 계산되었습니다(그림 6). 더욱이, 내부화된 전기자동차의 수는 수신자 셀의 부피로 정규화되어 특정 셀에 대한 EV 섭취량의 실제 속도를 결정할 수 있다. 정규화는 이질적인 세포 크기를 차지하고 셀룰러 표면적과 관련된 내부화된 EV의 수를 나타냅니다. 셀룰러 표면영역은 인큐베이션 중에 EV 스파이크, 엑소좀 고갈된 배양 매체와 접촉하는 세포 영역으로 정의된다.
그림 1: 나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여 EV 절연 및 온칩 라벨링의 회로도 그림. (A) CCM에서 격리된 EV. (B) 온칩 면역형광 라벨링의 전기자동차. (C) 언바운드 항체의 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 형광 라벨이 부착된 EV의 이미징. 형광 표지 (안티 CD63-알렉사 플루오 488) 전기는 공초점 현미경 (40배 목표)을 사용하여 검출되었다. (A) 양성 샘플(안티 CD63-알렉사 플루어 488 라벨이 부착된 전기). (B) EV 라벨링에 대한 음극제 1(제1 항체 없이 2차 항체(Alexa Fluor 488)만 용이다. (C) 네거티브 대조군 2(마우스(MS)와 제2 항체(알렉사 플루어 488)를 가진 전기.). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 2D 이미지에서 세포로 내부화된 전기의 이미징. (A) 형광 표시(반대로 CD63-알렉사 형광기 488, 녹색) 전기자동차 및 세포(CMTMR, 적색)는 인큐베이션 후 공초점 현미경(20배 목표)을 사용하여 검출되었다. (B) 형광 라벨이 부착된 EV의 별도의 이미지입니다. (C) 형광표지 세포의 별도의 이미지만. CMTMR 및 알렉사 플루어 488의 흥분/방출 레이저 파장은 560.6/595(±50) nm 및 487.8/525(±50) nm이다. 레이저 전원 설정은 CMTMR의 경우 3.0%, 알렉사 플루어 488의 경우 10.0%입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 이미징 후 공정에 의한 내재화된 전기의 정량화. (A) EV-uptake 분석에서 얻은 원시 공초점 영상. (B) 이미지 처리 소프트웨어를 이용하여 전자를 도트(녹색) 및 셀을 표면(빨간색)으로 가상 렌더링한다. (C, i-iv) 소프트웨어 제공 알고리즘을 사용하여 내부화된 전기 자동차(노란색 점) 및 비내부화된 EV(녹색 점, 흰색 화살표)의 차별. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 잠복시간의 함수로서 EV 섭취량의 양입니다. (A) 셀당 내부화된 전기 자동차 의 수입니다. (B) 셀 볼륨당 내부화된 전기 의 개수입니다. 인큐베이션 시간에 따라 내부화된 전기의 수가 증가했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 내부화된 EV 점의 크기 분포입니다. EV 점의 크기를 측정하고 배포에 플롯했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 안티 CD63-알렉스 플루오 488 라벨 된 EV의 NTA 측정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2: 인큐베이션 시간의 함수로서 리소좀을 가진 공동 지역화된 전기의 양입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 잠복 시간의 함수로서 EV 섭취량의 양입니다. (A) 셀당 내부화된 전기 자동차 의 수입니다. (B) 셀 볼륨당 내부화된 전기 의 개수입니다. 인큐베이션 시간에 따라 내부화된 전기의 수가 증가했습니다. EV 샘플은 RNA 염색염에 의해 표지되었다( 재료표 참조). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
공초점 현미경 검사를 통한 3D 형광 이미징을 기반으로 하는 EV 섭취 분석법은 효율적인 방법론과 민감한 분석을 제공합니다. 이 형광 EV 라벨링은 EV의 시각화를 용이하게 하고 정확한 EV 업테이크 분석기를 성공적으로 수행합니다. EV 라벨링 및 잔류 염료 를 제거하기위한 이전 방법은 초음파 심립분리 (UC)를 사용하여 침전을 제거하여보고되었습니다. 그러나, UC는 전기자동차를 공동 침전시킬 수 있으며, 고정염은 거짓 양성 신호12,13로 이어질 수 있다. 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치는 이 전기 및 염료의 강수량을 제거하여 형광 라벨이 부착된 EV의 품질과 분석의 특이성을 향상시킵니다. EV 섭취량은 셀 표면의 피상적 EV와 분리된 내부화된 EV를 구별하고 정량화하기 위해 체적 분석에 의해 측정되었다. EV 섭취량의 체적 분석은 셀 크기별로 EV 섭취량의 정상화를 가능하게 합니다. 라이브 셀 EV 섭취량 분석은 단계 적 공초점 현미경 인큐베이터를 활용하여 달성되었다. 이 프로토콜은 살아있는 세포 배양 및 EV를 요구하는 연구에 적용됩니다. 실시간 셀룰러 내 EV 추적은 3D 창에서 수행될 수 있습니다. 또한, 세포외 세포기관을 가진 전기자동차의 공동 국소화와 함께 공간적-시간적 해상도의 EV 인신 매매 분석은 프로토콜을 통해 달성될 수 있다(보충 도 2). 여기에 설명된 프로토콜은 EV의 세포 분석을 위한 강력한 도구입니다.
프로토콜의 모든 장점에도 불구하고 잠재적인 제한이 있습니다. 본 연구에서 활용되는 나노 여과 미세 유체 장치는 EV 격리 중에 다른 오염 물질을 공동 분리할 수 있다. 저밀도 지단백은 EV와 크기가 유사하며 격리28 동안 막에 잡힐 수 있습니다. EV 특이적 마커는 EV를 지정할 수 있지만 공동 격리된 오염 물질은 다운스트림 분석에 영향을 줄 수 있습니다. 이 원고에서, 전기는 CD63 컨쥬게이드 알렉사 플루어 488 염료로 표시되었다. 이 라벨링은 EV 감지에 대한 특이성을 증가시킵니다. 그러나, 그것은 또한 EV 표면 분자를 결합 하 고 경쟁 바인딩을 증가. 또한, EV 섭취량의 수준은 세포주 및 CCM에 의존할 수 있다. 이 프로토콜에 상세히 설명된 라벨링 방법은 리포필성 염료, 세포염료 및 RNA 염료(보충도 3)와 같은 다른 염색염에 적응할 수 있다. 이 프로토콜은 광 스캐닝 공초점 현미경(LSCM)을 사용하여 전기 EV의 작은 신호를 감지합니다. LSCM은 강렬한 레이저에 의존하고, 그 결과, 살아있는 세포는 장기 레이저 여기에 의해 손상되거나 변경될 수 있습니다. 빠른 획득 속도는 회전 디스크 공초점 현미경(SDCM)을 활용하여 광피해를 감소시킬 수 있습니다. 단거리 움직임을 시각화하기 위해 짧은 시간 경과 이미징이 필요한 EV 추적에도 SDCM을 사용할 수 있습니다.
이러한 잠재적 제한에도 불구하고 제안된 프로토콜은 EV-uptake 평가를 위한 효율적인 방법을 제공하며 라이브 셀 EV 추적 분석을 추가로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
조대표는 나노여과계 미세유체장치 엑소디스크에 대한 특허를 발명한 것으로, Labspinner(울산, 한국)에 허가를 받았습니다. 다른 모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NCI 보조금 Nos에 의해 지원되었다. U54CA143803, CA163124, CA093900 및 CA143055 ~ K. J. P. 이 연구는 한국보건복지부의 지원을 받아 한국보건산업개발원(KHIDI)을 통해 한국보건기술R&D 사업의 지원(교부금 번호: HI19C1122)에 의해 지원되었다. 김제이와 Y.K. 조 대표는 한국 정부의 지원을 받아 기초과학연구소(IBS-R020-D1)의 지원을 받았다. 저자는 원고의 비판적 독서에 대한 브래디 비뇨기과 연구소의 현재와 과거 회원, 특히 피엔타 - 수정 연구소의 구성원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
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