Summary
Les vésicules extracellulaires (VE) contribuent à la biologie cellulaire et aux communications intercellulaires. Il est nécessaire de réaliser des tests pratiques pour visualiser et quantifier l’absorption des VE par les cellules. Le protocole actuel propose le test d’absorption ev en utilisant l’imagerie de fluorescence tridimensionnelle par microscopie confocale, après l’isolement EV par un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration.
Abstract
Il est nécessaire de réaliser des tests pratiques pour visualiser et quantifier l’absorption des vésicules extracellulaires (VE) des cellules. L’adoption des VE joue un rôle dans la communication intercellulaire dans divers domaines de recherche; biologie du cancer, neurosciences et administration de médicaments. De nombreux tests d’absorption des VE ont été rapportés dans la littérature; cependant, il y a un manque de méthodologie expérimentale pratique et détaillée. L’absorption des VE peut être évaluée en marquant les VE par fluorescence pour détecter leur emplacement dans les cellules. Il est difficile, mais essentiel, de faire la distinction entre les VE internalisés dans les cellules et les VE superficiels sur les cellules pour déterminer avec précision l’absorption des VE. Par conséquent, un test qui quantifie efficacement l’absorption des VE par microscopie confocale à fluorescence tridimensionnelle (3D) est proposé dans ce travail. Les véhicules électriques marqués par fluorescence ont été préparés à l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration, visualisés par microscopie confocale 3D, puis analysés à l’aide d’un logiciel de traitement d’image avancé. Le protocole fournit une méthodologie robuste pour l’analyse des véhicules électriques au niveau cellulaire et une approche pratique pour une analyse efficace.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules de taille nanométrique liées à la membrane lipidique qui sont classées en fonction de leur taille : ectosomes (100-500 nm) et exosomes (50-150 nm)1. Les VE contiennent diverses biomolécules, telles que des protéines, des acides nucléiques et des lipides. Ces biomolécules proviennent des cellules avant d’être encapsulées sous forme de cargaison et libérées dans l’espace extracellulaire via les VE1,2,3.
En raison de la variété de leur cargaison, on pense que les véhicules électriques jouent un rôle actif dans la communication intercellulaire. La libération et l’absorption des VE par les cellules permettent le transfert de biomolécules entre les cellules4,5. L’introduction de cargaison de VE dans une cellule peut modifier les fonctions et l’état homéostatique de la cellule réceptrice4,5,6. Les véhicules électriques sont internalisés par de multiples voies; cependant, les mécanismes exacts n’ont pas été démontrés avec précision.
La majorité des tests d’absorption des VE, tels que le marquage génétique, marquent fluorescent les VE individuels7. Le signal résultant peut être mesuré par photomètre à microplaques, cytométrie en flux ou microscopie, chaque technologie ayant des limites substantielles. Les photomètres à microplaques, la cytométrie en flux ou la microscopie bidimensionnelle (2D) standard ne peuvent pas faire la distinction entre les VE internalisés et les VE fixés superficiellement8,9. De plus, la préparation d’échantillons nécessaire pour chacune de ces techniques peut introduire des problèmes supplémentaires dans l’évaluation de l’absorption des VE. Par exemple, soulever des cellules adhérentes avec de la trypsine avant l’analyse de l’absorption des VE peut cliver certains VE fixés superficiellement à la surface de la cellule10,11. La trypsine peut également interagir avec la surface de la cellule, affectant le phénotype cellulaire et EV. De plus, la trypsine peut ne pas détacher complètement les VE superficiels, ce qui fausse les populations isolées.
Pour étiqueter avec précision les véhicules électriques avec des colorants fluorescents, des étapes de lavage supplémentaires sont nécessaires pour éliminer le colorant résiduel7. Les techniques d’isolement acceptées peuvent également contribuer à des signaux faussement positifs dus à la coagulation qui se produit pendant l’isolement EV. Par exemple, l’ultracentrifugation en série (CU) est largement utilisée pour isoler les véhicules électriques et éliminer le colorant immobilisé. Cependant, la CO peut co-précipiter les VE, et le colorant résiduel peut conduire à un signal faussement positif12,13. D’autres méthodes de nanofiltration, telles que la filtration sur colonne, sont également largement utilisées pour l’élimination des colorants non immobilisés. La nature complexe des VE et des colorants interagissant dans la matrice de la colonne peut entraîner l’élimination incomplète du colorant résiduel en raison de la coupure moléculaire de la colonne modifiée par l’entrée complexe14,15,16.
Le protocole actuel propose un dispositif microfluidique à base de nanofiltration pour isoler et laver les véhicules électriques isolés marqués par fluorescence. Le dispositif microfluidique à base de nanofiltration peut fournir une filtration efficace grâce à la technologie de séparation assistée par fluide (FAST)17,18. FAST réduit la perte de charge à travers le filtre, réduisant ainsi l’agrégation potentielle entre les véhicules électriques et les colorants. En éliminant efficacement les colorants résiduels, il est possible d’améliorer la qualité des véhicules électriques marqués par fluorescence et la spécificité du test.
La microscopie confocale permet de distinguer les VE internalisés et superficiellement attachés à la surface de la cellule et d’étudier de manière exhaustive les mécanismes cellulaires de l’absorption des VE dans une résolution spatio-temporelle19,20,21,22,23,24,25. Par exemple, Sung et al. ont décrit la visualisation du cycle de vie des exosomes à l’aide de leur rapporteur de cellules vivantes développé. L’emplacement des VE internalisés a été détecté et analysé à l’aide d’un microscope confocal dans des outils de traitement tridimensionnels (3D) et post-image20. Bien que la taille des petits VE (40-200 nm) soit inférieure à la limite de résolution du microscope optique, les VE marqués par fluorescence peuvent être détectés par microscopie confocale puisque le photodétecteur peut détecter l’émission de fluorescence accrue. Par conséquent, la localisation subcellulaire des VE marqués par fluorescence dans une cellule peut être déterminée avec précision en acquérant plusieurs images empilées en Z des VE et des organites cellulaires environnants.
En outre, la reconstruction 3D et le traitement post-données peuvent fournir des informations supplémentaires sur le positionnement des véhicules électriques internalisés, superficiels et flottants. En utilisant ces processus en conjonction avec l’imagerie accélérée des cellules vivantes offerte par la microscopie confocale, le niveau d’absorption des VE peut être évalué avec précision, et le suivi en temps réel de l’absorption des VE est également possible. En outre, l’analyse du trafic de VE peut être effectuée à l’aide de la microscopie confocale en évaluant la colocalisation des VE avec des organites, une première étape pour déterminer comment les VE internalisés sont impliqués dans la fonction intracellulaire. Ce protocole décrit la méthodologie pour effectuer un test d’absorption ev à l’aide du dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration17,26, la microscopie confocale et l’analyse post-image.
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Protocol
1. Isolation des VE et marquage immuno-fluorescent ev sur puce
- Collecte des milieux de culture cellulaire (CCM) et prétraitement du CCM pour l’isolement des VE
- Ensemencez des cellules PC3 à 30 % de confluence dans une fiole de culture cellulaire de 75 cm2 . Permettre aux cellules témoins de croître jusqu’à 90% de confluence (~ 48 h) dans les milieux standard et les suppléments spécifiques à la lignée cellulaire.
REMARQUE: Pour empêcher les composants contenant des VE d’affecter l’absorption cellulaire (c.-à-d. le sérum bovin fœtal), utilisez des milieux et des suppléments appauvris en exosomes. - Récoltez le CCM.
- Centrifuger le CCM à 1000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT) pour granuler les cellules non attachées et les gros débris récoltés avec le média. Transférer le surnageant dans un nouveau tube conique.
- Dans le nouveau tube, centrifuger le surnageant à 10 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour granuler les débris plus petits et les corps apoptotiques restant dans le milieu. Certains véhicules électriques plus gros vont pelleter. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
- Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à membrane hydrophile de fluorure de polyvinylidène (PVDF) de 0,45 μm.
REMARQUE: Si vous ne traitez pas immédiatement le CCM pour l’isolation EV, stockez le CCM pré-traité à -80 °C jusqu’à ce que l’isolation soit effectuée. En cas de congélation, limitez les cycles de gel-dégel à un.
- Ensemencez des cellules PC3 à 30 % de confluence dans une fiole de culture cellulaire de 75 cm2 . Permettre aux cellules témoins de croître jusqu’à 90% de confluence (~ 48 h) dans les milieux standard et les suppléments spécifiques à la lignée cellulaire.
- Isolation EV du CCM à l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration
- En cas de congélation, décongeler complètement le CCM et le vortex pendant 30 s avant l’étape 1.2.2.
- Injecter 1 mL de CCM prétraité (étape 1.1) dans la chambre d’échantillonnage du dispositif microfluidique à base de nanofiltration (voir tableau des matériaux)17,26.
REMARQUE: Suivez la procédure d’exploitation standard pour le dispositif microfluidique à base de nanofiltration17,26. - Tourner à 3000 tr/min pendant 10 min dans la machine à filer de paillasse (voir Tableau des matériaux) pour faire fonctionner le dispositif microfluidique.
REMARQUE : Si le CCM reste sur la chambre d’échantillonnage après l’exécution initiale, effectuez des rotations supplémentaires jusqu’à ce que tout CCM se soit vidé de la chambre d’échantillonnage. - Retirer le fluide de la chambre à déchets par pipetage et répéter les étapes 1.2.1, 1.2.2 et 1.2.3 deux fois.
REMARQUE: Au total, 3 mL de CCM seront traités pour l’isolation ev. - Injecter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la chambre d’échantillonnage pour laver les véhicules électriques isolés. Rotation dans la machine à filer de paillasse pour faire fonctionner le dispositif microfluidique comme mentionné à l’étape 1.2.3. Localisez les véhicules électriques purs sur la membrane de l’appareil.
REMARQUE: La qualité des VE isolés du dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration, en particulier, a été confirmée et comparée à la méthode UC conventionnelle par microscopie électronique à transmission (TEM), microscope électronique à balayage (MEB), analyse de suivi des nanoparticules (NTA), microscopie à illumination structurée, dosage immuno-enzymatique et PCR en temps réel dans la recherche précédente17,26.
- Marquage immunofluorescent de l’EV à l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration (Figure 1)
- Sélectionnez un anticorps spécifique à l’EV en fonction de l’objectif du test (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Certains anticorps peuvent interférer avec les sites de liaison aux ligands spécifiques aux voies d’absorption de la VE (c.-à-d. endocytose). - Injecter 1 μg/mL de l’anticorps spécifique à l’EV dans le trou d’élution du dispositif contenant 100 μL de VE isolés.
- Incuber pendant 1 h dans l’obscurité à TA sur un agitateur à plaque pour assurer la répartition uniforme de l’anticorps à travers l’échantillon.
- Fixez un ruban adhésif au trou d’élution. Injecter 1 mL de PBS dans la chambre d’échantillonnage pour éliminer les anticorps résiduels.
- Faites tourner l’appareil à 3000 tr/min jusqu’à ce que la chambre d’échantillonnage soit vide. Retirez tout fluide de la chambre à déchets par pipetage. Injecter 1 mL de PBS dans la chambre d’échantillonnage.
REMARQUE: Les véhicules électriques marqués par fluorescence seront situés dans la chambre à membrane. - Pipette les véhicules électriques marqués par fluorescence (Figure 2) de la chambre à membrane vers un tube ambré. Bloquer de la lumière jusqu’à l’utilisation.
- Sélectionnez un anticorps spécifique à l’EV en fonction de l’objectif du test (voir tableau des matériaux).
2. Incubation des cellules avec des VE marqués par fluorescence pour le test d’absorption ev
- Cibler l’ensemencement et la culture de cellules sur les plats compatibles avec la culture cellulaire.
- Ensemencez 1 x 104 cellules PC3 dans la plaque microslide à 8 puits (9,4 x 10,7 mm pour chaque puits) avec 0,2 mL de milieu ou 4 x 104 cellules PC3 dans un plat de 35 mm avec 1 mL de milieu. Plaquer les cellules dans une boîte compatible avec la culture cellulaire composée d’un mince couvercle (épaisseur: 0,18 mm).
REMARQUE: Le couvercle mince minimise la diffusion défavorable de la lumière. - Permettre aux cellules d’adhérer pendant la nuit dans des conditions optimales de culture cellulaire (37 °C, 5 % de concentration de CO2 , 90 % d’humidité).
- Laver les cellules adhérentes deux fois avec des milieux appauvris en exosomes (décrits à l’étape 1.1.1).
- Ensemencez 1 x 104 cellules PC3 dans la plaque microslide à 8 puits (9,4 x 10,7 mm pour chaque puits) avec 0,2 mL de milieu ou 4 x 104 cellules PC3 dans un plat de 35 mm avec 1 mL de milieu. Plaquer les cellules dans une boîte compatible avec la culture cellulaire composée d’un mince couvercle (épaisseur: 0,18 mm).
- Incubation cellulaire avec des VÉHICULES marqués par fluorescence.
- Mesurer la concentration des VÉHICULES marqués par fluorescence (étape 1.3.5) par analyse de suivi des nanoparticules (NTA, figure supplémentaire 1). Déterminer la concentration optimale de VE marqués par fluorescence à ajouter aux cellules cultivées (étape 2.1.2.).
- Diluer les VE marqués par fluorescence avec un milieu appauvri en exosomes pour correspondre à la concentration souhaitée mesurée à l’étape 2.2.1. (c.-à-d. 7,80 x 109 VE (en valeur NTA) dans 200 μL de milieux appauvris en exosomes.)
- Ajouter les VE dilués (étape 2.2.2) aux cellules cibles adhérentes préparées au point 2.1.2. Incuber pour le temps expérimental (c.-à-d. 4, 8 ou 12 h).
- Lavez les cellules trois fois avec des supports sans exosomes pour éliminer les véhicules électriques non internalisés.
REMARQUE: Facultatif: Les cellules peuvent être fixées après le lavage. - Étiqueter le cytoplasme des cellules adhérentes avec 1 μg/mL de CMTMR ((5-(et-6)-((4-chlorométhyl)benzoyl)amino)tétraméthylrhodamine) (voir tableau des matériaux) et incuber dans des conditions optimales de culture cellulaire (37 °C, concentration de CO2 à 5 %, humidité de 90 %).
REMARQUE: Les colorants de la zone cellulaire doivent être fluorescents séparément des véhicules électriques étiquetés pour aider à déterminer l’emplacement spatial (internalisé ou superficiel) des véhicules électriques enrichis pendant le test d’absorption des VE. - Lavez les cellules marquées deux fois avec un milieu appauvri en exosomes pour éliminer le colorant résiduel. Ajouter des milieux frais appauvris en exosomes aux cellules en préparation de l’imagerie confocale des cellules vivantes.
3. Microscopie confocale
- Pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes, utilisez un incubateur sur scène pour maintenir des conditions optimales de culture cellulaire (37 °C, 5 % de concentration de CO2 , 90 % d’humidité).
- Placez les cellules préparées dans l’incubateur sur scène.
- Définissez les paramètres d’imagerie en fonction des échantillons de contrôle.
REMARQUE : Les échantillons de contrôle suggérés comprennent : les VÉHICULES électriques marqués par fluorescence seulement, les cellules marquées par fluorescence, les véhicules électriques non marqués et les cellules non marquées. - Déterminez la profondeur des cellules cibles et la plage de taille d’empilement dans la direction z pour acquérir des images confocales 3D.
REMARQUE: L’épaisseur d’une pile Z est de 1 μm. L’acquisition d’images 3D confocales a duré 2 min 34 s (chaque acquisition d’image du plan Z a pris environ 8 s; un total de vingt images de la pile Z). - Réglez l’acquisition d’images sur plusieurs images empilées en Z de colorant spécifique à la cellule (c.-à-d. rouge) et de colorant spécifique à EV (c.-à-d. vert) simultanément (Figure 3 et Figure 4A).
4. Traitement d’image
- Utilisez un logiciel de traitement automatique d’images pour analyser les images confocales brutes empilées en Z et déterminer l’absorption des VE par les cellules (voir Tableau des matériaux).
- Définissez des paramètres de seuil pour le signal fluorescent des cellules et des colorants spécifiques aux VE. Construisez les surfaces virtuelles des cellules (Figure 4A,B).
- Pour créer les surfaces virtuelles des cellules, cliquez sur le bouton Ajouter de nouvelles surfaces.
- Sélectionnez Calcul de la distance la plus courte comme « Paramètres de l’algorithme » pour utiliser l’algorithme fourni par le logiciel, puis cliquez sur Suivant: Canal source.
- Sélectionnez Channel 2 - CMTMR comme « Canal source » dans cette expérience.
- Sélectionnez Lisser et placez la valeur appropriée dans « Détails des surfaces » pour le lissage de la surface.
REMARQUE: 0,57 μm dans cette expérience puisque 1 pixel représente 0,57 μm dans les données d’imagerie brutes. - Sélectionnez Intensité absolue comme « Seuil ».
- Pour seuilr automatiquement l’image fluorescente par l’algorithme fourni, cliquez sur Seuil (intensité absolue) : la valeur est automatiquement définie.
- Sélectionnez Activer en tant que « Fractionner les objets en contact (croissance de la région) » et placez la valeur de la taille estimée des cellules dans « Diamètre des points d’amorçage », 10,0 μm dans cette expérience. Cliquez ensuite sur Suivant : Filtrer les points d’amorçage.
- Pour configurer les surfaces de cellule virtuelle, cliquez sur le bouton + Ajouter , puis sélectionnez Qualité comme « Type de filtre ». Seuilz la valeur appropriée (210 dans cette expérience) pour la limite basse par une inspection visuelle et la valeur maximale (1485) pour la limite supérieure, puis cliquez sur le bouton Terminer .
REMARQUE: Une inspection visuelle signifie qu’un chercheur peut distinguer la zone cellulaire d’une image fluorescente brute. - Ensuite, pour créer les points virtuels des véhicules électriques, cliquez sur le bouton Ajouter de nouveaux spots.
- Sélectionnez Différentes tailles de spot (croissance de la région) et Calcul de la distance la plus courte comme « Paramètres de l’algorithme », puis cliquez sur Suivant: Canal source.
- Sélectionnez Channel 1 - Alexa Fluor 488 comme « Canal source » dans cette expérience.
- Mettez la valeur appropriée dans « Diamètre XY estimé » pour la détection ponctuelle, 1 μm dans cette expérience. Ensuite, cliquez sur Suivant : Filtrer les spots.
- Pour configurer les points EV virtuels, cliquez sur le bouton + Ajouter , sélectionnez Qualité comme « Type de filtre » et définissez « Seuil inférieur » par une inspection visuelle, 100 dans cette expérience. Cliquez ensuite sur le bouton Suivant : Type de région spot .
- Sélectionnez Intensité absolue comme « Type de régions ponctuelles », puis cliquez sur Suivant: Régions ponctuelles.
- Pour seuilr, la région des points EV, mettre la valeur appropriée dans « Seuil de région » par une inspection visuelle, 100 comme « Seuil de région » dans cette expérience.
REMARQUE: Une inspection visuelle signifie qu’un chercheur peut distinguer la zone des véhicules électriques d’une image fluorescente brute. - Sélectionnez Volume de la région comme « Diamètre à partir de », puis cliquez sur Terminer.
- Utilisez les algorithmes fournis par le logiciel pour diviser les points groupés à l’intérieur de la surface construite à l’étape 4.2 (Figure 4C, i-iv).
- Cliquez sur les spots générés, puis allez dans Filtres.
- Cliquez sur le bouton + Ajouter , puis sélectionnez Distance la plus courte par rapport aux surfaces Surfaces = Surface 1 comme Type de filtre, puis cliquez sur dupliquer la sélection vers le nouveau bouton Spots . Le seuil le plus bas (-7,0 dans cette expérience) pour la limite basse et la valeur appropriée (-0,5) pour la limite supérieure.
REMARQUE: Définissez la limite supérieure avec le rayon estimé de Spots. Dans cette expérience, le diamètre estimé des taches, c’est-à-dire des points EV, a été fixé à 1 μm à l’étape 4.2.11. ainsi, la limite supérieure peut être de 0,5.
- Comptage automatique des véhicules électriques à l’intérieur des cellules
REMARQUE: Le logiciel comptera automatiquement le nombre de véhicules électriques à l’intérieur des cellules, indiquant le nombre internalisé par les cellules cibles.- Cliquez sur la sélection Spots 1 construite [Distance la plus courte par rapport aux surfaces = Surfaces 1 comprises entre -7,00 et -0,500].
- Accédez aux statistiques et exportez la valeur de « Nombre total de spots »
REMARQUE: Les algorithmes fournis par le logiciel calculeront automatiquement le nombre et le volume de cellules.
- Déterminer le rendement d’absorption des VE par période d’incubation en fonction des valeurs calculées ci-dessus (Figure 5).
- Pour obtenir le nombre de cellules, cliquez sur les surfaces 1 générées, puis accédez aux statistiques et exportez la valeur de « Nombre total de surfaces » à partir de l’ensemble.
- Accédez à détaillé dans Statistiques pour exporter le volume à partir de Détaillé.
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Representative Results
À l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration, les VE ont été isolés du PC3 CCM et marqués avec un anticorps spécifique à l’EV conjugué au fluorophore (CD63) (Figure 1). Les véhicules électriques marqués ont été visualisés avec succès par la microscopie confocale 3D (Figure 2). Les VE marqués ont été incubés avec des cellules pendant plusieurs heures dans des milieux appauvris en exosomes. Après l’incubation, les cellules ont été lavées avec des milieux appauvris en exosomes. Les VE restants ont été internalisés ou adhérés aux cellules pendant l’incubation. La zone cellulaire a été étiquetée. Les véhicules électriques internalisés ont été visualisés comme puncta19,20,24,27 et un véhicule électrique individuel (figure 3 et figure 4A). Le post-traitement de ces images permet la visualisation et la quantification de l’internalisation ev dans les cellules (Figure 4). Les étapes combinées permettent d’effectuer efficacement un test précis de l’absorption des VE. La figure 5 montre les résultats représentatifs du test d’absorption des VE. Le test indique que le niveau d’absorption de VE dépend de la durée de la période d’incubation. La procédure permet l’exclusion systématique des véhicules électriques non internalisés (figure 4C) afin de mesurer avec précision le nombre de véhicules électriques internalisés. La distribution granulométrique des points EV internalisés a été calculée (Figure 6). De plus, le nombre de VE internalisés peut être normalisé au volume des cellules réceptrices afin de déterminer le taux réel d’absorption des VE pour la cellule spécifique. La normalisation tient compte de la taille hétérogène des cellules et représente le nombre de VE internalisés en fonction de la surface cellulaire. La surface cellulaire est définie comme la zone cellulaire en contact avec des milieux de culture enrichis en EV et appauvris en exosomes pendant l’incubation.
Figure 1 : Illustration schématique de l’isolation ev et de l’étiquetage sur puce à l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration. (A) Isolation des véhicules électriques par rapport à la CCM. (B) Marquage immunofluorescent sur puce des veB. (C) Élimination des anticorps non liés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Imagerie des véhicules électriques marqués par fluorescence. Les VE marqués par fluorescence (anti-CD63-Alexa Fluor 488) ont été détectés à l’aide du microscope confocal (objectif 40x). (A) Échantillon positif (véhicules électriques anti-CD63-Alexa Fluor 488). (B) Contrôle négatif 1 pour le marquage EV (VE avec 2ème anticorps (Alexa Fluor 488) uniquement, sans 1er anticorps). (C) Contrôle négatif 2 (VE avec l’anticorps IgG de la souris (SEP) et le 2e anticorps (Alexa Fluor 488)). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Imagerie des VE internalisés dans les cellules dans une image 2D. (A) Les VE marqués par fluorescence (anti-CD63-Alexa Fluor 488, vert) et les cellules (CMTMR, rouge) ont été détectés à l’aide du microscope confocal (objectif 20x) après l’incubation. (B) Une image distincte des véhicules électriques marqués par fluorescence seulement. (C) Une image distincte des cellules marquées par fluorescence seulement. Les longueurs d’onde laser d’excitation/émission pour CMTMR et Alexa Fluor 488 sont de 560,6/595 (±50) nm et 487,8/525 (±50) nm. Les réglages de puissance laser sont de 3,0 % pour cmtmr et de 10,0 % pour Alexa Fluor 488. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Quantification des VE internalisés par le processus post-imagerie. (A) Image confocale brute obtenue à partir du test d’absorption des VE. (B) Rendu virtuel des VÉHICULES sous forme de point (vert) et des cellules sous forme de surface (rouge) à l’aide du logiciel de traitement d’images. (C, i-iv) Discrimination des VE internalisés (points jaunes) et des VE non internalisés (points verts, flèche blanche) à l’aide de l’algorithme fourni par le logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Quantité d’absorption de VE en fonction du temps d’incubation. (A) Le nombre de VE internalisés par cellule. (B) Le nombre de VE internalisés par volume de cellule. Le nombre de VE internalisés a été augmenté en fonction du temps d’incubation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Distribution granulométrique des points EV internalisés. La taille des points EV a été mesurée et tracée en fonction d’une distribution. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Mesure NTA des véhicules électriques étiquetés anti-CD63-Alex Fluor 488. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Quantité de VE colocalisés avec des lysosomes en fonction du temps d’incubation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Quantité d’absorption de VE en fonction du temps d’incubation. (A) Le nombre de VE internalisés par cellule. (B) Le nombre de VE internalisés par volume de cellule. Le nombre de VE internalisés a été augmenté en fonction du temps d’incubation. L’échantillon EV a été étiqueté par colorant colorant à l’ARN (voir tableau des matériaux). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Un test d’absorption EV basé sur l’imagerie par fluorescence 3D via la microscopie confocale fournit une méthodologie efficace et une analyse sensible. Cet étiquetage fluorescent des VE facilite la visualisation des VE et effectue avec succès un test d’absorption précis des VE. Des méthodes antérieures d’étiquetage des véhicules électriques et d’élimination du colorant résiduel ont été rapportées en éliminant les précipitations à l’aide de l’ultracentrifugation (CU); cependant, la CO peut co-précipiter les VE, et le colorant immobilisé peut conduire à un signal faussement positif12,13. Les dispositifs microfluidiques à base de nanofiltration éliminent cette co-précipitation des VE et des colorants, améliorant ainsi la qualité des VE marqués par fluorescence et la spécificité du test. L’absorption des VE a été mesurée par analyse volumétrique pour distinguer et quantifier les VE internalisés séparément des VE superficiels à la surface de la cellule. L’analyse volumétrique de l’absorption des VE permet de normaliser l’absorption des VE en fonction de la taille des cellules. Le test d’absorption de l’EV sur cellules vivantes a été réalisé en utilisant l’incubateur de microscope confocal sur scène. Le protocole s’applique aux études nécessitant des cultures de cellules vivantes et des VE. Le suivi intracellulaire en temps réel des véhicules électriques peut être effectué à travers une fenêtre 3D. En outre, l’analyse du trafic ev de la résolution spatio-temporelle ainsi que la colocalisation des VE avec les organites subcellulaires peuvent être réalisées grâce au protocole (figure supplémentaire 2). Le protocole décrit ici est un outil puissant pour l’analyse cellulaire des véhicules électriques.
Malgré tous les avantages du protocole, il existe des limites potentielles. Le dispositif microfluidique de nanofiltration utilisé dans cette étude peut co-isoler d’autres contaminants pendant l’isolement des VE. Les lipoprotéines de basse densité sont de taille similaire aux VE et peuvent être capturées dans la membrane pendant l’isolement28. Bien que les marqueurs spécifiques aux VE puissent spécifier les VE, les contaminants co-isolés peuvent affecter l’analyse en aval. Dans ce manuscrit, les véhicules électriques ont été étiquetés avec un colorant Alexa Fluor 488 conjugué CD63. Cet étiquetage augmente la spécificité de la détection des VÉHICULES électriques; cependant, il lie également la molécule de surface EV et augmente la liaison compétitive. De plus, le niveau d’absorption de VE peut dépendre de la lignée cellulaire et de l’ICN. Les méthodes d’étiquetage détaillées dans ce protocole peuvent être adaptées à d’autres colorants tels que les colorants lipophiles, les colorants cytosoliques et les colorants à ARN (figure supplémentaire 3). Le protocole utilise un microscope confocal à balayage lumineux (LSCM) pour détecter le minuscule signal des véhicules électriques. LSCM repose sur des lasers intenses et, par conséquent, les cellules vivantes peuvent être endommagées ou altérées par l’excitation laser à long terme. La vitesse d’acquisition rapide peut réduire les photodommages en utilisant un microscope confocal à disque rotatif (SDCM). SDCM peut également être utilisé dans le suivi des véhicules électriques qui nécessite une imagerie en accéléré court pour visualiser les mouvements de courte distance.
Malgré ces limites potentielles, le protocole proposé fournit une méthode efficace pour l’évaluation de l’absorption des VE et a le potentiel d’une analyse plus poussée du suivi des VE sur cellules vivantes.
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Disclosures
Y.-K. Cho est l’un des inventeurs des brevets sur le dispositif microfluidique à base de nanofiltration, Exodisc, qui sont concédés sous licence à Labspinner (Ulsan, Corée). Tous les autres auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIC. U54CA143803, CA163124, CA093900 et CA143055 à K. J. P. Cette recherche a été soutenue par une subvention du projet coréen de R&D sur les technologies de la santé par l’intermédiaire de l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI), financé par le ministère de la Santé et du Bien-être de la République de Corée (numéro de subvention : HI19C1122). Œuvre de J. Kim et Y.-K. Cho a été soutenu par l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R020-D1), financé par le gouvernement coréen. Les auteurs remercient les membres actuels et passés de l’Institut urologique Brady, en particulier les membres du laboratoire Pienta-Amend, pour la lecture critique du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
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