Summary
Hücre dışı veziklinler (EV' ler) hücresel biyolojiye ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur. Hücrelerin ALDıĞı EV'leri görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz tarafından EV izolasyonunu takiben konfokal mikroskopi yoluyla üç boyutlu floresan görüntüleme kullanarak EV alma testini önermektedir.
Abstract
Hücrelerin hücre dışı veziklin (EV) alımını görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. EV alımı, çeşitli araştırma alanlarında hücreler arası iletişimde rol oynar; kanser biyolojisi, sinirbilim ve ilaç dağıtımı. Literatürde birçok EV alım tahlilleri bildirilmiştir; ancak pratik, detaylı deneysel metodoloji eksikliği vardır. EV alımı, hücrelerdeki konumlarını tespit etmek için EV'leri floresan olarak etiketlenerek değerlendirilebilir. Hücrelerdeki içselleştirilmiş EV'ler ile hücrelerdeki yüzeysel EV'ler arasında ayrım yapmak, EV alımını doğru bir şekilde belirlemek zor, ancak kritiktir. Bu nedenle, bu çalışmada üç boyutlu (3D) floresan konfokal mikroskopi ile EV alımını verimli bir şekilde ölçen bir test önermektedir. Floresan etiketli EV'ler nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz kullanılarak hazırlandı, 3D konfokal mikroskopi ile görselleştirildi ve daha sonra gelişmiş görüntü işleme yazılımı ile analiz edildi. Protokol, EV'leri hücresel düzeyde analiz etmek için sağlam bir metodoloji ve verimli analiz için pratik bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Hücre dışı veziklinler (EV'ler), boyutlarına göre kategorize edilen nano boyutlu, lipid zara bağlı parçacıklardır: ektozomlar (100-500 nm) ve ekzozomlar (50-150 nm)1. EV'ler proteinler, nükleik asitler ve lipitler gibi çeşitli biyomoleküller içerir. Bu biyomoleküller, kargo olarak kapsüllenmeden önce hücrelerden kaynaklanır ve EV'ler aracılığıyla hücre dışı alana salınır1,2,3.
Kargolarının çeşitliliği nedeniyle, EV'lerin hücreler arası iletişimde aktif bir rol oynadığına inanılmaktadır. EV'lerin hücreler tarafından salınması ve alınması, hücreler arasında biyomoleküllerin aktarılmasına izin verir4,5. EV kargosunun bir hücreye girişi alıcı hücrenin işlevlerini ve homeostatik durumunu değiştirebilir4,5,6. EV'ler birden fazla yoldan içselleştirilir; ancak, kesin mekanizmalar doğru bir şekilde gösterilmemiştir.
Ev alma testlerinin çoğunluğu, genetik etiketleme gibi, floresan olarak bireysel EV'leri etiketler7. Elde edilen sinyal mikro plaka fotometresi, akış sitometrisi veya mikroskopi ile ölçülebilir ve her teknolojinin önemli sınırlamaları vardır. Mikro plaka fotometreleri, akış sitometrisi veya standart iki boyutlu (2B) mikroskopi, içselleştirilmiş ve yüzeysel olarak bağlı EV'leri ayırt edemez8,9. Ayrıca, bu tekniklerin her biri için gerekli örnek hazırlama, EV alım değerlendirmesine ek sorunlar getirebilir. Örneğin, EV alım analizinden önce yapışık hücreleri tripsin ile kaldırmak, hücrenin yüzeyinde yüzeysel olarak bağlı bazı EV'leri ayırabilir10,11. Tripsin hücre yüzeyi ile de etkileşime girerek hücre ve EV fenotipini etkileyebilir. Ek olarak, tripsin yüzeysel EV'leri tamamen ayıramayabilir, yalıtılmış popülasyonları eğriltebilir.
EV'leri floresan boyalarla doğru bir şekilde etiketlemek için, artık boyayı çıkarmak için ek yıkama adımları gereklidir7. Kabul edilen izolasyon teknikleri, EV izolasyonu sırasında ortaya çıkan pıhtılaşma nedeniyle yanlış-pozitif sinyallere de katkıda bulunabilir. Örneğin, seri ultrasantrifüjleme (UC), EV'leri izole etmek ve hareketsiz boyayı çıkarmak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, UC EV'leri birlikte çökeltebilir ve artık boya yanlış-pozitif sinyale yol açabilir12,13. Sütun bazlı filtrasyon gibi diğer nano filtrasyon yöntemleri de hareketsiz boya giderme için yaygın olarak kullanılmaktadır. Sütun matrisi içinde etkileşime giren EV'lerin ve boyanın karmaşık doğası, karmaşık giriş14,15,16 tarafından değiştirilen sütunun moleküler kesilmesi nedeniyle artık boyanın eksik çıkarılmasına neden olabilir.
Mevcut protokol, floresan etiketli izole EV'leri izole etmek ve yıkamak için nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz önermektedir. Nano filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz, sıvı destekli ayırma teknolojisi (FAST)17,18 ile verimli filtrasyon sağlayabilir. FAST, filtredeki basınç düşüşünü azaltarak EV'ler ve boyalar arasındaki olası toplamayı azaltır. Artık boyayı verimli bir şekilde kaldırarak, floresan etiketli EV'lerin kalitesini ve testlerin özgüllüğünü artırmak mümkündür.
Konfokal mikroskopi, hücre yüzeyindeki içselleştirilmiş ve yüzeysel olarak bağlı EV'leri ayırt edebilir ve mekansal çözünürlükte EV alımının hücresel mekanizmalarını kapsamlı bir şekilde araştırabilir19,20,21,22,23,24,25. Örneğin, Sung ve arkadaşları, gelişmiş canlı hücre muhabirlerini kullanarak eksozom yaşam döngüsünün görselleştirilmesini tanımladı. İçselleştirilmiş EV'lerin konumu, üç boyutlu (3D) ve görüntü sonrası işleme araçlarında bir konfokal mikroskop kullanılarak tespit edildi ve analiz edildi20. Küçük EV'lerin boyutu (40-200 nm) optik mikroskobun çözünürlük sınırının altında olmasına rağmen, fotodetektör gelişmiş floresan emisyonu tespit edebildiğinden, floresan etiketli EV'ler konfokal mikroskopi ile tespit edilebilir. Bu nedenle, bir hücre içindeki floresan etiketli EV'lerin hücre altı lokalizasyonu, EV'lerin ve çevresindeki hücresel organellerin birden fazla z yığılmış görüntüsü alınarak tam olarak belirlenebilir.
Ayrıca, 3D rekonstrüksiyon ve veri sonrası işleme, içselleştirilmiş, yüzeysel ve serbest yüzen EV'lerin konumlandırılması hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir. Bu süreçler konfokal mikroskopinin sunduğu hızlandırılmış canlı hücre görüntülemesi ile birlikte kullanılarak, EV alımı seviyesi tam olarak değerlendirilebilir ve EV alımının gerçek zamanlı takibi de mümkündür. Ayrıca, EV kaçakçılık analizi, EV'lerin hücre içi işlevde nasıl içselleştirildiğini belirlemek için ilk adım olan organellerle birlikte lokalizasyonu değerlendirilerek konfokal mikroskopi kullanılarak yapılabilir. Bu protokol, nano filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz17,26, konfokal mikroskopi ve görüntü sonrası analiz kullanarak ev alma tahlili yapmak için metodolojiyi açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EV izolasyonu ve çip üzerinde immün floresan EV etiketleme
- Hücre kültürü medyasının (CCM) toplanması ve EV yalıtımı için CCM'nin ön işlenmesi
- 75 cm2 hücre kültürü şişesinde %30 izdiahta tohum PC3 hücreleri. Kontrol hücrelerinin standart ortamda ve hücre hattına özgü takviyelerde %90 izdiah (~48 h) büyümesine izin verin.
NOT: EV içeren bileşenlerin hücresel alımı (yani fetal sığır serumu) etkilemesini önlemek için eksozom tükenmiş ortam ve takviyeler kullanın. - CCM'i hasat edin.
- CcM'yi oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjle, eklenmemiş hücreleri ve ortamla birlikte hasat edilen büyük kalıntıları peletmek için. Süpernatant'ı yeni bir konik tüpe aktarın.
- Yeni tüpte, medyada kalan daha küçük döküntüleri ve apoptotik gövdeleri peletmek için 4 °C'de 20 dakika boyunca 10.000 x g'da süpernatantı santrifüj edin. Bazı büyük EV'ler peletleyecek. Süpernatant'ı yeni bir tüpe aktarın.
- Süpernatantı 0,45 μm hidrofilik Polivinylidene florür (PVDF) membran şırıngar filtresinden geçirin.
NOT: EV izolasyonu için CCM'yi hemen işlemezseniz, önceden işlenmiş CCM'yi izolasyon gerçekleştirilene kadar -80 °C'de saklayın. Dondurulursa, donma-çözülme döngülerini bir ile sınırlayın.
- 75 cm2 hücre kültürü şişesinde %30 izdiahta tohum PC3 hücreleri. Kontrol hücrelerinin standart ortamda ve hücre hattına özgü takviyelerde %90 izdiah (~48 h) büyümesine izin verin.
- Nano filtrasyon tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanarak CCM'den EV izolasyonu
- Donmuşsa, 1.2.2 adımına kadar CCM ve girdabı 30 sn boyunca tamamen çözün.
- Nano filtrasyon bazlı mikroakışkan cihazın numune haznesine 1 mL önceden işlenmiş CCM (adım 1.1) enjekte edin (bkz. Malzeme Tablosu)17,26.
NOT: Nano filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz17,26 için standart çalışma prosedürünü izleyin. - Mikroakışkan cihazı çalıştırmak için tezgah üstü iplik makinesinde 10 dakika boyunca 3000 rpm'de döndürün (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: CCM ilk çalıştırmayı takiben numune odasında kalırsa, tüm CCM numune odasından boşalana kadar ek dönüşler gerçekleştirin. - Sıvıyı pipetleme ile atık odasından çıkarın ve 1.2.1, 1.2.2 ve 1.2.3 adımlarını iki kez tekrarlayın.
NOT: EV izolasyonu için toplamda 3 mL CCM işlenecektir. - İzole EV'leri yıkamak için numune odasına 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edin. Adım 1.2.3'te belirtildiği gibi mikroakışkan cihazı işletmek için tezgah üstü iplik makinesinde dönün. Cihazın zarındaki saf EV'leri bulun.
NOT: Özellikle nano filtrasyon bazlı mikroakışkan cihazdan izole edilen EV'lerin kalitesi, önceki araştırmada iletim elektron mikroskopisi (TEM), taramalı elektron mikroskobu (SEM), nanopartikül takip analizi (NTA), yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi, enzime bağlı immünorbent tahlili ve gerçek zamanlı PCR ile teyit edilmiş ve geleneksel UC yöntemine karşılaştırılmıştır17,26.
- Nano filtrasyon bazlı mikroakışkan cihaz kullanılarak EV'nin immünofluoresan etiketlemesi (Şekil 1)
- Testin amacına göre EV'ye özgü bir antikor seçin (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Bazı antikorlar EV-uptake yollarına (yani endositoz) özgü ligand bağlama bölgelerine müdahale edebilir. - 100 μL izole EV içeren cihazın elüasyon deliğine EV'ye özgü antikorun 1 μg/mL'lik kısmını enjekte edin.
- Antikorun numune boyunca eşit dağılımını sağlamak için bir plaka çalkalayıcı üzerinde RT'de karanlıkta 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Elution deliğine yapışkan bir bant takın. Kalan antikorları yıkamak için numune odasına 1 mL PBS enjekte edin.
- Numune odası boşalana kadar cihazı 3000 rpm'de döndürün. Boru ile atık haznesinden herhangi bir sıvıyı çıkarın. Numune odasına 1 mL PBS enjekte edin.
NOT: Floresan etiketli EV'ler membran haznesinde yer alacaktır. - Membran odasından bir kehribar tüpüne floresan etiketli EV'leri (Şekil 2) pipetle. Kullanıma kadar ışıktan engelleyin.
- Testin amacına göre EV'ye özgü bir antikor seçin (bkz. Malzeme Tablosu).
2. EV-uptake tahlil için floresan etiketli EV'lere sahip hücrelerin inkübasyonu
- Hücre kültürü uyumlu yemekler üzerinde hücre tohumlama ve kültürü hedefle.
- 1 x 104 PC3 hücrelerini mikroslid 8 kuyu plakasına (her kuyu için 9,4 x 10,7 mm) 0,2 mL ortam veya 4 x 104 PC3 hücresi ile 1 mL medya içeren 35 mm'lik bir tabağa yerleştirin. Hücreleri ince bir kapakçıktan (kalınlık: 0,18 mm) oluşan hücre kültürü uyumlu bir tabak haline yerleştirin.
NOT: İnce kapak parçası, ışığın olumsuz saçılmasını en aza indirir. - Hücrelerin optimum hücre kültürü koşullarında (37 °C, %5 CO2 konsantrasyonu, %90 nem) bir gecede yapışmasına izin verin.
- Yapışan hücreleri eksozom tükenmiş ortamla iki kez yıkayın (adım 1.1.1'de açıklanmıştır).
- 1 x 104 PC3 hücrelerini mikroslid 8 kuyu plakasına (her kuyu için 9,4 x 10,7 mm) 0,2 mL ortam veya 4 x 104 PC3 hücresi ile 1 mL medya içeren 35 mm'lik bir tabağa yerleştirin. Hücreleri ince bir kapakçıktan (kalınlık: 0,18 mm) oluşan hücre kültürü uyumlu bir tabak haline yerleştirin.
- Floresan etiketli EV'ler ile hücre inkübasyonu.
- Nanopartikül izleme analizi (NTA, Tamamlayıcı Şekil 1) ile floresan etiketli EV'lerin konsantrasyonunun (adım 1.3.5) ölçülmesi. Kültürlü hücrelere eklenecek floresan etiketli EV'lerin en uygun konsantrasyonunun belirlenmesi (adım 2.1.2.).
- Floresan etiketli EV'leri, 2.2.1 adımında ölçülen istenen konsantrasyona uyacak şekilde eksozom tükenmiş ortamla seyreltin. (yani, 200 μL eksozom tükenmiş ortamda 7,80 x 109 EV (NTA değerinde).)
- Seyreltilmiş EV'leri (Adım 2.2.2) 2.1.2'de hazırlanan yapışmış hedef hücrelere ekleyin. Deneysel süre boyunca kuluçkaya yatırın (yani, 4, 8 veya 12 saat).
- İçselleştirilmemiş EV'leri çıkarmak için hücreleri eksozom içermeyen ortamla üç kez yıkayın.
NOT: İsteğe bağlı: Hücreler yıkamadan sonra sabitlenebilir. - Yapışık hücrelerin sitoplazmını 1 μg/mL CMTMR (((5-(ve-6)-(((4-klorometil)benzoyl)amino) tetrametrinrhodamin) ile etiketleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve optimal hücre kültürü koşullarında kuluçkaya yatırın (37 °C, %5 CO2 konsantrasyonu, %90 nem).
NOT: Hücre alanı boyaları, EV alımı tahlil sırasında çivili EV'lerin uzamsal konumunu (içselleştirilmiş veya yüzeysel) belirlemeye yardımcı olmak için etiketli EV'lerden ayrı olarak floresan olmalıdır. - Artık boyayı çıkarmak için etiketli hücreleri eksozom tükenmiş ortamla iki kez yıkayın. Canlı hücre konfokal görüntülemeye hazırlık için hücrelere taze eksozom tükenmiş ortam ekleyin.
3. Konfokal mikroskopi
- Canlı hücre görüntülemesi yapmak için, optimum hücre kültürü koşullarını (37 °C, %5 CO2 konsantrasyonu, %90 nem) korumak için sahnede bir inkübatör kullan.
- Hazırlanan hücreleri sahnedeki inkübatöre yerleştirin.
- Görüntüleme parametrelerini denetim örneklerine göre ayarlayın.
NOT: Önerilen kontrol örnekleri şunlardır: Floresan etiketli yalnızca EV'ler, floresan etiketli hücreler, etiketsiz EV'ler ve etiketlenmemiş hücreler. - 3D konfokal görüntüler elde etmek için hedef hücrelerin derinliğini ve z yönünde yığınlama boyutu aralığını belirleyin.
NOT: Bir Z yığınının kalınlığı 1 μm'dir. Konfokal 3D görüntü alımı 2 dk 34 s sürdü (her Z düzlemi görüntü alımı yaklaşık 8 s; toplam yirmi Z yığını görüntüsü aldı). - Görüntü alımını aynı anda hem hücreye özgü boyanın (yani kırmızı) hem de EV'ye özgü boyanın (yani yeşil) birden fazla z yığılmış görüntüsüne ayarlayın (Şekil 3 ve Şekil 4A).
4. Görüntü işleme
- Ham z yığılmış konfokal görüntüleri analiz etmek ve hücrelere göre EV alımını belirlemek için otomatik görüntü işleme yazılımını kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Eşik parametrelerini hücrelerin floresan sinyaline ve EV'ye özgü boyalara ayarlayın. Hücrelerin sanal yüzeylerini oluşturun (Şekil 4A,B).
- Hücrelerin sanal yüzeylerini oluşturmak için Yeni Yüzeyler Ekle düğmesini tıklatın.
- Yazılım tarafından sağlanan algoritmayı kullanmak için "Algoritma Ayarları" olarak En Kısa Mesafe Hesaplaması'nı seçin, ardından İleri: Kaynak Kanal'ı tıklatın.
- Bu denemede "Kaynak Kanal" olarak Kanal 2 - CMTMR'yi seçin.
- Düzgünleştir'i seçin ve yüzey yumuşatma için uygun değeri "YüzeyLer Ayrıntısı"na koyun.
NOT: 1 piksel ham görüntüleme verilerinde 0,57 μm'yi temsil ettiği için bu deneyde 0,57 μm. - "Eşik" olarak Mutlak Yoğunluk'u seçin.
- Floresan görüntüyü sağlanan algoritma tarafından otomatik olarak eşik oluşturmak için Eşik (Mutlak Yoğunluk): Değer otomatik olarak ayarlanır.
- "Dokunma Nesneleri Böl (Bölge Büyüyor)" olarak etkinleştir'i seçin ve tahmini hücre boyutunun değerini bu denemede 10,0 μm olan "Tohum Noktaları Çapı"na koyun. Ardından İleri: Tohum Noktalarını Filtrele'yi tıklatın.
- Sanal hücre yüzeylerini yapılandırmak için + Ekle düğmesini tıklatın ve Kalite'yi "Filtre Türü" olarak seçin. Görsel bir inceleme ile düşük sınır için uygun değeri (bu denemede 210) ve üst sınır için maksimum değeri (1485) eşikle, ardından Son düğmesini tıklatın.
NOT: Görsel inceleme, bir araştırmacının hücresel alanı ham floresan görüntüden ayırabileceği anlamına gelir. - Ardından, EV'lerin sanal noktalarını oluşturmak için Yeni Noktalar Ekle düğmesini tıklatın.
- "Algoritma Ayarları " olarak Farklı Spot Boyutları (Bölge Büyütme) ve En Kısa Mesafe Hesaplaması'nı seçin, sonra İleri: Kaynak Kanal'ı tıklatın.
- Bu deneyde "Kaynak Kanal" olarak Kanal 1 - Alexa Fluor 488'i seçin.
- Nokta tespiti için uygun değeri "Tahmini XY Çapı"na koyun, bu deneyde 1 μm . Ardından İleri: Filtre Noktaları'nı tıklatın.
- Sanal EV noktalarını yapılandırmak için + Ekle düğmesini tıklatın, Kalite'yi "Filtre Türü" olarak seçin ve görsel bir incelemeyle "Alt Eşik" olarak ayarlayın, bu denemede 100 . Ardından İleri : Bölge Türünü Tespit Edin düğmesini tıklatın.
- "Spot Bölgeler Türü" olarak Mutlak Yoğunluk'u seçin ve İleri: Bölgeleri Tespit Edin'i tıklatın.
- Eşik için, EV nokta bölgesi, bu denemede "Bölge Eşiği" olarak 100 görsel inceleme ile "Bölge Eşiği" ne uygun değeri koyun.
NOT: Görsel inceleme, bir araştırmacının EV alanını ham floresan görüntüden ayırt edebileceği anlamına gelir. - Bölge Birimi'ni "Çap" olarak seçin ve Son'u tıklatın.
- 4.2 adımında (Şekil 4C, i-iv) yerleşik yüzeyin içindeki gruplanmış noktaları bölmek için yazılımın sağladığı algoritmaları kullanın.
- Yerleşik Noktalar'a tıklayın ve Filtreler'e gidin.
- + Ekle düğmesini tıklatın, sonra Yüzey Yüzeylerine En Kısa Mesafe = Filtre Türü olarak Yüzey 1'i seçin ve Seçimi yeni Noktalara Çoğalt düğmesini tıklatın. Alt sınır için en düşük eşik (-7.0) ve üst sınır için uygun değer (-0.5).
NOT: Üst sınırı tahmini Leke yarıçapıyla ayarlayın. Bu deneyde, Spotların tahmini çapı, yani EV noktaları, adım 4.2.11'de 1 μm olarak ayarlanmıştır.; böylece üst sınır 0,5 olabilir.
- Hücrelerin içindeki EV'lerin otomatik sayısı
NOT: Yazılım, hedef hücreler tarafından içselleştirilen sayıyı gösteren hücrelerin içindeki EV sayısını otomatik olarak sayacaktır.- Yerleşik Noktalar 1 seçimini tıklayın [Yüzey yüzeylerine en kısa mesafe = -7,00 ile -0,500 arasındaki Yüzeyler 1].
- İstatistiklere gidin ve değeri "Toplam Nokta Sayısı"ndan dışa aktarma
NOT: Yazılımın sağladığı algoritmalar, hücrelerin sayısını ve hacmini otomatik olarak hesaplar.
- Yukarıda hesaplanan değerlere göre kuluçka dönemi başına EV alımının verimini belirleyin (Şekil 5).
- Hücre sayısını elde etmek için, oluşturulan Yüzeyler 1'i tıklatın, sonra İstatistikler'e gidin ve Genel'den "Toplam Yüzey Sayısı" değerini dışa aktarın.
- Birimi Ayrıntılı'dan dışa aktarmak için ayrıntılı İstatistikler'e gidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz kullanılarak, EV'ler PC3 CCM'den izole edildi ve florofor konjuge EV'ye özgü (CD63) antikor ile etiketlendi (Şekil 1). Etiketli EV'ler 3D konfokal mikroskopi ile başarıyla görselleştirildi (Şekil 2). Etiketli EV'ler, eksozom tükenmiş ortamlarda birkaç saat boyunca hücrelerle inkübe edildi. Kuluçkadan sonra, hücreler ekzoms tükenmiş ortamla yıkandı. Kalan EV'ler inkübasyon sırasında içselleştirildi veya hücrelere yapıştı. Hücre alanı etiketliydi. İçselleştirilmiş EV'ler puncta19,20,24,27 ve bireysel EV (Şekil 3 ve Şekil 4A) olarak görselleştirildi. Bu görüntülerin işlenme sonrası işlenmesi, EV içselleştirmesinin hücrelere görselleştirilmesini ve nicelleştirilmesini sağlar (Şekil 4). Birlikte atılan adımlar, verimli bir şekilde gerçekleştirilen doğru EV alım testini sağlar. Şekil 5, EV alım testinin temsili sonuçlarını göstermektedir. Test, EV alım seviyesinin kuluçka süresinin uzunluğuna bağlı olduğunu gösterir. Prosedür, içselleştirilmemiş EV'lerin (Şekil 4C) sistematik olarak dışlanmasını ve içselleştirilmiş EV sayısının tam olarak mea +emin olmasını sağlar. İçselleştirilmiş EV noktalarının boyut dağılımı hesaplanmıştır (Şekil 6). Ayrıca, içselleştirilmiş EV sayısı, belirli bir hücre için gerçek EV alma oranını belirlemek için alıcı hücrelerin hacmine normalleştirilebilir. Normalleştirme heterojen hücre boyutunu oluşturur ve hücresel yüzey alanıyla ilgili içselleştirilmiş EV sayısını temsil eder. Hücresel yüzey alanı, inkübasyon sırasında EV çivili, ekzozom tükenmiş kültür ortamı ile temas eden hücre alanı olarak tanımlanır.
Şekil 1: Nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz kullanarak EV izolasyonunun ve çip üzerinde etiketlemenin şematik illüstrasyonu. (A) CCM'den EV izolasyonu. (B) EV'lerin çip üzerinde immunofluoresan etiketlemesi. (C) İlişkisiz antikorların uzaklaştırılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Floresan etiketli EV'lerin görüntülenmesi. Floresan etiketli (anti-CD63-Alexa Fluor 488) EV'ler konfokal mikroskop (40x amaç) kullanılarak tespit edildi. (A) Pozitif örnek (anti-CD63-Alexa Fluor 488 etiketli EV). (B) EV etiketlemesi için negatif kontrol 1 (2. antikorlu EV'ler (Alexa Fluor 488) sadece, 1. antikor olmadan). (C) Negatif kontrol 2 (fareli EV'ler (MS) IgG antikoru ve 2. antikor (Alexa Fluor 488)). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İçleştirilmiş EV'lerin 2B görüntüde hücrelere görüntülenmesi. (A) Floresan etiketli (anti-CD63-Alexa Fluor 488, yeşil) EV'ler ve hücreler (CMTMR, kırmızı) inkübasyondan sonra konfokal mikroskop (20x objektif) kullanılarak tespit edildi. (B) Floresan etiketli EV'lerin yalnızca ayrı bir görüntüsü. (C) Floresan etiketli hücrelerin yalnızca ayrı bir görüntüsü. CMTMR ve Alexa Fluor 488 için ekscitasyon/emisyon lazer dalga boyları 560.6/595 (±50) nm ve 487.8/525 (±50) nm'dir. Lazer güç ayarları CMTMR için %3,0 ve Alexa Fluor 488 için %10,0'dır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İçselleştirilmiş EV'lerin görüntüleme sonrası işlemle nicelemesi. (A) EV-uptake testinden elde edilen ham konfokal görüntü. (B) Görüntü işleme yazılımı kullanılarak EV'lerin nokta (yeşil) ve hücrelerin yüzey (kırmızı) olarak sanal olarak işlenmesi. (C, i-iv) Sağlanan algoritma kullanılarak içselleştirilmiş EV'lerin (sarı noktalar) ve içselleştirilmemiş EV'lerin (yeşil noktalar, beyaz ok) ayrımcılığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kuluçka süresinin bir işlevi olarak EV alımı miktarı. (A) Hücre başına içselleştirilmiş EV sayısı. (B) Hücre hacmi başına içselleştirilmiş EV sayısı. İçselleştirilmiş EV sayısı kuluçka süresine bağlı olarak artırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İçselleştirilmiş EV noktalarının boyut dağılımı. EV noktalarının boyutu ölçüldü ve bir dağılım olarak çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Anti-CD63-Alex Fluor 488 etiketli EV'lerin NTA ölçümü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Kuluçka süresinin bir fonksiyonu olarak lizozomlu birlikte lokalize EV miktarı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Kuluçka süresinin bir işlevi olarak EV alımı miktarı. (A) Hücre başına içselleştirilmiş EV sayısı. (B) Hücre hacmi başına içselleştirilmiş EV sayısı. İçselleştirilmiş EV sayısı kuluçka süresine bağlı olarak artırıldı. EV örneği RNA boyama boyası ile etiketlenmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konfokal mikroskopi ile 3D floresan görüntülemeye dayalı bir EV alma analizi, etkili bir metodoloji ve hassas analiz sağlar. Bu floresan EV etiketlemesi, EV'lerin görselleştirilmesini kolaylaştırır ve hassas bir EV alma testini başarıyla gerçekleştirir. EV'leri etiketlemek ve artık boyayı çıkarmak için önceki yöntemler, ultracentrifugation (UC) kullanarak yağışı kaldırarak bildirilmiştir; bununla birlikte, UC EV'leri birlikte çökeltebilir ve hareketsiz boya yanlış-pozitif sinyale yol açabilir12,13. Nano filtrasyon bazlı mikroakışkan cihazlar, EV'lerin ve boyaların bu birlikte çökeltilmesini ortadan kaldırır, böylece floresan etiketli EV'lerin kalitesini ve tahlilin özgüllüğünü arttırır. EV alımı, hücre yüzeyindeki yüzeysel EV'lerden ayrı olarak içselleştirilmiş EV'leri ayırt etmek ve ölçmek için hacimsel analizle ölçüldü. EV alımının hacimsel analizi, EV alımının hücre boyutuna göre normalleştirilmesini sağlar. Canlı hücreli EV alma tahlili, sahnede konfokal mikroskop inkübatörü kullanılarak elde edildi. Protokol, canlı hücre kültürleri ve EV'ler gerektiren çalışmalar için geçerlidir. Gerçek zamanlı hücre içi EV izleme, 3D pencerede gerçekleştirilebilir. Ek olarak, ev kaçakçılığı analizi mekansal-zamansal çözünürlüğün yanı sıra EV'lerin hücre altı organellerle birlikte lokalizasyonu protokol yoluyla elde edilebilir (Ek Şekil 2). Burada açıklanan protokol, EV'lerin hücresel analizi için güçlü bir araçtır.
Protokolün tüm avantajlarına rağmen, potansiyel sınırlamalar vardır. Bu çalışmada kullanılan nano-filtrasyon mikroakışkan cihaz, EV izolasyonu sırasında diğer kirleticileri birlikte izole edebilir. Düşük yoğunluklu lipoproteinler EV'lere benzer ve izolasyon sırasında zara yakalanabilir28. EV'ye özgü belirteçler EV'leri belirtebilse de, birlikte yalıtılmış kirleticiler aşağı akış analizini etkileyebilir. Bu yazıda, EV'ler CD63 konjuge Alexa Fluor 488 boya ile etiketlenmiştir. Bu etiketleme, EV algılamasının özgüllüğünü artırır; bununla birlikte, EV yüzey molekülünü de bağlar ve rekabetçi bağlamayı arttırır. Ayrıca, EV alma düzeyi hücre çizgisine ve CCM'ye bağlı olabilir. Bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan etiketleme yöntemleri lipofilik boyalar, sitozolitik boyalar ve RNA boyaları gibi diğer boyama boyalarına uyarlanabilir (Ek Şekil 3). Protokol, EV'lerin küçük sinyalini tespit etmek için bir ışık tarama konfokal mikroskobu (LSCM) kullanır. LSCM yoğun lazerlere dayanır ve sonuç olarak, canlı hücreler uzun süreli lazer ekscitasyonu ile hasar görebilir veya değiştirilebilir. Hızlı alım hızı, dönen disk konfokal mikroskobu (SDCM) kullanarak fotodamajı azaltabilir. SDCM, kısa mesafeli hareketleri görselleştirmek için kısa süreli görüntüleme gerektiren EV izlemede de kullanılabilir.
Bu potansiyel sınırlamalara rağmen, önerilen protokol EV alımı değerlendirmesi için verimli bir yöntem sağlar ve daha fazla canlı hücre EV izleme analizi potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.-K. Cho, Labspinner'a (Ulsan, Kore) lisanslı nano-filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz Exodisc'in patentlerinin mucididir. Diğer tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma NCI grant nos tarafından desteklendi. U54CA143803, CA163124, CA093900 ve CA143055 için K. J. P. Bu araştırma, Kore Sağlık Ve Refah Bakanlığı, Kore Cumhuriyeti (hibe numarası: HI19C1122) tarafından finanse edilen Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi'nin hibesi ile desteklenmiştir. J. Kim ve Y.-K. tarafından çalışılarak. Cho, Kore Hükümeti tarafından finanse edilen Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R020-D1) tarafından desteklendi. Yazarlar, brady üroloji enstitüsünün mevcut ve geçmiş üyelerine, özellikle Pienta-Amend laboratuvarı üyelerine, makalenin eleştirel okumaları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
