Summary
Ekstracellulære vesicles (ELBILER) bidrar til cellulær biologi og intercellulær kommunikasjon. Det er behov for praktiske analyser for å visualisere og kvantifisere elbiler opptak av cellene. Den nåværende protokollen foreslår EV-opptaksanalysen ved å bruke tredimensjonal fluorescensavbildning via konfokal mikroskopi, etter EV-isolasjon av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet.
Abstract
Det er behov for praktiske analyser for å visualisere og kvantifisere cellenes ekstracellulære vesicle (EV) opptak. EV-opptak spiller en rolle i intercellulær kommunikasjon på ulike forskningsfelt; kreftbiologi, nevrovitenskap og legemiddellevering. Mange EV-opptaksanalyser er rapportert i litteraturen; Det er imidlertid mangel på praktisk, detaljert eksperimentell metodikk. EV-opptak kan vurderes ved fluorescerende merking av elbiler for å oppdage deres plassering i celler. Det er vanskelig, men likevel kritisk å skille mellom internaliserte elbiler i celler og overfladiske elbiler på celler, men likevel kritisk, for å nøyaktig bestemme EV-opptaket. Derfor foreslås en analyse som effektivt kvantifiserer EV-opptak gjennom tredimensjonal (3D) fluorescens konfektmikroskopi i dette arbeidet. Fluorescerende merkede elbiler ble tilberedt ved hjelp av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet, visualisert av 3D-konfokal mikroskopi, og deretter analysert gjennom avansert bildebehandlingsprogramvare. Protokollen gir en robust metodikk for å analysere elbiler på cellenivå og en praktisk tilnærming for effektiv analyse.
Introduction
Ekstracellulære vesicles (ELBILER) er nano-størrelse, lipid membranbundne partikler som er kategorisert etter deres størrelser: ektosomer (100-500 nm) og eksosomer (50-150 nm)1. Elbiler inneholder ulike biomolekyler, som proteiner, nukleinsyrer og lipider. Disse biomolekylene stammer fra cellene før de blir innkapslet som last og sluppet ut i det ekstracellulære rommet via elbiler1,2,3.
På grunn av mangfoldet av lasten antas elbiler å spille en aktiv rolle i intercellulær kommunikasjon. Frigjøring og opptak av elbiler etter celler tillater overføring av biomolekyler mellom cellene4,5. Innføringen av EV-last til en celle kan endre mottakercellens funksjoner og homeostatisk tilstand4,5,6. Elbiler internaliseres gjennom flere veier; De eksakte mekanismene er imidlertid ikke nøyaktig demonstrert.
Flertallet av EV-opptaksanalysene, som genetisk merking, merker fluorescerende individuelle elbiler7. Det resulterende signalet kan måles ved mikroplatefotometer, strømningscytometri eller mikroskopi, der hver teknologi har betydelige begrensninger. Mikroplatefotometre, strømningscytometri eller standard todimensjonal (2D) mikroskopi kan ikke skille mellom internalisert og overfladisk festet ELBILER8,9. I tillegg kan den nødvendige prøveforberedelsen for hver av disse teknikkene introdusere ytterligere problemer for EV-opptaksevaluering. For eksempel kan løfting av tilkoblede celler med trypsin før EV-opptaksanalysen spalte noen overfladisk festet elbiler på cellens overflate10,11. Trypsin kan også samhandle med celleoverflaten, som påvirker celle- og EV-fenotypen. I tillegg kan trypsin ikke løsne overfladiske elbiler helt, og forskyve isolerte populasjoner.
For å nøyaktig merke elbiler med fluorescerende fargestoffer, er det nødvendig med ytterligere vasketrinn for å fjerne gjenværende fargestoff7. Aksepterte isolasjonsteknikker kan også bidra til falske positive signaler på grunn av koagulasjon som oppstår under EV-isolasjon. For eksempel er seriell ultracentrifugation (UC) mye brukt til å isolere elbiler og fjerne det immobiliserte fargestoffet. UC kan imidlertid samtidig utfelle elbiler, og restfargen kan føre til et falskt positivt signal12,13. Andre nanofiltreringsmetoder, for eksempel kolonnebasert filtrering, er også mye brukt til ikke-immobilisert fargefjerning. Den komplekse naturen til elbiler og fargestoffer som samhandler innenfor kolonnematrisen, kan føre til ufullstendig fjerning av gjenværende fargestoff på grunn av molekylær avskjæring av kolonnen som endres av den komplekse inngangen14,15,16.
Den nåværende protokollen foreslår en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet for å isolere og vaske fluorescerende merkede isolerte elbiler. Den nanofiltreringsbaserte mikrofluidiske enheten kan gi effektiv filtrering via væskeassistert separasjonsteknologi (FAST)17,18. FAST reduserer trykkfallet over filteret, og reduserer dermed potensiell aggregering mellom elbiler og fargestoffer. Ved å effektivt fjerne gjenværende fargestoff, er det mulig å forbedre kvaliteten på fluorescerende merkede elbiler og analysens spesifisitet.
Konfokal mikroskopi kan skille mellom internaliserte og overfladisk tilkoblede elbiler på celleoverflaten og undersøke de cellulære mekanismene for EV-opptak i en romlig oppløsning19,20,21,22,23,24,25. For eksempel beskrev Sung et al. visualiseringen av eksosomets livssyklus ved hjelp av deres utviklede live-celle reporter. Plasseringen av de internaliserte ELBIL-ene ble oppdaget og analysert ved hjelp av et konfokalt mikroskop i tredimensjonale (3D) og etterbildebehandlingsverktøy20. Selv om størrelsen på små elbiler (40-200 nm) er under oppløsningsgrensen for det optiske mikroskopet, kan de fluorescerende merkede ELBIL-ene oppdages ved konfektmikroskopi siden fotodetektoren kan oppdage det forbedrede fluorescensutslippet. Derfor kan den subcellulære lokaliseringen av fluorescerende merkede elbiler i en celle bestemmes nøyaktig ved å skaffe flere z-stablede bilder av ELBIL-ene og de omkringliggende cellulære organellene.
I tillegg kan 3D-rekonstruksjon og etterdatabehandling gi ytterligere innsikt i plasseringen av de internaliserte, overfladiske og frittflytende ELBIL-ene. Ved å bruke disse prosessene i forbindelse med tidsforløpet live-celle bildebehandling som tilbys av konfektmikroskopi, kan nivået av EV-opptak evalueres nøyaktig, og sanntidssporing av EV-opptak er også mulig. Videre kan EV trafficking analyse utføres ved hjelp av konfokal mikroskopi ved å vurdere samlokalisering av elbiler med organeller, et første skritt for å bestemme hvordan internaliserte elbiler er involvert i den intracellulære funksjonen. Denne protokollen beskriver metodikken for å utføre en EV-opptaksanalyse ved hjelp av nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet17,26, konfikal mikroskopi og analyse etter bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EV-isolasjon og immunfluorescerende EV-merking på chip
- Innsamling av cellekulturmedier (CCM) og forhåndsbehandling av CCM for EV-isolasjon
- Frø PC3 celler ved 30% samløp i en 75 cm2 cellekultur kolbe. Tillat at kontrollceller vokser til 90 % samløp (~48 h) i standard medie- og cellelinjespesifikke tillegg.
MERK: For å forhindre at EV-inneholdende komponenter påvirker cellulært opptak (dvs. foster bovint serum), bruk exosome-utarmede medier og kosttilskudd. - Høst CCM.
- Sentrifuger CCM ved 1000 x g i 10 minutter ved romtemperatur (RT) for å pellet eventuelle ikke-tilknyttede celler og store rusk høstet med media. Overfør supernatanten til et nytt konisk rør.
- I det nye røret sentrifugerer du supernatanten på 10.000 x g i 20 min ved 4 °C for å pellet mindre rusk og apoptotiske kropper som er igjen i media. Noen større elbiler vil pellets. Overfør supernatanten til et nytt rør.
- Filtrer supernatanten gjennom et 0,45 μm hydrofilt polyvinyllidfluorid (PVDF) membransprøytefilter.
MERK: Hvis du ikke umiddelbart behandler CCM for EV-isolasjon, må du oppbevare den forhåndsbehandlede CCM ved -80 °C til isolasjonen er utført. Hvis frosset, begrens fryse-tine sykluser til en.
- Frø PC3 celler ved 30% samløp i en 75 cm2 cellekultur kolbe. Tillat at kontrollceller vokser til 90 % samløp (~48 h) i standard medie- og cellelinjespesifikke tillegg.
- EV-isolasjon fra CCM ved hjelp av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet
- Hvis den er frossen, tiner du CCM og virvel helt i 30 s før trinn 1.2.2.
- Injiser 1 ml forhåndsbehandlet CCM (trinn 1.1) i prøvekammeret til den nanofiltreringsbaserte mikrofluidiske enheten (se materialtabellen)17,26.
MERK: Følg standard driftsprosedyre for nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet17,26. - Spinn ved 3000 o/min i 10 minutter i den stasjonære spinnemaskinen (se Materialbord) for å betjene den mikrofluidiske enheten.
MERK: Hvis CCM forblir på prøvekammeret etter første kjøring, utfør flere spinn til alle CCM har tømt fra prøvekammeret. - Fjern væsken fra avfallskammeret ved å pipettere og gjenta trinn 1.2.1, 1.2.2 og 1.2.3 to ganger.
MERK: Totalt vil 3 ml CCM bli behandlet for EV-isolasjon. - Injiser 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) i prøvekammeret for å vaske de isolerte ELBIL-ene. Spinn inn den stasjonære spinnemaskinen for bruk av den mikrofluidiske enheten som nevnt i trinn 1.2.3. Finn de rene ELBIL-ene på membranen på enheten.
MERK: Kvaliteten på elbiler isolert fra den nanofiltreringsbaserte mikrofluidiske enheten ble spesielt bekreftet og sammenlignet med den konvensjonelle UC-metoden ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM), skanning av elektronmikroskop (SEM), nanopartikkelsporingsanalyse (NTA), strukturert belysningsmikroskopi, enzymbundet immunosorbentanalyse og sanntids PCR i forrige forskning17,26.
- Immunfluorescerende merking av EV ved bruk av nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet (figur 1)
- Velg et EV-spesifikt antistoff i henhold til formålet med analysen (se Materialfortegnelse).
MERK: Visse antistoffer kan forstyrre ligandbindingssteder som er spesifikke for EV-opptaksveier (dvs. endokytose). - Injiser 1 μg/ml av det EV-spesifikke antistoffet i elutionhullet på enheten som inneholder 100 μL isolerte elbiler.
- Inkuber i 1 time i mørket på RT på en plate shaker for å sikre jevn fordeling av antistoffet over prøven.
- Fest et tape til elutionhullet. Injiser 1 ml PBS i prøvekammeret for å vaske ut eventuelle gjenværende antistoffer.
- Snurr enheten ved 3000 o/min til prøvekammeret er tomt. Fjern væske fra avfallskammeret ved å pipettere. Injiser 1 ml PBS i prøvekammeret.
MERK: Fluorescerende merkede elbiler vil bli plassert i membrankammeret. - Pipette de fluorescerende merkede ELBIL-ene (figur 2) fra membrankammeret til et gult rør. Blokker fra lys til bruk.
- Velg et EV-spesifikt antistoff i henhold til formålet med analysen (se Materialfortegnelse).
2. Inkubasjon av cellene med fluorescerende merkede elbiler for EV-opptaksanalysen
- Målcellesåing og kultur på cellekulturkompatible retter.
- Frø 1 x 104 PC3 celler inn i mikroslide 8-brønns plate (9,4 x 10,7 mm for hver brønn) med 0,2 ml medier eller 4 x 104 PC3 celler i en 35 mm tallerken med 1 ml medier. Legg cellene i en cellekulturkompatibel tallerken som består av en tynn deksleslip (tykkelse: 0,18 mm).
MERK: Den tynne dekslen minimerer den ugunstige spredningen av lys. - La cellene holde seg over natten under optimale cellekulturforhold (37 °C, 5 % CO2-konsentrasjon , 90 % fuktighet).
- Vask fulgte celler to ganger med eksosomutarmede medier (beskrevet i trinn 1.1.1).
- Frø 1 x 104 PC3 celler inn i mikroslide 8-brønns plate (9,4 x 10,7 mm for hver brønn) med 0,2 ml medier eller 4 x 104 PC3 celler i en 35 mm tallerken med 1 ml medier. Legg cellene i en cellekulturkompatibel tallerken som består av en tynn deksleslip (tykkelse: 0,18 mm).
- Celleinkubasjon med fluorescerende merkede elbiler.
- Mål konsentrasjonen av fluorescerende merkede elbiler (trinn 1.3.5) ved nanopartikkelsporingsanalyse (NTA, supplerende figur 1). Bestem den optimale konsentrasjonen av fluorescerende merkede elbiler som skal legges til de dyrkede cellene (trinn 2.1.2.).
- Fortynn de fluorescerende merkede ELBIL-ene med eksosom-utarmede medier for å matche ønsket konsentrasjon målt i trinn 2.2.1. (dvs. 7,80 x 109 elbiler (i NTA-verdi) i 200 μL eksosom-utarmede medier.)
- Tilsett de fortynnede ELBIL-ene (trinn 2.2.2) i de vedlagte målcellene som er utarbeidet kl. 2.1.2. Inkuber for eksperimentell tid (dvs. 4, 8 eller 12 timer).
- Vask celler tre ganger med exosome-frie medier for å fjerne eventuelle ikke-internaliserte elbiler.
MERK: Valgfritt: Celler kan fikses etter vask. - Merk cytoplasmaet til de tillevde cellene med 1 μg/ml CMTMR ((5-(og-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetrametylrhodamin) (se Materialtabell) og inkuber i optimale cellekulturforhold (37 °C, 5 % CO2-konsentrasjon , 90 % fuktighet).
MERK: Celleområdefargene skal fluoresce separat fra merkede elbiler for å hjelpe til med å bestemme romlig plassering (internalisert eller overfladisk) av piggete elbiler under EV-opptaksanalysen. - Vask merkede celler to ganger med eksosom-utarmede medier for å fjerne gjenværende fargestoff. Tilsett friske eksosome-utarmede medier til cellene som forberedelse til live-celle konfomisk avbildning.
3. Konfekt mikroskopi
- For å utføre levende celleavbildning, bruk en inkubator på scenen for å opprettholde optimale cellekulturforhold (37 °C, 5 % CO2-konsentrasjon , 90 % fuktighet).
- Plasser de forberedte cellene i inkubatoren på scenen.
- Angi bildeparameterne basert på kontrolleksempler.
MERK: Foreslåtte kontrollprøver inkluderer: Kun fluorescerende merkede elbiler, fluorescerende merkede celler, umerkede elbiler og umerkede celler. - Bestem dybden på målcellene og området for stablingsstørrelse i z-retningen for å hente 3D-konfiskeringsbilder.
MERK: Tykkelsen på en Z-stabel er 1 μm. Det konfokale 3D-bildeanskaffelsen varte i 2 min 34 s (hvert Z-plane-bildeanskaffelse tok omtrent 8 s; totalt tjue Z-stack-bilder). - Sett bildeanskaffelse til flere z-stablede bilder av både cellespesifikk fargestoff (dvs. rød) og EV-spesifikt fargestoff (dvs. grønn) samtidig (figur 3 og figur 4A).
4. Bildebehandling
- Bruk automatisk bildebehandlingsprogramvare for å analysere de rå z-stablede konfokale bildene og bestemme EV-opptaket etter celler (se Materialfortegnelse).
- Sett terskelparametere til det fluorescerende signalet til cellene og EV-spesifikke fargestoffer. Bygg de virtuelle overflatene av celler (figur 4A,B).
- Hvis du vil bygge de virtuelle celleoverflatene, klikker du knappen Legg til nye overflater.
- Velg Kortest distanseberegning som "Algoritmeinnstillinger" for å bruke den medfølgende algoritmen av programvaren, og klikk deretter på Neste: Kildekanal.
- Velg Kanal 2 - CMTMR som "Kildekanal" i dette eksperimentet.
- Velg Jevn og plasser den aktuelle verdien i "Surfaces Detail" for overflateutjevning.
MERK: 0,57 μm i dette eksperimentet siden 1 piksel representerer 0,57 μm i rå bildedata. - Velg Absolutt intensitet som "Tersting".
- Hvis du vil terskeltegne det fluorescerende bildet automatisk av den angitte algoritmen, klikker du Terskelverdi (absolutt intensitet): Verdien angis automatisk.
- Velg Aktiver som "Split touching Objects (Region Growing)" og plasser verdien av estimert cellestørrelse i "Seed Points Diameter", 10,0 μm i dette eksperimentet. Klikk deretter neste: Filtrer frøpunkter.
- Hvis du vil konfigurere de virtuelle celleoverflatene, klikker du på + Legg til-knappen , og deretter velger du Kvalitet som Filtertype. Terskel for den aktuelle verdien (210 i dette eksperimentet) for den lave grensen ved en visuell inspeksjon og maksimumsverdien (1485) for den øvre grensen, og klikk deretter Fullfør .
MERK: En visuell inspeksjon betyr at en forsker kan diskriminere celleområdet fra et rå fluorescerende bilde. - Deretter klikker du på knappen Legg til nye flekker for å bygge de virtuelle prikkene til elbiler.
- Velg Forskjellige spotstørrelser (regionvekst) og Kortest avstandsberegning som "Algoritmeinnstillinger", og klikk deretter Neste: Kildekanal.
- Velg Kanal 1 - Alexa Fluor 488 som "Kildekanal" i dette eksperimentet.
- Sett riktig verdi inn i "Estimert XY Diameter" for spotdeteksjon, 1 μm i dette eksperimentet. Klikk deretter Neste: Filtrer flekker.
- Hvis du vil konfigurere de virtuelle EV-prikkene, klikker du på + Legg til-knappen , velger Kvalitet som "Filtertype" og angir "Nedre terskel" ved en visuell inspeksjon, 100 i dette eksperimentet. Deretter klikker du på knappen Neste: Spotområdetype .
- Velg Absolutt intensitet som Spotregiontype, og klikk deretter Neste: Spotområder.
- For å terskelverdi, regionen ev prikker, sette den aktuelle verdien i "Region Threshold" ved en visuell inspeksjon, 100 som "Region Threshold" i dette eksperimentet.
MERK: En visuell inspeksjon betyr at en forsker kan diskriminere ELBIL-området fra et rå fluorescerende bilde. - Velg Regionvolum som Diameter fra, og klikk deretter Fullfør.
- Bruk programvarens medfølgende algoritmer til å dele de grupperte flekkene inne i den innebygde overflaten i trinn 4.2 (figur 4C, i-iv).
- Klikk på de bygde Spots, og gå deretter inn i Filtre.
- Klikk på + Legg til-knappen , og velg deretter Korteste avstand til overflater overflater = Overflate 1 som filtertype, og klikk deretter Dupliser merket område til nye flekker-knappen . Den laveste terskelen (-7,0 i dette eksperimentet) for den lave grensen og den aktuelle verdien (-0,5) for den øvre grensen.
MERK: Still inn den øvre grensen med den estimerte radiusen til Spots. I dette eksperimentet ble den estimerte diameteren til Spots, det vil si EV-prikker, satt til 1 μm i trinn 4.2.11.; Dermed kan den øvre grensen være 0,5.
- Automatisk telling av elbiler inne i cellene
MERK: Programvaren vil automatisk telle antall elbiler inne i cellene, noe som indikerer tallet internalisert av målcellene.- Klikk det innebygde Spots 1-merket [Korteste avstand til overflater Overflater = Overflater 1 mellom -7,00 og -0,500].
- Gå til statistikken, og eksporter verdien fra "Totalt antall plasser"
MERK: Programvarens medfølgende algoritmer vil automatisk beregne antall og volum av celler.
- Bestem utbyttet av EV-opptak per inkubasjonsperiode basert på de overberegnede verdiene (figur 5).
- Hvis du vil ha tak i antall celler, klikker du de innebygde overflater 1, går deretter til statistikken og eksporterer verdien "Totalt antall overflater" fra Totalt.
- Gå til Detaljert i statistikk for å eksportere volumet fra detaljert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet ble elbiler isolert fra PC3 CCM og merket med et fluoroforkonjugert EV-spesifikt (CD63) antistoff (figur 1). De merkede ELBIL-ene ble visualisert av 3D-konfokalmikroskopi (figur 2). De merkede ELBIL-ene ble inkubert med celler i flere timer i eksosom-utarmede medier. Etter inkubasjon ble celler vasket med eksosom utarmede medier. De resterende ELBIL-ene ble internalisert eller fulgt til celler under inkubasjon. Celleområdet er merket. Internaliserte elbiler ble visualisert som puncta19,20,24,27 og en individuell EV (figur 3 og figur 4A). Etterbehandling av disse bildene gjør det mulig å visualisere og kvantifisere EV-internalisering i cellene (figur 4). Trinnene i forbindelse tillater nøyaktig EV-opptaksanalyse utført effektivt. Figur 5 viser de representative resultatene av EV-opptaksanalysen. Analysen indikerer at nivået på EV-opptaket er avhengig av lengden på inkubasjonsperioden. Prosedyren gjør det mulig for systematisk utelukkelse av ikke-internaliserte elbiler (figur 4C) å nøyaktig mea + sikre antall internaliserte elbiler. Størrelsesfordelingen for internaliserte EV-prikker ble beregnet (figur 6). Videre kan antall internaliserte elbiler normaliseres til mottakercellenes volum for å bestemme den faktiske hastigheten på EV-opptak for den spesifikke cellen. Normalisering står for den heterogene cellestørrelsen og representerer antall internaliserte elbiler angående det cellulære overflateområdet. Cellulært overflateareal er definert som celleområdet i kontakt med EV-spiked, exosome-utarmede kulturmedier under inkubasjon.
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av EV-isolasjon og merking på brikke ved hjelp av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet. (A) EVs isolasjon fra CCM. (B) Immunofluorescent merking av elbiler på brikken. (C) Fjerning av ubundne antistoffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Avbildning av fluorescerende merkede elbiler. De fluorescerende merkede (anti-CD63-Alexa Fluor 488) EVene ble oppdaget ved hjelp av det konfokale mikroskopet (40x objektiv). (A) Positiv prøve (anti-CD63-Alexa Fluor 488 merket elbiler). (B) Negativ kontroll 1 for EV-merking (elbiler med andre antistoff (Alexa Fluor 488) bare, uten første antistoff ). (C) Negativ kontroll 2 (elbiler med mus (MS) IgG-antistoff og andre antistoff (Alexa Fluor 488)). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Avbildning av de internaliserte ELBIL-ene i celler i et 2D-bilde. (A) Fluorescerende merket (anti-CD63-Alexa Fluor 488, grønn) ELBILER og cellene (CMTMR, rød) ble oppdaget ved hjelp av det konfokale mikroskopet (20x objektiv) etter inkubasjonen. (B) Kun et separat bilde av de fluorescerende merkede ELBIL-ene. (C) Kun et separat bilde av de fluorescerende merkede cellene. Eksitasjons-/utslippslaserbølgelengdene for CMTMR og Alexa Fluor 488 er 560,6/595 (±50) nm og 487,8/525 (±50) nm. Lasereffektinnstillinger er 3,0 % for CMTMR og 10,0 % for Alexa Fluor 488. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvantifisering av de internaliserte ELBIL-ene etter bildebehandlingsprosessen. (A) Rå konfokalt bilde hentet fra EV-opptaksanalysen. (B) Virtuell gjengivelse av ELBIL-ene som en prikk (grønn) og cellene som en overflate (rød) ved hjelp av bildebehandlingsprogramvaren. (C, i-iv) Diskriminering av internaliserte elbiler (gule prikker) og ikke-internaliserte elbiler (grønne prikker, hvit pil) ved hjelp av den programvaretilsynte algoritmen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Mengden EV-opptak som funksjon av inkubasjonstid. (A) Antall internaliserte elbiler per celle. (B) Antall internaliserte elbiler per cellevolum. Antallet internaliserte elbiler ble økt avhengig av inkubasjonstiden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Størrelsesfordelingen for internaliserte EV-prikker. Størrelsen på EV-prikker ble målt og plottet inn i en fordeling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: NTA-måling av anti-CD63-Alex Fluor 488-merkede elbiler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Mengden samlok lokaliserte elbiler med lysosomer som en funksjon av inkubasjonstid. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Mengden EV-opptak som funksjon av inkubasjonstid. (A) Antall internaliserte elbiler per celle. (B) Antall internaliserte elbiler per cellevolum. Antallet internaliserte elbiler ble økt avhengig av inkubasjonstiden. EV-prøven ble merket med RNA-fargestoff (se Materialtabell). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En EV-opptaksanalyse basert på 3D-fluorescensavbildning via konfikal mikroskopi gir en effektiv metodikk og sensitiv analyse. Denne fluorescerende EV-merkingen letter visualiseringen av elbiler og utfører vellykket en presis EV-opptaksanalyse. Tidligere metoder for merking av elbiler og fjerning av restfargestoffet er rapportert ved å fjerne nedbør ved hjelp av ultracentrifugation (UC); UC kan imidlertid samtidig utfelle elbiler, og det immobiliserte fargestoffet kan føre til et falskt positivt signal12,13. Nanofiltreringsbaserte mikrofluidiske enheter eliminerer denne co-utfellingen av elbiler og fargestoffer, og forbedrer dermed kvaliteten på de fluorescerende merkede ELBIL-ene og analysens spesifisitet. EV-opptak ble målt ved volumetrisk analyse for å skille og kvantifisere de internaliserte elbilene atskilt fra overfladiske elbiler på celleoverflaten. Den volumetriske analysen av EV-opptak gjør det mulig å normalisere EV-opptak etter cellestørrelse. Live-cell EV-opptaksanalysen ble oppnådd ved å bruke den konfiskeringsmikroskopinkubatoren på scenen. Protokollen gjelder studier som krever levende cellekulturer og elbiler. Intracellulær EV-sporing i sanntid kan utføres på tvers av et 3D-vindu. I tillegg kan EV trafficking analyse av romlig-temporal oppløsning sammen med samlokalisering av elbiler med subcellulære organeller oppnås gjennom protokollen (Supplerende figur 2). Protokollen som er beskrevet her er et kraftig verktøy for mobilanalyse av elbiler.
Til tross for alle fordelene med protokollen, er det potensielle begrensninger. Nanofiltreringsmikrofluidisk enhet som brukes i denne studien, kan isolere andre forurensninger samtidig under EV-isolasjon. Lipoproteiner med lav tetthet er like store som elbiler og kan bli fanget i membranen under isolasjon28. Selv om EV-spesifikke markører kan spesifisere elbiler, kan de koisolerte forurensningene påvirke nedstrømsanalysen. I dette manuskriptet ble elbiler merket med et CD63-konjugert Alexa Fluor 488-fargestoff. Denne merkingen øker spesifisiteten for EV-deteksjon. Imidlertid binder det også EV-overflatemolekylet og øker konkurransebindingen. I tillegg kan nivået på EV-opptaket være avhengig av cellelinjen og CCM. Merkingsmetodene som er beskrevet i denne protokollen, kan tilpasses andre fargestoffer som lipofile fargestoffer, cytosoliske fargestoffer og RNA-fargestoffer (supplerende figur 3). Protokollen bruker et lysskanningskonfokalt mikroskop (LSCM) for å oppdage det lille signalet fra elbiler. LSCM er avhengig av intense lasere, og som et resultat kan levende celler bli skadet eller endret ved langvarig lasereksitasjon. Den raske anskaffelseshastigheten kan redusere fotodamage ved å bruke et spinnende platekonfokalt mikroskop (SDCM). SDCM kan også brukes i EV-sporing som krever kort tidsforløpavbildning for å visualisere kortdistansebevegelser.
Til tross for disse potensielle begrensningene, gir den foreslåtte protokollen en effektiv metode for EV-opptaksvurdering og har potensial for videre live-celle EV-sporingsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.-K. Cho er en oppfinner av patentene på den nanofiltreringsbaserte mikrofluidiske enheten Exodisc, som er lisensiert til Labspinner (Ulsan, Korea). Alle andre forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NCI grant nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 og CA143055 til K. J. P. Denne forskningen ble støttet av et tilskudd fra Korea Health Technology R&D Project gjennom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansiert av Departementet for helse og velferd, Republikken Korea (tilskuddsnummer: HI19C1122). Arbeid av J. Kim og Y.-K. Cho ble støttet av Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansiert av den koreanske regjeringen. Forfatterne takker nåværende og tidligere medlemmer av Brady Urological Institute, spesielt medlemmer av Pienta-Amend-laboratoriet, for den kritiske lesningen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
