我们描述了一种以斑马鱼为模型的模式,通过光在脊髓运动神经元中诱导TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)的相变。
异常的蛋白质聚集和选择性神经元脆弱性是神经退行性疾病的两个主要标志。可以通过控制脆弱细胞类型中疾病相关蛋白的相变来询问这些特征之间的因果关系,尽管到目前为止这种实验方法有限。在这里,我们描述了一种在斑马鱼幼虫的脊髓运动神经元中诱导RNA / DNA结合蛋白TDP-43相变的方案,用于模拟肌萎缩性侧索硬化症(ALS)中退行性运动神经元中发生的TDP-43的细胞质聚集。我们描述了一种基于细菌人工染色体(BAC)的遗传方法,该方法选择性地将光遗传学TDP-43变体传递给斑马鱼的脊柱运动神经元。斑马鱼幼虫的高半透明性允许脊髓运动神经元中的光遗传学TDP-43通过使用发光二极管(LED)对无节制的鱼进行简单的外部照明来相变。我们还提供了斑马鱼脊髓运动神经元实时成像的基本工作流程,并使用免费提供的Fiji / ImageJ软件进行图像分析,以表征光遗传学TDP-43对光照的反应。该协议能够在ALS易发细胞环境中表征TDP-43相变和聚集体形成,这应该有助于研究其细胞和行为后果。
核糖核蛋白(RNP)颗粒通过液-液相分离(LLPS)组装无膜分区来控制细胞核和细胞质中的无数细胞活动,这是一种均匀流体分解成两种不同液相的现象1,2。通常作为RNP颗粒组分起作用的RNA结合蛋白的失调LLPS促进异常相变,导致蛋白质聚集。这一过程与神经发育和神经退行性疾病有关3,4,5。精确评估RNA结合蛋白异常LLPS与疾病发病机制之间的因果关系对于确定LLPS是否以及如何被利用为有效的治疗靶点至关重要。RNA结合蛋白的LLPS 在体外 和单细胞模型中相对容易研究,但在多细胞生物中却很困难,特别是在脊椎动物中。在组织环境中的单个细胞中分析这种LLPS的关键要求是稳定地表达探针,以便在感兴趣的疾病易感细胞类型中对LLPS进行成像和操作。
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种最终致命的神经系统疾病,其中大脑和脊髓的运动神经元由于变性而选择性地逐渐丧失。迄今为止,超过25个基因的突变与ALS的可遗传(或家族性)形式有关,ALS占ALS总病例的5%-10%,其中一些ALS致病基因编码由RNPs组成的RNA结合蛋白,如hnRNPA1,TDP-43和FUS6,7。 此外,占ALS总病例90%-95%的散发形式的特征在于沉积在退化运动神经元中的TDP-43的细胞质聚集。这些ALS相关RNA结合蛋白的一个主要特征是它们的内在无序区域(IDR)或低复杂性结构域缺乏有序的三维结构,并且介导与驱动LLPS7,8的许多不同蛋白质的弱蛋白质 – 蛋白质相互作用。ALS致病突变经常发生在IDR中,这一事实导致人们认为这些ALS相关蛋白的异常LLPS和相变可能是ALS发病机制的基础9,10。
最近,开发了optoDroplet方法,一种基于Cryptochrome 2的光遗传学技术,允许通过光调节蛋白质 – 蛋白质相互作用,以诱导具有IDRs11的蛋白质的相变。由于该技术已成功扩展到TDP-43,它已经开始揭示TDP-43病理相变及其相关细胞毒性的潜在机制12,13,14,15。在该协议中,我们概述了一种将光遗传学TDP-43传递给ALS易感细胞类型的遗传方法,即斑马鱼中的脊柱运动神经元使用BAC对 mnr2b / mnx2b 基因编码运动神经元规范的同源结构域蛋白16,17。斑马鱼幼虫的高半透明性允许对光遗传学TDP-43进行简单,无创的光刺激,从而触发其在脊髓运动神经元中的相变。我们还提供了使用免费提供的Fiji / ImageJ软件对斑马鱼脊髓运动神经元进行实时成像和图像分析的基本工作流程,以表征光遗传学TDP-43对光刺激的反应。这些方法允许在ALS易感细胞环境中研究TDP-43相变,并应有助于在细胞和行为水平上探索其病理后果。
斑马鱼中opTDP-43h和EGFP-TDP-43z的 mnr2b-BAC介导的表达为脊髓运动神经元中TDP-43相变的活体成像提供了独特的机会。斑马鱼幼虫身体组织的光学透明度允许对opTDP-43h进行简单和无创的光遗传学刺激。随着时间的推移,单个脊髓运动神经元之间的比较表明,opTDP-43h的光依赖性齐聚化导致其细胞质聚类,这让人联想到ALS病理学。
定义内在无序蛋白质的相行为的关键参数之一是细?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了SERIKA基金(KA),KAKENHI拨款编号JP19K06933(KA)和JP20H05345(KA)的支持。
Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
Incubator | MEE | CN-25C | |
LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
Six-well dish | FALCON | 353046 | |
Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |