Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetische faseovergang van TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Summary

We beschrijven een protocol om faseovergang van TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) te induceren door licht in de spinale motorneuronen met zebravissen als model.

Abstract

Abnormale eiwitaggregatie en selectieve neuronale kwetsbaarheid zijn twee belangrijke kenmerken van neurodegeneratieve ziekten. Causale relaties tussen deze kenmerken kunnen worden onderzocht door de faseovergang van een ziekte-geassocieerd eiwit in een kwetsbaar celtype te beheersen, hoewel deze experimentele benadering tot nu toe beperkt is geweest. Hier beschrijven we een protocol om faseovergang van het RNA /DNA-bindende eiwit TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven te induceren voor het modelleren van cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 die optreedt in degenererende motorneuronen bij amyotrofische laterale sclerose (ALS). We beschrijven een bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) -gebaseerde genetische methode om selectief een optogenetische TDP-43-variant af te leveren aan spinale motorneuronen van zebravissen. De hoge doorschijnendheid van zebravislarven zorgt voor de faseovergang van de optogenetische TDP-43 in de spinale motorneuronen door een eenvoudige externe verlichting met behulp van een lichtgevende diode (LED) tegen ongeremde vissen. We presenteren ook een basisworkflow van live beeldvorming van de spinale motorneuronen van de zebravis en beeldanalyse met vrij beschikbare Fiji / ImageJ-software om reacties van de optogenetische TDP-43 op de lichtverlichting te karakteriseren. Dit protocol maakt de karakterisering van TDP-43 faseovergang en geaggregeerde vorming in een ALS-kwetsbare cellulaire omgeving mogelijk, wat een onderzoek naar de cellulaire en gedragsmatige gevolgen ervan zou moeten vergemakkelijken.

Introduction

Ribonucleoproteïne (RNP) korrels regelen een groot aantal cellulaire activiteiten in de kern en het cytoplasma door membraanloze partities te assembleren via vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS), een fenomeen waarbij een homogene vloeistof zich ontmengt in twee verschillende vloeibare fasen1,2. De ontregelde LLPS van RNA-bindende eiwitten die normaal functioneren als RNP-korrelcomponenten bevorderen abnormale faseovergang, wat leidt tot eiwitaggregatie. Dit proces is betrokken bij neurologische en neurodegeneratieve ziekten3,4,5. De precieze evaluatie van een oorzakelijk verband tussen afwijkende LLPS van RNA-bindende eiwitten en ziektepathogenese is cruciaal om te bepalen of en hoe LLPS kan worden benut als een effectief therapeutisch doelwit. LLPS van RNA-bindende eiwitten is relatief eenvoudig te bestuderen in vitro en in eencellige modellen, maar is moeilijk in meercellige organismen, vooral bij gewervelde dieren. Een kritieke vereiste voor het analyseren van dergelijke LLPS in individuele cellen in een weefselomgeving is om stabiel een sonde uit te drukken voor de beeldvorming en manipulatie van LLPS in een ziektegevoelig celtype van belang.

Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een uiteindelijk fatale neurologische aandoening waarbij motorneuronen van de hersenen en het ruggenmerg selectief en progressief verloren gaan als gevolg van degeneratie. Tot op heden zijn mutaties in meer dan 25 genen geassocieerd met de erfelijke (of familiale) vorm van ALS, die goed is voor 5%-10% van de totale ALS-gevallen, en sommige van deze ALS-veroorzakende genen coderen voor RNA-bindende eiwitten bestaande uit RRP's, zoals hnRNPA1, TDP-43 en FUS6,7. Bovendien wordt de sporadische vorm van ALS, die goed is voor 90%-95% van de totale ALS-gevallen, gekenmerkt door de cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 afgezet in degenererende motorneuronen. Een belangrijk kenmerk van deze ALS-geassocieerde RNA-bindende eiwitten zijn hun intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) of laagcomplexe domeinen die geordende driedimensionale structuren missen en zwakke eiwit-eiwitinteracties bemiddelen met veel verschillende eiwitten die LLPS7,8 aandrijven. Het feit dat ALS-veroorzakende mutaties vaak voorkomen in de IDR's heeft geleid tot het idee dat afwijkende LLPS en faseovergang van deze ALS-gerelateerde eiwitten ten grondslag kunnen liggen aan als pathogenese9,10.

Onlangs werd de optoDroplet-methode ontwikkeld, een op Cryptochrome 2 gebaseerde optogenetische techniek die de modulatie van eiwit-eiwitinteracties door licht mogelijk maakt, om faseovergang van eiwitten met IDR's te induceren11. Aangezien deze techniek met succes is uitgebreid tot TDP-43, is het begonnen met het blootleggen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologische faseovergang van TDP-43 en de bijbehorende cytotoxiciteit12,13,14,15. In dit protocol schetsen we een genetische methode om een optogenetische TDP-43 af te leveren aan ALS-kwetsbare celtypen, namelijk spinale motorneuronen in zebravissen met behulp van de BAC voor het mnr2b/mnx2b-gen dat codeert voor een homeodomain-eiwit voor motorneuronspecificatie16,17. De hoge doorschijnendheid van zebravislarven zorgt voor eenvoudige, niet-invasieve lichtstimulatie van de optogenetische TDP-43 die de faseovergang in de spinale motorneuronen veroorzaakt. We presenteren ook een basisworkflow voor de live beeldvorming van de spinale motorneuronen van de zebravis en beeldanalyse met behulp van de vrij beschikbare Fiji / ImageJ-software om de reacties van de optogenetische TDP-43 op de lichtstimulatie te karakteriseren. Deze methoden maken een onderzoek mogelijk naar de TDP-43-faseovergang in een ALS-kwetsbare cellulaire omgeving en moeten helpen om de pathologische gevolgen ervan op cellulair en gedragsmatig niveau te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al het viswerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van het Institutional Animal Care and Use Committee (goedkeuringsidentificatienummer 24-2) van het National Institute of Genetics (Japan), dat een Animal Welfare Assurance in het bestand heeft (zekerheidsnummer A5561-01) bij het Office of Laboratory Animal Welfare van de National Institutes of Health (NIH, VERENIGDE STATEN).

1. Constructie van BACs voor expressie van het optogenetische TDP-43 gen van de mnr2b promotor

  1. BAC-bereiding
    1. Koop een ZEBRAVIS BAC kloon met daarin de zebravis mnr2b locus (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Zuiver het BAC-DNA uit een 5 ml nachtelijke LB-cultuur van DH10B Escherichia coli (E. coli) met CH211-172N16 zoals beschreven in Warming et al.18.
    2. Transformeer CH211-172N16 in SW102 E. coli-cellen door elektroporatie, zoals beschreven in Warming et al.18.
      OPMERKING: Zuivering van het BAC-DNA van de E. coli op dezelfde dag van elektroporatie geeft meestal een hoger slagingspercentage van BAC-transformatie18. Anders wordt het gezuiverde BAC-DNA tot gebruik op -20 °C gehouden.
    3. Introduceer de iTol2-amp cassette voor Tol2 transposon-gemedieerde BAC transgenese19 in de ruggengraat van CH211-172N16 door elektroporatie, zoals beschreven in Asakawa et al.20.
      1. Maak een glycerolvoorraad van de E. coli-celklonen met CH211-172N16 met de iTol2-amp cassette-integratie (CH211-172N16-iTol2A) na bevestiging van de homologe recombinatie-gemedieerde integratie door polymerasekettingreactie (PCR) (Ex Taq) met behulp van het primerpaar Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') en pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') en de volgende voorwaarden: een denaturatiestap bij 98 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 25 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s, primergloeien bij 55 °C gedurende 15 s en primerverlenging bij 72 °C gedurende 1 minuut, waarbij een PCR-product van 354 basenparen (bp) wordt versterkt.
  2. mnr2b-hs: opTDP-43h constructie
    1. Construeer een plasmide met de expressiecassette voor de menselijke wild-type TDP-43/TARDBP (TDP-43h) die is getagd met mRFP1 en CRY2olig op respectievelijk de N- en C-termini (hierna opTDP-43h)14.
      OPMERKING: Het opTDP-43h-fragment moet worden geflankeerd door de zebravis hsp70l genpromotorsequentie (650 bp) en polyadenylation (polyA) signaalsequentie, gevolgd door een kanamycineresistentiegen (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Versterk de hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan cassette met primers die hsp70l en Kan gloeien en 45 bp sequenties bevatten van de upstream en downstream van de initiator codons van het mnr2b gen door PCR (GXL DNA Polymerase) met behulp van het primerpaar mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CTT CCA GAA C-3') en Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') met de volgende voorwaarden: een denaturatiestap bij 98 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 30 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s, primergloeien bij 55 °C gedurende 15 s en primerverlenging bij 68 °C gedurende 30 s, versterking van een PCR-product van ~5,7 bp.
    3. Scheid de PCR-producten door agarosegel-elektroforese (100 V) en zuiver de Hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA-band met een DNA-kolom. Stel de concentratie van de gezuiverde hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan cassette in op 50 ng/μL in Tris-EDTA buffer (TE) met 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 1 mM EDTA.
    4. Introduceer de hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan cassette in CH211-172N16-iTol2A door elektroporatie zoals beschreven in Warming et al.18 en selecteer ampicilline- en kanamycine-resistente transformanten op LB-agarplaten. CH211-172N16-iTol2A met de hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan cassette wordt aangeduid als mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Zuiver mnr2b-hs:opTDP-43h met behulp van een BAC-zuiveringskit en los het op bij 250 ng / μL in TE na fenol / chloroformextractie.
  3. mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z constructie
    1. Bouw een ander plasmide met de zebravis wild-type tardbp die is gemarkeerd met verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) op zijn N-eindpunt (EGFP-TDP-43z) in plaats van opTDP-43h, maar verder identiek is aan de hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan construct (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Gebruik EGFP-TDP-43z als interne controle voor de lichtstimulatie van opTDP-43h.
    2. Bouw CH211-172N16-iTol2A met de hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan cassette in de mnr2b locus zoals beschreven in 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A met de hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan cassette wordt aangeduid als mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Tol2 getransponeerde BAC-transgenese bij zebravissen

  1. Bereid de injectieoplossing met 40 mM KCl, fenolrood (10% v/v), 25 ng/μL mnr2b-hs:opTDP-43h DNA en 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA19.
  2. Injecteer 1 nL van de injectieoplossing (een druppel met een diameter van ongeveer 123 μm gekalibreerd in minerale olie) in het cytosol van wildtype zebravisembryo's in het eencellige stadium. Screen de geïnjecteerde vis op de vorming van rood fluorescerend eiwit (RFP)-positieve aggregaten in verschillende embryonale weefsels, waaronder spinale motorneuronen, onder een fluorescentie-stereomicroscoop 2-3 dagen na de bevruchting (dpf). Verhoog de RFP-positieve vis naar volwassenheid.
  3. Injecteer het mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA zoals beschreven in 2.1 en 2.2. Verhoog EGFP-positieve vissen naar volwassenheid.
  4. Zet na een paar maanden seksueel gerijpte geïnjecteerde vissen en wild-type vissen in paren in standaard 2 L paringskooien om F1-nakomelingen te verkrijgen. Screen F1 vissen met 3 dpf voor RFP (opTDP-43h) of EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescentie in de wervelkolom met behulp van een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een Plan-Neofluar 5x / 0.15 objectieflens. Typisch wordt één stichtervis geïdentificeerd uit 10−20 geïnjecteerde vissen (de overdrachtssnelheid van de kiembaan is 5%−10%).
  5. Isoleer en vergelijk meerdere Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] en Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] inserts van verschillende founder fish, omdat de intensiteit, maar niet het patroon, van opTDP-43h of EGFP-TDP-43z expressie kan variëren tussen founder fish als gevolg van chromosomale positie-effecten.
  6. Kruis Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] en Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] vislijnen om nakomelingen te verkrijgen die Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vis bevatten in een Mendeliaanse verhouding.
  7. Breng de vis in een plastic schaal met 30 ml E3-buffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% methyleenblauw) en voeg 0,003% (w/ v) N-fenylthiourea toe bij 8-10 uur na de bevruchting (hpf) om melanogenese te remmen.
  8. Dek de plastic schaal af met aluminiumfolie na 30 pkf.

3. Voorbereiding van LED voor verlichting met blauw licht

  1. Schakel een LED-paneel in met behulp van de bijbehorende toepassing die op een tablet/telefoon is geïnstalleerd. Plaats de sonde van een spectrometer in een lege put van een 6-put schotel en pas het LED-licht aan op de golflengte die piekt op ~ 456 nm door de toepassing. Plaats de optische sensor van een optische vermogensmeter in de lege put en pas het vermogen van het LED-licht aan (~ 0,61 mW / cm2). De LED-lichtinstelling kan worden opgeslagen en is opvraagbaar in de toepassing.
  2. Introduceer de instelling van de schotel/LED-paneel in de couveuse bij 28 °C. Voltooi deze stap voordat het afbeelden van vissen begint bij 48 pkf.

4. Beeldvorming van zebravislarven die optogenetische TDP-43 tot expressie brengen

  1. Selecteer Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vis ten minste vóór 47 hpf, op basis van RFP (opTDP-43h) of EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescentie in de wervelkolom met behulp van de hierboven beschreven epifluorescentiemicroscoopopstelling.
  2. Dechorioneer de Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vissen.
  3. Verwarm 1% agarose bij lage smelttemperatuur met 250 μg/ml ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaatzout bij 42 °C.
  4. Verdooi kort Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] dubbeltransgene vis bij 48 hpf in E3-buffer met dezelfde concentratie Tricane.
  5. Leg een druppel van de voorverwarmde 1% lage smelttemperatuur agarose op de glazen basisschaal op kamertemperatuur. De diameter van de koepelvormige agarose-druppel op de glazen schaal is 8-10 mm.
  6. Voeg met behulp van een Pasteur-pipet de verdoofde vis toe aan de lage smelttemperatuur op de glazen basisschaal en meng vervolgens door een paar keer te pipetteren. Minimaliseer de hoeveelheid van de E3-buffer die samen met de vis aan de agarose wordt toegevoegd.
  7. Houd de vis op zijn kant door een spuitnaald te gebruiken tijdens de stolling van agarose (meestal ~ 1 min) om ervoor te zorgen dat het ruggenmerg zich in een geschikte horizontale positie bevindt. Leg na de stolling een paar druppels E3-buffer op de koepelvormige agarose-gemonteerde vis.
  8. Verkrijg seriële confocale z-secties van het ruggenmerg door te scannen met een confocale microscoop uitgerust met een 20x wateronderdompelingsobjectieflens met het numerieke diafragma 1,00, met behulp van een scansnelheid van 4,0 μs per pixel (12 bits per pixel), een stapgrootte van 1,0 μm per plak voor het objectief en een combinatie van excitatie / emissiegolflengten: Kanaal 1) 473/510 nm voor EGFP en kanaal 2) 559/583 nm voor mRFP1.
    OPMERKING: De cloaca aan de ventrale kant van de vis is opgenomen in de interessegebieden (ROI) als referentie, wat helpt bij het identificeren en vergelijken van de spinale segmenten (niveaus 16-17) over de tijdspunten.
  9. Verwijder de vis uit de agarose door de agarose voorzichtig te kraken met een spuitnaald zodra de beeldvorming is voltooid. Houd de hoeveelheid tijd dat de vis in de agarose is ingebed zo kort mogelijk, hoewel de agarose-inbedding gedurende <30 minuten de levensvatbaarheid van de vis niet beïnvloedt.

5. Lichtstimulatie van opTDP-43h-uitdrukkende vissen door veldverlichting van een blauw lichtgevende diode (LED) licht

  1. Voeg 7,5 ml E3-buffer toe aan de put en plaats de afgebeelde Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vis in de put. Plaats de schotel met zes putten op het LED-paneel door de schotel en het LED-paneel 5 mm uit elkaar te houden met een afstandhouder (bijvoorbeeld met vijf schuifglazen gestapeld).
  2. Schakel het blauwe LED-lampje in. Bewaar een deel van de Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vis in een aparte zes-well schotel bedekt met aluminiumfolie wanneer niet-gedelumineerde controlevis nodig is (d.w.z. in donkere omstandigheden)14.
  3. Na de verlichting (bijvoorbeeld gedurende 24 uur bij 72 pkf in figuur 3) stelt u het ruggenmerg van de verlichte vis in beeld door de stappen 4.3 - 4.9 te herhalen.

6. Visualisatie van cytoplasmatische verplaatsing van optogenetische TDP-43 in de spinale motorneuronen

  1. Open het afbeeldingsbestand in ImageJ/Fiji21 (Versie: 2.1.0/1.53c), een open-source Java-beeldverwerkingsprogramma ontwikkeld door NIH Image, dat kan worden gedownload van https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Gebruik de Z-schuifbalk om door de brandpuntsvlakken te bewegen. Maak een maximale intensiteitsprojectie van meerdere segmenten door op Afbeelding | Stapels | Z project | Maximale intensiteit en het instellen van startsegment en stopsegment die de hemisegmenten van de wervelkolom bedekken.
  3. Splits de meerkanaalsafbeelding in twee afbeeldingen met één kanaal door op Afbeelding | Kleur | Gesplitste kanalen.
  4. Verbeter het EGFP-TDP-43z-signaal om ervoor te zorgen dat cytoplasmatische EGFP-TDP-43z duidelijk zichtbaar is door op Afbeelding | | aanpassen Helderheid/contrast en aanpassing minimum
  5. Open de ROI-manager door te klikken op | Gereedschap | ROI-manager. Zoek de cellen die in beide afbeeldingen identificeerbaar zijn bij 48 hpf en 72 hpf, op basis van de relatieve posities van de cellichamen. Stel de ROI's in door de contouren van cellichamen van enkele spinale motorneuronen te schetsen die worden gevisualiseerd door het EGFP-TDP-43z-signaal met behulp van Freehand-selecties en vervolgens op Toevoegen [t] te klikken in de ROI-manager.
  6. Stel een hoofdas van de soma in door een rechte lijn te tekenen met Recht en op | analyseren te klikken Plot profiel voor EGFP-TDP-43z (C1) en opTDP-43h (C2) beelden bij 48 en 72 hpf.
  7. Normaliseer het plotprofiel door de waarden te delen door de grootste waarde voor elk EGFP-TDP-43z- en opTDP-43h-signaal. Plot de genormaliseerde waarden met x-y-coördinaten, waarbij x en y respectievelijk de hoofdas van de soma en relatieve fluorescerende intensiteiten vertegenwoordigen, met behulp van XY-grafiek in een statistische software.

7. Ratiometrische vergelijking tussen opTDP-43h en EGFP-TDP-43z signalen met behulp van ImageJ / Fiji

  1. Open het afbeeldingsbestand in ImageJ/Fiji en stel ROI's in voor enkele mnr2b-positieve cellen met behulp van een projectiebeeld met maximale intensiteit van EGFP-TDP-43z zoals in 6.1-6.5. Voeg een ROI toe buiten het ventrale ruggenmerg (bijvoorbeeld notochord) om het achtergrondsignaal weer te geven (achtergrond ROI).
  2. Maak voor elke EGFP-TDP-43z- en opTDP-43-afbeelding een projectie van meerdere segmenten door op Afbeelding | Stapels | Z project | Som plakjes op en stel Beginsegment en Stopsegment in die de hemispinale motorkolom bedekken.
  3. Open de ROI-manager die is gemaakt met het projectiebeeld met maximale intensiteit. Geef de ROI's weer op de afbeelding Sum Slices door het afbeeldingsvenster voor EGFP-TDP-43z te selecteren en vervolgens op Alles weergeven te klikken in de ROI-manager. Klik op Meten in de ROI-manager om gemiddelde waarden voor elke ROI te verkrijgen.
  4. Verkrijg gemiddelde waarden voor opTDP-43h volgens dezelfde procedure als in 7.3.
  5. Deel voor elke ROI, na aftrek van het gemiddelde voor de achtergrond-ROI, het afgetrokken gemiddelde voor opTDP-43h door het afgetrokken gemiddelde voor EGFP-TDP-43z om de ratiometrische waarde te verkrijgen. De ratiometrische waarden kunnen worden vergeleken tussen verschillende tijdspunten en worden gepresenteerd met behulp van kolomgrafiek in Prism-software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Live beeldvorming van optogenetische en niet-optogenetische TDP-43 eiwitten in de mnr2b+ spinale motorneuronen van zebravislarven
Om TDP-43 faseovergang in de spinale motorneuronen bij zebravissen te induceren, werd een menselijke TDP-43h die is getagd met mRFP1 en CRY2olig22 op respectievelijk de N- en C-termini geconstrueerd en aangeduid als opTDP-43h14 (figuur 1A). Het opTDP-43h genfragment werd ingebracht in een BAC met daarin de mnr2b locus (figuur 1B). De resulterende BAC, aangeduid als mnr2b-hs:opTDP-43h, werd in het zebravisgenoom geïntroduceerd door Tol2 transposon-gemedieerde BAC-transgenese19. Om de lokalisatie van niet-optogenetische TDP-43 in de spinale motorneuronen te monitoren, werd een zebravis TDP-43 gecodeerd door tardbp-gen gelabeld met EGFP op het N-eindpunt (figuur 1A) en het EGFP-TDP-43z-genfragment geïntroduceerd in de mnr2b BAC, vergelijkbaar met opTDP-43h (figuur 1B). De resulterende BAC, aangeduid als mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, werd in het zebravisgenoom geïntroduceerd door Tol2 transposon-gemedieerde BAC-transgenese. De vis die met elke BAC-constructie werd geïnjecteerd, werd gekruist met een vis van het wilde type en de resulterende F1-vis werd op dag 3 gescreend op rode (Tg [mnr2b-hs: opTDP-43h]) of groene (Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z]) fluorescentie in het ventrale ruggenmerg. De geïsoleerde rode of groene fluorescentiepositieve F1-vissen werden aangeduid als respectievelijk Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] of Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].

Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vissen bij 48 hpf werden verdoofd en ingebed in een laag smeltende agarose op hun kant; na agarose-stolling werden ze bedekt met E3-buffer om waarnemingen van de laterale kant van het ruggenmerg van bovenaf mogelijk te maken. Confocale laserscanmicroscopie werd uitgevoerd met een 20x waterdompelobjectieve lens en een combinatie van excitatie/ emissiegolflengten: 473/510 nm voor EGFP en 559/583 nm voor mRFP1. De gescande vis werd onmiddellijk en zorgvuldig uit de agarose gehaald, overgebracht naar E3-buffer in een plaat met zes putten en verlicht door een blauw LED-lampje door de plaat op een LED-paneel bij 28 °C te plaatsen (figuur 2A,B). Na een 24-uurs verlichting werd de vis verdoofd en opnieuw ingebed in agarose voordat hij werd gescand met een confocale microscopie met dezelfde beeldvormingsomstandigheden, behalve dat de ROI werd aangepast om het overeenkomstige ruggenmerggebied op te nemen dat was afgebeeld op 48 hpf (figuur 2B). Het hele hemispinale koord van 4-5 aaneengesloten spinale segmenten werd afgebeeld tijdens de microscopiesessie (meestal 20-30 min), waarbij beelden uit de z-serie werden gegenereerd met 20-40 plakjes, afhankelijk van de horizontaliteit van de lengteas van het ruggenmerg van de gemonteerde vis ten opzichte van het confocale scanvlak.

Visualisatie van cytoplasmatische verplaatsing van optogenetische TDP-43 in spinale motorneuronen
Om de cytoplasmatische verplaatsing van opTDP-43h in enkele spinale motorneuronen te visualiseren, werden de beelden uit de z-serie (meestal 20-40 plakjes) verkregen bij 48 en 72 hpf geopend met Fiji en gescheiden in elk EGFP-TDP-43z- en opTDP-43h-kanaal. Maximale intensiteit projectiebeelden van EGFP-TDP-43z werden gemaakt voor beelden bij 48 en 72 hpf en een enkel geïsoleerd spinale neuron dat identificeerbaar is in beide beelden bij 48 en 72 hpf werd geselecteerd (figuur 2B, pijlen). Spinale motorneuronen met cellichamen aan de dorsale kant van de motorkolom werden geschikt geacht voor metingen van de vorm van het cellichaam vanwege hun schaarse distributiepatronen.

Na aanpassing van de intensiteit van het EGFP-signaal in EGFP-TDP-43z-beelden, werden ROIs die de soma's van de motorneuronen bedekten ingesteld door de rand van het EGFP-signaal te traceren op 48 en 72 hpf (figuur 2C). De fluorescerende intensiteit langs de hoofdas van de soma werd gemeten voor de EGFP-TDP-43z en opTDP-43h signalen bij 48 en 72 hpf (figuur 2C, rechts). Bij 48 hpf overlapten de patronen van opTDP-43h en EGFP-TDP-43z signalen elkaar grotendeels.

Daarentegen werd bij 72 hpf de piek van het opTDP-43h-signaal gevonden in het gebied waar het EGFP-TDP-43z-signaal laag was, namelijk in het cytoplasma, wat wijst op de cytoplasmatische verplaatsing van opTDP-43h. De lichtafhankelijke cytoplasmatische opTDP-43h-relocatie wordt grotendeels onafhankelijk van niet-optogenetische TDP-4314 geïnitieerd. In deze test werden max intensiteitsprojectiebeelden gebruikt om de positie van de kern/cytoplasmagrens te schatten ten koste van kwantitatieve metingen.

Ratiometrische vergelijking van de fluorescentie-intensiteit van optogenetische en niet-optogenetische TDP-43 in de spinale motorneuronen
Om de effecten van de blauwlichtstimulatie op de fluctuerende opTDP-43h eiwitniveaus te evalueren, werden opTDP-43h-signalen in het cellichaam gemeten voor en na de lichtstimulatie met betrekking tot het EGFP-TDP-43z-signaal. De beelden uit de z-serie, inclusief het spinale hemisegment, werden geopend met Fiji. Om ROI's in te stellen voor enkele spinale motorneuronen, werden max-intensiteitsprojectiebeelden van het EGFP-TDP-43z-signaal gemaakt voor 48 en 72 hpf, en enkele geïsoleerde spinale neuronen die identificeerbaar waren in zowel 48- als 72 hpf-beelden werden geselecteerd (figuur 3A). Met behulp van selecties uit de vrije hand werden ROI's getekend en geregistreerd in een ROI-manager voor elk van de 48- en 72 hpf-afbeeldingen (figuur 3A). Max intensiteit projectie van het EGFP-TDP-43z signaal werd geschikt geacht om de ROIs in te stellen vanwege het hoge contrast.

Om de opTDP-43h- en EGFP-TDP-43z-signalen te kwantificeren, werden sum slices projectiebeelden voor elk kanaal van dezelfde z-serie beelden geproduceerd voor 48 en 72 hpf (figuur 3A). Met behulp van de geregistreerde ROI-sets werden de fluorescerende intensiteiten van opTDP-43h en EGFP-TDP-43z gemeten voor elk tijdstip. Relatieve hoeveelheden opTDP-43h tot EGFP-TDP-43z (RFP/GFP-waarden) werden berekend voor elke cel en elk tijdspunt door de RFP-waarde te delen door de GFP-waarde (figuur 3B). Van de vier mnr2b-positieve cellen die werden onderzocht, vertoonde cel #1 met name een verzadigd EGFP-TDP-43z-signaal (figuur 3A). Cellen met verzadigde fluorescerende signalen moeten bij het uitvoeren van kwantitatieve analyses van de datasets worden uitgesloten. Cellen #2-#4 vertoonden dalende trends van relatieve opTDP-43h-niveaus tot EGFP-TDP-43z na blauwlichtverlichting (figuur 3B), hoewel een grootschaligere analyse eerder aantoonde dat de afname van relatieve opTDP-43h-niveaus tot EGFP-TDP-43z niet statistisch significant was (65 cellen van drie onafhankelijke dieren)14.

Figure 1
Figuur 1: Constructie van BAC DNA met behulp van de mnr2b locus. (A) Structuren van de expressiecassettes voor opTDP-43h en EGFP-TDP-43z. (B) Het genomische gebied van de zebravis dat wordt gedragen door het BAC-DNA CH211-172N16. De PCR-versterkte expressiecassettes voor opTDP-43h en EGFP-TDP-43z worden stroomafwaarts van het 5′-onvertaalde gebied (UTR) van de mnr2b (rode pijl) in het eerste exon van mnr2b ingevoegd door homologe recombinatie. De balken geven 500 (A) en 10k (B) bp aan . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Live beeldvorming van opTDP-43h voor en na lichtstimulatie. (A) Een schema van de lichtstimulatie van opTDP-43h uitgedrukt in de spinale motorneuronen van ongeremde Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vissen door een veldverlichting van blauw LED-licht van 48 tot 72 hpf. (B) Max intensiteit projectiebeelden van de z-serie confocale beelden van het ventrale ruggenmerg vóór (48 hpf) en na (72 hpf) de lichtstimulatie. De stippellijnen bakenen de ventrale grens van het ruggenmerg af. De cijfers zijn aangepast van Asakawa et al.14 (C) Cytoplasmatische mislokalisatie van opTDP-43 na de 24-uurs blauwlichtverlichting. De contouren van de soma van een mnr2b-positieve cel (rode pijlen in B) waargenomen bij 48 en 72 hpf worden weergegeven in magenta. De belangrijkste assen van de soma's werden met lichtblauw afgebeeld. De genormaliseerde fluorescerende intensiteit langs de grote assen werd uitgezet. Het sterretje geeft een cluster van sterke opTDP-43-signalen aan die geen sterk EGFP-TDP-43z overlappend signaal vertonen, wat wijst op cytoplasmatische opTDP-43h mislokalisatie. De staven geven 1 mm (A), 20 μm (B) en 4 μm (C) aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Ratiometrische vergelijkingen van opTDP-43h en EGFP-TDP-43z voor en na lichtstimulatie. (A) ROIs die de soma's van vier enkele mnr2b-positieve cellen bij 48 en 72 hpf bestrijken, werden getrokken op basis van het EGFP-TDP-43z-signaal en worden weergegeven in magenta. De rechthoekige ROI's (bg) werden gebruikt om het achtergrondsignaal (background ROI) af te trekken. De cijfers zijn aangepast van Asakawa et al.14 (B) De relatieve intensiteiten van opTDP-43h tot EGFP-TDP-43z werden voor elke cel op elk tijdstip uitgezet als de RFP/GFP-verhouding. Cel #1, aangegeven door het sterretje, was niet geschikt voor de ratiometrische vergelijking omdat het EGFP-TDP-43z-signaal verzadigd was en de RFP/GFP-waarde werd overschat. De balk geeft 10 μm aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mnr2b-BAC-gemedieerde expressie van opTDP-43h en EGFP-TDP-43z in zebravissen biedt een unieke kans voor live beeldvorming van TDP-43 faseovergang in de spinale motorneuronen. De optische transparantie van lichaamsweefsels van zebravislarven zorgt voor de eenvoudige en niet-invasieve optogenetische stimulatie van opTDP-43h. Vergelijkingen tussen enkele spinale motorneuronen in de loop van de tijd toonden aan dat de lichtafhankelijke oligomerisatie van opTDP-43h de cytoplasmatische clustering veroorzaakt, wat doet denken aan als-pathologie.

Een van de kritische parameters die het fasegedrag van een intrinsiek ongeordend eiwit definiëren, is intracellulaire concentratie. Een hoog niveau van opTDP-43h-expressie kan mogelijk leiden tot lichtonafhankelijke opTDP-43h-oligomerisatie, faseovergang en aggregatie. De inductie van een stabiel, niet-toxisch niveau van opTDP-43h-expressie in de spinale motorneuronen is dus de sleutel tot de succesvolle evaluatie van de fysiologische en pathologische gevolgen van opTDP-43 faseovergang op de spinale motorneuronen. De mnr2b-BAC-gemedieerde expressie van opTDP-43 h lijkt geschikt voor dit doel omdat Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] vissen overwegend nucleair opTDP-43 vertonen, ze in staat zijn om vrij te zwemmen met een opgeblazen zwemblaas en ze behouden de volledige levensvatbaarheid, zelfs nadat ze onder de continue donkere omstandigheden van 1-5 dpf zijn verhoogd. Bij zebravissen is een conventionele benadering die wordt gebruikt om een gen van belang exogene tot expressie te brengen, mRNA-injectie in het eencellige stadium. Een hoge dosis van het TDP-43-eiwit vertaald uit het geïnjecteerde mRNA veroorzaakt echter in één keer vroege ontwikkelingsdefecten14 die analyses van latere differentiërende spinale motorneuronen uitsluiten. Het verlagen van de hoeveelheid geïnjecteerd mRNA tot een aanvaardbaar niveau levert echter niet voldoende opTDP-43h voor optogenetische modulatie in de spinale motorneuronen tegen de tijd van de differentiatie, wat aangeeft dat mRNA-injectie geen geschikte methode is om opTDP-43h af te leveren aan de spinale motorneuronen van zebravissen. Een andere mogelijke benadering die wordt gebruikt om opTDP-43h in de spinale motorneuronen tot expressie te brengen, is het injecteren, in het eencellige stadium, van een plasmide of BAC-DNA dat het opTDP-43h-construct herbergt onder controle van een promotor die actief is in het spinale motorneuron. Hoewel de injectie van mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA de expressie van opTDP-43h in de spinale motorneuronen kan sturen, is het aantal opTDP-43h-positieve motorneuronen laag, en in dergelijke numeriek beperkte opTDP-43h-positieve cellen is het expressieniveau meestal hoog, vaak geassocieerd met lichtonafhankelijke opTDP-43h-aggregatie. Deze observaties suggereren gezamenlijk dat transgene expressie een onvervangbare strategie is om opTDP-43h stabiel tot expressie te brengen in de spinale motorneuronen op een niet-toxisch niveau. Hoewel de mnr2b-BAC bijna alle spinale motorneuronen in zebravissen labelt20,23, kunnen de expressieniveaus van opTDP-43h variëren tussen individuele mnr2b-positieve cellen. Deze variatie kan deels te wijten zijn aan het intrinsieke expressiepatroon van mnr2b geassocieerd met zijn regulerende rol in motorneurondifferentiatie. Een andere mogelijke oorzaak voor de bonte expressie kan het gevolg zijn van een chromosomaal positie-effect op de mnr2b-BAC inserts. Wat de oorzaak ook is, de gevarieerde opTDP-43 expressieniveaus tussen mnr2b-positieve cellen kunnen variatie in cytotoxiciteit veroorzaken geassocieerd met lichtafhankelijke opTDP-43h faseovergang.

Bij zebravislarven zijn de soma's van spinale motorneuronen dicht uitgelijnd in het ventrale ruggenmerg en heeft het somale cytoplasma een veel lager volume dan dat van het axonale cytoplasma. Dit anatomische kenmerk beperkt kwantitatieve analyses van cytoplasmatisch opTDP-43h in de spinale motorneuronen: opTDP-43h is alleen kwantitatief meetbaar in de kern en somaal cytoplasma, maar niet in de hele cel van motorneuronen. Kwantitatieve beeldvorming van een eiwit in de hele cel van spinale motorneuronen, inclusief de soma en de perifere zenuwterminal, blijft een uitdagende taak. Ondanks de beperkingen op kwantitatieve assays, bleek de opTDP-43h/EGFP-TDP-43z ratio in de soma verhoogd te zijn door de ALS-veroorzakende mutatie in de IDR (A315T)14. Daarom is de huidige methode van toepassing op het evalueren van de effecten van de TDP-43-mutatie op de eiwitstabiliteit geassocieerd met faseovergang in de soma van spinale motorneuronen.

In principe kan de mnr2b-BAC-benadering worden uitgebreid om de LLPS te moduleren en de cytotoxiciteit van andere ALS-gerelateerde RNP-eiwitten te evalueren met IDR's die verder gaan dan TDP-43. Verschillende protocolstappen moeten mogelijk worden aangepast om een optimaal expressieniveau van dergelijke optogenetische sondes in de spinale motorneuronen te verkrijgen. Ten eerste werd in de Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] transgene construct de hsp70l promotor gebruikt als een basale promotor om de opTDP-43h expressie aangedreven door mnr2b enhancers te stimuleren. De hsp70l-promotor kan uit het BAC-construct worden verwijderd als het expressieniveau van een eiwit van belang zo hoog is dat het lichtonafhankelijke ectopische faseovergang veroorzaakt. Ten tweede is opTDP-43h uitgerust met CRY2olig-tag, een fotolyase homologie (PHR) domein met een puntmutatie die de clustercapaciteit op blauwlichtverlichting verbetert22. Het wild-type eiwit CRY2PHR kan worden gebruikt als een lichtafhankelijk oligomerisatielabel als het nodig is om lichtafhankelijke clusteractiviteit te dempen. Ten slotte, om de ALS-pathologie bij zebravissen getrouwer samen te vatten, is het wenselijk om een verlichtingsprotocol op te stellen waarbij de visfysiologie minimaal wordt beïnvloed door de veldverlichting van blauw licht tijdens de juveniele en volwassen stadia. De huidige methode maakt gebruik van een continue verlichting met blauw licht van 48 tot 72 hpf (gedurende 24 uur) en de verlichtingsduur kan worden verlengd tot 120 pkf (gedurende 72 uur) zonder de levensvatbaarheid van vissen te verliezen14, hoewel lichtgevoelige fysiologische functies, zoals het gezichtsvermogen, kunnen worden beïnvloed. Door een protocol voor intermitterende lichtverlichting te ontwikkelen, kan lichtstimulatie op veel langere termijn mogelijk worden, wat op zijn beurt de ontwikkeling van opTDP-43h tot meer volwassen pathologische aggregaten kan vergemakkelijken. Om dit te bereiken, kunnen andere optogenetische sondes voor het moduleren van eiwit-eiwitinteracties met behulp van verschillende lichtgolflengten die minder fysiologisch storend zijn24 ook de moeite waard zijn om verder te onderzoeken. Combinaties van dergelijke verbeterde optogenetische TDP-43-sondes, geschikte promotors gericht op ziektegevoelige celtypen en verlichtingsprotocollen met minimale effecten op fysiologische functies zouden wegen openen voor het getrouw modelleren van de pathologieën van TDP-43 proteïnopathieën, niet alleen in het ruggenmerg maar ook in de hersenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

KA en KK zijn de uitvinders van het intellectuele eigendom dat in dit manuscript wordt beschreven en voorlopige patenten zijn ingediend door het National Institute of Genetics.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant nummers JP19K06933 (KA) en JP20H05345 (KA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).

Tags

Neurowetenschappen neurodegeneratieve ziekte ALS optoDroplet systeem Cryptochrome 2 TDP-43 zebravis spinale motorneuron, mnr2b BAC transgenese
Optogenetische faseovergang van TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. … More

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter