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Neuroscience

Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Induktion des Phasenübergangs des TAR-DNA-bindenden Proteins 43 (TDP-43) durch Licht in den spinalen Motoneuronen am Beispiel des Zebrafisches.

Abstract

Abnormale Proteinaggregation und selektive neuronale Vulnerabilität sind zwei Hauptmerkmale neurodegenerativer Erkrankungen. Kausale Zusammenhänge zwischen diesen Merkmalen können durch die Kontrolle des Phasenübergangs eines krankheitsassoziierten Proteins in einem anfälligen Zelltyp abgefragt werden, obwohl dieser experimentelle Ansatz bisher begrenzt war. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion des Phasenübergangs des RNA/DNA-bindenden Proteins TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven zur Modellierung der zytoplasmatischen Aggregation von TDP-43, die in degenerierenden Motoneuronen bei amyotropher Lateralsklerose (ALS) auftritt. Wir beschreiben eine auf einem bakteriellen künstlichen Chromosom (BAC) basierende genetische Methode, um eine optogenetische TDP-43-Variante selektiv an spinale Motoneuronen von Zebrafischen abzugeben. Die hohe Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht den Phasenübergang des optogenetischen TDP-43 in den spinalen Motoneuronen durch eine einfache äußere Beleuchtung mittels einer Leuchtdiode (LED) gegen hemmungslose Fische. Wir präsentieren auch einen grundlegenden Workflow der Live-Bildgebung der Zebrafisch-Spinalmotorneuronen und der Bildanalyse mit frei verfügbarer Fiji / ImageJ-Software, um die Reaktionen des optogenetischen TDP-43 auf die Lichtbeleuchtung zu charakterisieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des TDP-43-Phasenübergangs und der Aggregatbildung in einer ALS-gefährdeten zellulären Umgebung, was eine Untersuchung seiner zellulären und Verhaltensfolgen erleichtern sollte.

Introduction

Ribonukleoprotein (RNP)-Granula steuern eine Vielzahl von zellulären Aktivitäten im Zellkern und Zytoplasma, indem sie membranlose Trennwände über Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) zusammensetzen, ein Phänomen, bei dem eine homogene Flüssigkeit in zwei verschiedene flüssige Phasen zerlegt1,2. Das dysregulierte LLPS von RNA-bindenden Proteinen, die normalerweise als RNP-Granulatkomponenten fungieren, fördert einen abnormalen Phasenübergang, der zur Proteinaggregation führt. Dieser Prozess wurde mit neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht3,4,5. Die genaue Bewertung eines kausalen Zusammenhangs zwischen aberrantem LLPS von RNA-bindenden Proteinen und der Krankheitspathogenese ist entscheidend dafür, ob und wie LLPS als wirksames therapeutisches Ziel genutzt werden kann. LLPS von RNA-bindenden Proteinen ist relativ einfach in vitro und in einzelligen Modellen zu untersuchen, ist aber in mehrzelligen Organismen, insbesondere bei Wirbeltieren, schwierig. Eine kritische Voraussetzung für die Analyse eines solchen LLPS in einzelnen Zellen innerhalb einer Gewebeumgebung besteht darin, eine Sonde für die Bildgebung und Manipulation von LLPS in einem krankheitsgefährdeten Zelltyp von Interesse stabil auszudrücken.

Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine letztlich tödliche neurologische Erkrankung, bei der Motoneuronen des Gehirns und des Rückenmarks durch Degeneration selektiv und progressiv verloren gehen. Bis heute wurden Mutationen in mehr als 25 Genen mit der vererbbaren (oder familiären) Form von ALS in Verbindung gebracht, die 5% -10% der gesamten ALS-Fälle ausmacht, und einige dieser ALS-verursachenden Gene kodieren RNA-bindende Proteine, die aus RNPs bestehen, wie hnRNPA1, TDP-43 und FUS6,7. Darüber hinaus ist die sporadische Form von ALS, die 90% -95% der gesamten ALS-Fälle ausmacht, durch die zytoplasmatische Aggregation von TDP-43 gekennzeichnet, die in degenerierenden Motoneuronen abgelagert wird. Ein Hauptmerkmal dieser ALS-assoziierten RNA-bindenden Proteine sind ihre intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs) oder Domänen mit geringer Komplexität, denen geordnete dreidimensionale Strukturen fehlen und die schwache Protein-Protein-Interaktionen mit vielen verschiedenen Proteinen vermitteln, die LLPS antreiben7,8. Die Tatsache, dass ALS-verursachende Mutationen häufig in den IDRs auftreten, hat zu der Idee geführt, dass aberrantes LLPS und Phasenübergang dieser ALS-verwandten Proteine der ALS-Pathogenese zugrunde liegen könnten9,10.

Vor kurzem wurde die optoDroplet-Methode, eine Cryptochrome 2-basierte optogenetische Technik, die die Modulation von Protein-Protein-Interaktionen durch Licht ermöglicht, entwickelt, um den Phasenübergang von Proteinen mit IDRs11 zu induzieren. Da diese Technik erfolgreich auf TDP-43 ausgeweitet wurde, hat sie begonnen, die Mechanismen aufzudecken, die dem pathologischen Phasenübergang von TDP-43 und der damit verbundenen Zytotoxizität zugrunde liegen12,13,14,15. In diesem Protokoll skizzieren wir eine genetische Methode zur Abgabe eines optogenetischen TDP-43 an ALS-gefährdete Zelltypen, nämlich spinale Motoneuronen im Zebrafisch unter Verwendung des BAC für das mnr2b/mnx2b-Gen, das für ein homöodomänes Protein für die Motoneuronspezifikation kodiert16,17. Die hohe Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht eine einfache, nichtinvasive Lichtstimulation des optogenetischen TDP-43, die seinen Phasenübergang in den spinalen Motoneuronen auslöst. Wir präsentieren auch einen grundlegenden Workflow für die Live-Bildgebung der Zebrafisch-Spinalmotorneuronen und die Bildanalyse mit der frei verfügbaren Fiji/ImageJ-Software, um die Reaktionen des optogenetischen TDP-43 auf die Lichtstimulation zu charakterisieren. Diese Methoden ermöglichen eine Untersuchung des TDP-43-Phasenübergangs in einer ALS-gefährdeten zellulären Umgebung und sollten dazu beitragen, seine pathologischen Folgen auf zellulärer und Verhaltensebene zu untersuchen.

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Protocol

Alle Fischarbeiten wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Institutional Animal Care and Use Committee (Zulassungskennnummer 24-2) des National Institute of Genetics (Japan) durchgeführt, das eine Tierschutzgarantie (Assurance-Nummer A5561-01) beim Office of Laboratory Animal Welfare der National Institutes of Health (NIH, USA).

1. Aufbau von BACs zur Expression des optogenetischen TDP-43-Gens aus dem mnr2b-Promotor

  1. BAC Vorbereitung
    1. Kaufen Sie einen Zebrafisch-BAC-Klon, der den Zebrafisch-mnr2b-Locus enthält (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Reinigen Sie die BAC-DNA aus einer 5-ml-LB-Kultur von DH10B Escherichia coli (E. coli) mit CH211-172N16 über Nacht, wie in Warming et al.18 beschrieben.
    2. Umwandlung von CH211-172N16 in SW102 E. coli-Zellen durch Elektroporation, wie in Warming et al.18 beschrieben.
      HINWEIS: Die Aufreinigung der BAC-DNA aus den E. coli am selben Tag der Elektroporation führt in der Regel zu einer höheren Erfolgsrate der BAC-Transformation18. Andernfalls wird die gereinigte BAC-DNA bis zur Verwendung bei -20 °C gehalten.
    3. Einführung der iTol2-Ampere-Kassette für die Tol2-Transposon-vermittelte BAC-Transgenese19 in das Rückgrat von CH211-172N16 durch Elektroporation, wie in Asakawa et al.20 beschrieben.
      1. Herstellung eines Glycerinbestands der E. coli-Zellklone , die CH211-172N16 tragen, mit der iTol2-Ampere-Kassettenintegration (CH211-172N16-iTol2A), nachdem die homologe rekombinationsvermittelte Integration durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Ex Taq) unter Verwendung des Primerpaares Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') und pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') und der folgenden Bedingungen bestätigt wurde: ein Denaturierungsschritt bei 98 °C für 1 min, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 s, Primerglühen bei 55 °C für 15 s und Primerverlängerung bei 72 °C für 1 min, wobei ein PCR-Produkt von 354 Basenpaaren (bp) verstärkt wird.
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h Konstruktion
    1. Konstruieren Sie ein Plasmid, das die Expressionskassette für den menschlichen Wildtyp TDP-43/TARDBP (TDP-43h) trägt, der mit mRFP1 und CRY2olig an den N- bzw. C-Termini (im Folgenden opTDP-43h)14 markiert ist.
      HINWEIS: Das opTDP-43h-Fragment sollte mit der Zebrafisch-HSP70l-Genpromotorsequenz (650 bp) und der Polyadenylierungs-Signalsequenz (PolyA) flankiert werden, gefolgt von einem Kanamycin-Resistenzgen (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Amplifizieren Sie die hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette mit Primern, die hsp70l und Kan glühen und 45 bp-Sequenzen der upstream und downstream der Initiator-Codons des mnr2b-Gens enthalten, durch PCR (GXL DNA Polymerase) unter Verwendung des Primerpaares mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') und Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') mit folgenden Bedingungen: ein Denaturierungsschritt bei 98 °C für 1 min, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 s, Primerglühen bei 55 °C für 15 s und Primerverlängerung bei 68 °C für 30 s, Amplifikation eines PCR-Produkts von ~5,7 bp.
    3. Trennen Sie die PCR-Produkte durch Agarosegelelektrophorese (100 V) und reinigen Sie die hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA-Bande mit einer DNA-Säule. Stellen Sie die Konzentration der gereinigten hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette auf 50 ng/μL im Tris-EDTA-Puffer (TE) ein, der 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthält.
    4. Führen Sie die hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette durch Elektroporation wie in Warming et al.18 beschrieben in CH211-172N16-iTol2A ein und wählen Sie Ampicillin- und Kanamycin-resistente Transformationsmittel auf LB-Agarplatten aus. CH211-172N16-iTol2A mit der hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette wird als mnr2b-hs:opTDP-43h bezeichnet.
    5. Reinigen Sie mnr2b-hs:opTDP-43h mit einem BAC-Reinigungskit und lösen Sie es nach der Phenol/Chloroform-Extraktion bei 250 ng/μL in TE auf.
  3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z Konstruktion
    1. Konstruieren Sie ein weiteres Plasmid, das den Zebrafisch-Wildtyp-Tardbp trägt, der mit einem verbesserten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) an seinem N-Terminus (EGFP-TDP-43z) anstelle von opTDP-43h markiert ist, aber ansonsten mit dem hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-Konstrukt (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14 identisch ist. Verwenden Sie EGFP-TDP-43z als interne Kontrolle für die Lichtstimulation von opTDP-43h.
    2. Konstruieren Sie CH211-172N16-iTol2A, das die hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan-Kassette im mnr2b-Locus beherbergt, wie in 1.2.1-1.2.5 beschrieben. CH211-172N16-iTol2A, das die hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan-Kassette trägt, wird als mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z bezeichnet.

2. Tol2-Transposon-vermittelte BAC-Transgenese bei Zebrafischen

  1. Die Injektionslösung enthält 40 mM KCl, Phenolrot (10 % v/v), 25 ng/μL der mnr2b-hs:opTDP-43h DNA und 25 ng/μL Tol2 Transposase mRNA19.
  2. 1 nL der Injektionslösung (ein in Mineralöl kalibriertes Tröpfchen mit einem Durchmesser von ca. 123 μm) wird im Einzellstadium in das Zytosol von Wildtyp-Zebrafischembryonen injiziert. Screenen Sie den injizierten Fisch auf die Bildung von rot fluoreszierenden Protein (RFP) -positiven Aggregaten in verschiedenen embryonalen Geweben, einschließlich spinaler Motoneuronen, unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop 2-3 Tage nach der Befruchtung (dpf). Heben Sie den RFP-positiven Fisch bis zum Erwachsenenalter an.
  3. Injizieren Sie die mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA wie in 2.1 und 2.2 beschrieben. EGFP-positive Fische bis ins Erwachsenenalter aufziehen.
  4. Nach einigen Monaten geschlechtsgereifte injizierte Fische und Wildtypfische paarweise in Standard-2-L-Paarungskäfige legen, um F1-Nachkommen zu erhalten. Screen F1 Fisch bei 3 dpf für RFP (opTDP-43h) oder EGFP (EGFP-TDP-43z) Fluoreszenz in der wirbelsäulenmotorischen Säule mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Plan-Neofluar 5x/0,15 Objektivlinse. Typischerweise wird ein Gründerfisch aus 10-20 injizierten Fischen identifiziert (die Keimbahnübertragungsrate beträgt 5% -10%).
  5. Isolieren und vergleichen Sie mehrere Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] und Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Einsätze von verschiedenen Gründerfischen, da die Intensität, aber nicht das Muster, der opTDP-43h- oder EGFP-TDP-43z-Expression zwischen den Gründerfischen aufgrund von Chromosomenpositionseffekten variieren kann.
  6. Kreuzen Sie Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] und Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Fischlinien, um Nachkommen zu erhalten, die Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppelt transgenen Fisch in einem Mendelschen Verhältnis enthalten.
  7. Den Fisch in einer Plastikschale mit 30 ml E3-Puffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% Methylenblau) aufziehen und 8-10 h nach der Befruchtung (hpf) 0,003% (w/v) N-Phenylthiourea hinzufügen, um die Melanogenese zu hemmen.
  8. Die Kunststoffschale nach 30 hpf mit Alufolie abdecken.

3. Vorbereitung der LED für die Blaulichtbeleuchtung

  1. Schalten Sie ein LED-Panel ein, indem Sie die zugehörige Anwendung verwenden, die auf einem Tablet/Smartphone installiert ist. Setzen Sie die Sonde eines Spektrometers in einen leeren Brunnen einer 6-Well-Schüssel und stellen Sie das LED-Licht durch die Anwendung auf die Wellenlänge von ~ 456 nm ein. Platzieren Sie den optischen Sensor eines optischen Leistungsmessers im leeren Brunnen und stellen Sie die Leistung des LED-Lichts (~0,61 mW/cm2) ein. Die LED-Lichteinstellung kann gespeichert werden und ist in der Anwendung abrufbar.
  2. Führen Sie die Schalen-/LED-Panel-Einstellung bei 28 °C in den Inkubator ein. Beenden Sie diesen Schritt, bevor die Bildgebung von Fischen bei 48 hpf beginnt.

4. Bildgebung von Zebrafischlarven, die optogenetische TDP-43 exprimieren

  1. Wählen Sie Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppeltransgene Fische mindestens vor 47 hpf, basierend auf RFP (opTDP-43h) oder EGFP (EGFP-TDP-43z) Fluoreszenz in der wirbelsäulenmotorischen Säule mit dem oben beschriebenen Epifluoreszenzmikroskop-Setup.
  2. Dekreionieren Sie den doppelt transgenen Fisch Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].
  3. 1% Agarose mit niedriger Schmelztemperatur mit 250 μg/ml Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz bei 42 °C vorheizen.
  4. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] doppelt transgenen Fisch bei 48 hpf in E3-Puffer, der die gleiche Konzentration an Trican enthält, kurz betäuben.
  5. Geben Sie einen Tropfen der vorgewärmten 1% niedrigen Schmelztemperatur Agarose bei Raumtemperatur auf die Glasbodenschale. Der Durchmesser des kuppelförmigen Agarosetropfens auf der Glasschale beträgt 8-10 mm.
  6. Mit einer Pasteurpipette den betäubten Fisch zu der Agarose mit niedriger Schmelztemperatur auf der Glasbodenschale geben und dann einige Male durch Pipettieren mischen. Minimieren Sie die Menge des E3-Puffers, der der Agarose zusammen mit dem Fisch hinzugefügt wird.
  7. Halten Sie den Fisch auf der Seite, indem Sie während der Erstarrung von Agarose (typischerweise ~ 1 min) eine Spritzennadel verwenden, um sicherzustellen, dass sich das Rückenmark in einer geeigneten horizontalen Position befindet. Nach der Erstarrung ein paar Tropfen E3-Puffer auf den kuppelförmigen Agarose-montierten Fisch geben.
  8. Erfassen Sie serielle konfokale Z-Schnitte des Rückenmarks durch Scannen mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse mit der numerischen Apertur 1,00 ausgestattet ist, mit einer Scangeschwindigkeit von 4,0 μs pro Pixel (12 Bit pro Pixel), einer Schrittgröße von 1,0 μm pro Schicht für das Objektiv und einer Kombination aus Anregungs-/Emissionswellenlängen: Kanal 1) 473/510 nm für EGFP und Kanal 2) 559/583 nm für mRFP1.
    HINWEIS: Die Kloake auf der ventralen Seite des Fisches ist in den Regionen von Interesse (ROI) als Referenz enthalten, was hilft, die Wirbelsäulensegmente (Ebenen 16-17) über die Zeitpunkte hinweg zu identifizieren und zu vergleichen.
  9. Entfernen Sie den Fisch aus der Agarose, indem Sie die Agarose vorsichtig mit einer Spritzennadel knacken, sobald die Bildgebung abgeschlossen ist. Halten Sie die Zeit, in der der Fisch in die Agarose eingebettet ist, so kurz wie möglich, obwohl die Agaroseeinbettung für <30 min die Lebensfähigkeit des Fisches nicht beeinträchtigt.

5. Lichtstimulation von opTDP-43h-exprimierenden Fischen durch Feldbeleuchtung einer blauen Leuchtdiode (LED)

  1. Fügen Sie 7,5 ml E3-Puffer in das Bohrloch hinzu und platzieren Sie den abgebildeten Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppeltransgenen Fisch in den Brunnen. Platzieren Sie die Sechs-Well-Schüssel auf dem LED-Panel, indem Sie die Schüssel und das LED-Panel mit einem Abstandshalter 5 mm voneinander entfernt halten (z. B. mit fünf gestapelten Diagläsern).
  2. Schalten Sie das blaue LED-Licht ein. Bewahren Sie einige der doppelt transgenen Fische Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] in einer separaten Sechs-Well-Schüssel auf, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist, wenn unilluminierte Kontrollfische erforderlich sind (d. h. bei dunklen Bedingungen)14.
  3. Stellen Sie nach der Beleuchtung (z. B. für 24 h bei 72 hpf in Abbildung 3) das Rückenmark des beleuchteten Fisches dar, indem Sie die Schritte 4.3 - 4.9 wiederholen.

6. Visualisierung der zytoplasmatischen Verlagerung von optogenetischem TDP-43 in den spinalen Motoneuronen

  1. Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ/Fiji21 (Version: 2.1.0/1.53c), einem von NIH Image entwickelten Open-Source-Java-Bildverarbeitungsprogramm, das von https://imagej.net/Fiji/Downloads heruntergeladen werden kann.
  2. Verwenden Sie die Z-Bildlaufleiste, um sich durch die Fokusebenen zu bewegen. Erstellen Sie eine Maximale Intensitätsprojektion mehrerer Slices, indem Sie auf Bild | Stapel | Z-Projekt-| Max Intensity und Einstellung Start Slice und Stop Slice, die die Hemisegmente der spinalmotorischen Säule abdecken.
  3. Teilen Sie das Mehrkanalbild in zwei Einkanalbilder auf, indem Sie auf Bild | | Geteilte Kanäle.
  4. Verbessern Sie das EGFP-TDP-43z-Signal, um sicherzustellen, dass das zytoplasmatische EGFP-TDP-43z deutlich sichtbar ist, indem Sie auf Bild | | anpassen Helligkeit/Kontrast und Anpassung Minimum
  5. Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie auf | analysieren klicken Werkzeuge | ROI-Manager. Finden Sie die Zellen, die in beiden Bildern bei 48 hpf und 72 hpf identifizierbar sind, basierend auf den relativen Positionen der Zellkörper. Legen Sie die ROIs fest, indem Sie die Konturen der Zellkörper einzelner spinaler Motoneuronen skizzieren, die durch das EGFP-TDP-43z-Signal mithilfe der Freihandauswahl visualisiert werden, und dann im ROI-Manager auf Hinzufügen[t] klicken.
  6. Legen Sie eine Hauptachse des Somas fest, indem Sie mit Gerade eine gerade Linie zeichnen und auf Analysieren (Analyze | Plotprofil für EGFP-TDP-43z (C1) und opTDP-43h (C2) Bilder bei 48 und 72 hpf.
  7. Normalisieren Sie das Plotprofil, indem Sie die Werte durch den größten Wert für jedes EGFP-TDP-43z- und opTDP-43h-Signal dividieren. Zeichnen Sie die normalisierten Werte mit x-y-Koordinaten, wobei x und y die Hauptachse des Somas bzw. die relativen Fluoreszenzintensitäten darstellen, mit XY-Diagramm in einer statistischen Software.

7. Ratiometrischer Vergleich zwischen opTDP-43h- und EGFP-TDP-43z-Signalen mit ImageJ/Fiji

  1. Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ/Fiji und legen Sie ROIs für einzelne mnr2b-positive Zellen fest, indem Sie ein Projektionsbild mit maximaler Intensität von EGFP-TDP-43z wie in 6.1-6.5 verwenden. Fügen Sie einen ROI außerhalb des ventralen Rückenmarks hinzu (z. B. Notochord), um das Hintergrundsignal (Hintergrund-ROI) darzustellen.
  2. Erstellen Sie für jedes EGFP-TDP-43z- und opTDP-43-Bild eine Projektion mehrerer Slices, indem Sie auf Bild | Stapel | Z-Projekt-| Addieren Sie Slices und legen Sie Start Slice und Stop Slice fest, die die hemispinale Motorsäule abdecken.
  3. Öffnen Sie den ROI-Manager, der mit dem Projektionsbild der maximalen Intensität erstellt wurde. Zeigen Sie die ROIs auf dem Image Sum Slices an, indem Sie das Image-Fenster für EGFP-TDP-43z auswählen und dann im ROI-Manager auf Alle anzeigen klicken. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen , um Mittelwerte für jeden ROI zu erhalten.
  4. Erfassen Sie die Mittelwerte für opTDP-43h nach dem gleichen Verfahren wie in 7.3.
  5. Dividieren Sie für jeden ROI nach Abzug des Mittelwerts für den Hintergrund-ROI den subtrahierten Mittelwert für opTDP-43h durch den subtrahierten Mittelwert für EGFP-TDP-43z, um den ratiometrischen Wert zu erhalten. Die ratiometrischen Werte können zwischen verschiedenen Zeitpunkten verglichen und mithilfe des Säulendiagramms in der Prism-Software dargestellt werden.

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Representative Results

Live-Bildgebung von optogenetischen und nicht-optogenetischen TDP-43-Proteinen in den mnr2b+ spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven
Um den TDP-43-Phasenübergang in den spinalen Motoneuronen im Zebrafisch zu induzieren, wurde ein menschliches TDP-43h, das mit mRFP1 bzw. CRY2olig22 an den N- bzw. C-Termini markiert ist, konstruiert und als opTDP-43h14 bezeichnet (Abbildung 1A). Das opTDP-43h-Genfragment wurde in ein BAC eingebracht, das den mnr2b-Locus enthielt (Abbildung 1B). Das resultierende BAC, das als mnr2b-hs:opTDP-43h bezeichnet wird, wurde durch Tol2-Transposon-vermittelte BAC-Transgenese19 in das Zebrafischgenom eingeführt. Um die Lokalisation von nicht-optogenetischem TDP-43 in den spinalen Motoneuronen zu überwachen, wurde ein zebrafisch TDP-43, der vom tardbp-Gen kodiert wurde, mit EGFP am N-Terminus markiert (Abbildung 1A) und das EGFP-TDP-43z-Genfragment wurde in den mnr2b BAC eingeführt, ähnlich wie opTDP-43h (Abbildung 1B). Das resultierende BAC, das als mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z bezeichnet wird, wurde durch Tol2-Transposon-vermittelte BAC-Transgenese in das Zebrafischgenom eingeführt. Der mit jedem BAC-Konstrukt injizierte Fisch wurde mit einem Wildtypfisch gekreuzt und die resultierenden F1-Fische wurden an Tag 3 auf rote (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) oder grüne (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) Fluoreszenz im ventralen Rückenmark untersucht. Die isolierten roten oder grünen fluoreszenzpositiven F1-Fische wurden als Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] bzw. Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] bezeichnet.

Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppeltransgene Fische bei 48 hpf wurden anästhesiert und in eine niedrigschmelzende Agarose auf ihrer Seite eingebettet; nach der Agaroseerstarrung wurden sie mit E3-Puffer abgedeckt, um Beobachtungen der lateralen Seite des Rückenmarks von oben zu ermöglichen. Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wurde mit einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse und einer Kombination aus Anregungs-/Emissionswellenlängen durchgeführt: 473/510 nm für EGFP und 559/583 nm für mRFP1. Der gescannte Fisch wurde sofort und vorsichtig aus der Agarose entnommen, in einen E3-Puffer in einer Sechs-Well-Platte übertragen und von einem blauen LED-Licht beleuchtet, indem die Platte bei 28 °C auf ein LED-Panel gelegt wurde (Abbildung 2A,B). Nach einer 24-stündigen Beleuchtung wurde der Fisch betäubt und erneut in Agarose eingebettet, bevor er mit einer konfokalen Mikroskopie unter den gleichen Bildgebungsbedingungen gescannt wurde, mit der Ausnahme, dass der ROI so eingestellt wurde, dass er die entsprechende Rückenmarksregion mit 48 hpf einschließt (Abbildung 2B). Die gesamte Hemispinalschnur von 4-5 zusammenhängenden Wirbelsäulensegmenten wurde während der Mikroskopiesitzung (typischerweise 20-30 min) abgebildet, wobei Bilder der Z-Serie mit 20-40 Scheiben erzeugt wurden, abhängig von der Horizontalität der Längsachse des Rückenmarks des montierten Fisches relativ zur konfokalen Scanebene.

Visualisierung der zytoplasmatischen Verlagerung von optogenetischem TDP-43 in spinalen Motoneuronen
Um die zytoplasmatische Verlagerung von opTDP-43h in einzelnen spinalen Motoneuronen zu visualisieren, wurden die bei 48 und 72 hpf aufgenommenen Bilder der z-Serie (typischerweise 20-40 Scheiben) mit Fiji geöffnet und in jeden EGFP-TDP-43z- und opTDP-43h-Kanal aufgeteilt. Projektionsbilder mit maximaler Intensität von EGFP-TDP-43z wurden für Bilder bei 48 und 72 hpf erstellt und ein einzelnes isoliertes Spinalneuron ausgewählt, das in beiden Bildern bei 48 und 72 hpf identifizierbar ist (Abbildung 2B, Pfeile). Spinale Motoneuronen mit Zellkörpern auf der dorsalen Seite der motorischen Säule wurden aufgrund ihrer spärlichen Verteilungsmuster als geeignet für Messungen der Zellkörperform angesehen.

Nach der Anpassung der Intensität des EGFP-Signals in EGFP-TDP-43z-Bildern wurden ROIs, die die Somas der Motoneuronen abdecken, festgelegt, indem der Rand des EGFP-Signals bei 48 und 72 hpf verfolgt wurde (Abbildung 2C). Die Fluoreszenzintensität entlang der Hauptachse des Somas wurde für die Signale EGFP-TDP-43z und opTDP-43h bei 48 und 72 hpf gemessen (Abbildung 2C, rechts). Bei 48 hpf überlappten sich die Muster der Signale opTDP-43h und EGFP-TDP-43z weitgehend.

Im Gegensatz dazu wurde bei 72 hpf der Peak des opTDP-43h-Signals in der Region gefunden, in der das EGFP-TDP-43z-Signal niedrig war, nämlich im Zytoplasma, was auf die zytoplasmatische Verlagerung von opTDP-43h hinweist. Die lichtabhängige zytoplasmatische opTDP-43h-Verlagerung wird weitgehend unabhängig vom nicht-optogenetischen TDP-4314 eingeleitet. In diesem Assay wurden Projektionsbilder mit maximaler Intensität verwendet, um die Position der Zellkern/Zytoplasma-Grenze auf Kosten quantitativer Messungen abzuschätzen.

Ratiometrischer Vergleich der Fluoreszenzintensität von optogenetischen und nicht-optogenetischen TDP-43 in den spinalen Motoneuronen
Um die Auswirkungen der Blaulichtstimulation auf die schwankenden opTDP-43h-Proteinspiegel zu bewerten, wurden opTDP-43h-Signale im Zellkörper vor und nach der Lichtstimulation in Bezug auf das EGFP-TDP-43z-Signal gemessen. Die Bilder der Z-Serie, einschließlich des Spinalhemmisegments, wurden mit Fidschi geöffnet. Um ROIs für einzelne spinale Motoneuronen festzulegen, wurden Projektionsbilder mit maximaler Intensität des EGFP-TDP-43z-Signals für 48 und 72 hpf erstellt und einzelne isolierte spinale Neuronen ausgewählt, die sowohl in 48- als auch in 72 hpf-Bildern identifizierbar waren (Abbildung 3A). Mittels Freihandauswahl wurden ROIs gezeichnet und in einem ROI-Manager für jedes der 48 und 72 hpf-Bilder registriert (Abbildung 3A). Die Max-Intensitätsprojektion des EGFP-TDP-43z-Signals wurde aufgrund seines hohen Kontrasts als geeignet zur Einstellung der ROIs angesehen.

Um die Signale opTDP-43h und EGFP-TDP-43z zu quantifizieren, wurden Sum Slices Projektionsbilder für jeden Kanal der gleichen z-Serie Bilder für 48 und 72 hpf erzeugt (Abbildung 3A). Mit den registrierten ROI-Sets wurden die Fluoreszenzintensitäten von opTDP-43h und EGFP-TDP-43z für jeden Zeitpunkt gemessen. Relative Mengen von opTDP-43h zu EGFP-TDP-43z (RFP/GFP-Werte) wurden für jede Zelle und jeden Zeitpunkt berechnet, indem der RFP-Wert durch den GFP-Wert dividiert wurde (Abbildung 3B). Von den vier untersuchten mnr2b-positiven Zellen zeigte Zelle #1 insbesondere ein gesättigtes EGFP-TDP-43z-Signal (Abbildung 3A). Zellen mit gesättigten Fluoreszenzsignalen sollten bei der Durchführung quantitativer Analysen aus den Datensätzen ausgeschlossen werden. Die Zellen #2-#4 zeigten nach Blaulichtbeleuchtung abnehmende Trends der relativen opTDP-43h-Spiegel zu EGFP-TDP-43z (Abbildung 3B), obwohl eine größere Analyse zuvor gezeigt hatte, dass die Abnahme der relativen opTDP-43h-Spiegel zu EGFP-TDP-43z statistisch nicht signifikant war (65 Zellen von drei unabhängigen Tieren)14.

Figure 1
Abbildung 1: Aufbau der BAC-DNA unter Verwendung des mnr2b-Locus . (A) Strukturen der Expressionskassetten für opTDP-43h und EGFP-TDP-43z. (B) Die genomische Region des Zebrafisches, die von der CH211-172N16 BAC DNA getragen wird. Die PCR-amplifizierten Expressionskassetten für opTDP-43h und EGFP-TDP-43z werden stromabwärts der 5′-untranslatierten Region (UTR) des mnr2b (roter Pfeil) im ersten Exon von mnr2b durch homologe Rekombination eingesetzt. Die Balken zeigen 500 (A) und 10k (B) bp an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Zahl anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Live-Bildgebung von opTDP-43h vor und nach der Lichtstimulation. (A) Ein Schema der Lichtstimulation von opTDP-43h, ausgedrückt in den spinalen Motoneuronen von hemmungslosen Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppelt transgenen Fischen durch eine Feldbeleuchtung aus blauem LED-Licht von 48 bis 72 hpf. (B) Max intensity projection images of the z-series confocal images of the ventral spinal cord before (48 hpf) and after (72 hpf) the light stimulation. Die gestrichelten Linien markieren die ventrale Grenze des Rückenmarks. Die Zahlen stammen aus Asakawa et al.14 (C) Cytoplasmic mislocalization of opTDP-43 after the 24-h blue light illumination. Die Konturen des Somas einer mnr2b-positiven Zelle (rote Pfeile in B), die bei 48 und 72 hpf beobachtet wurden, sind in Magenta dargestellt. Die Hauptachsen der Somas wurden hellblau dargestellt. Die normalisierte Fluoreszenzintensität entlang der Hauptachsen wurde aufgetragen. Das Sternchen zeigt einen Cluster starker opTDP-43-Signale an, die kein starkes EGFP-TDP-43z-überlappendes Signal aufweisen, was auf eine zytoplasmatische opTDP-43h-Fehllokalisierung hinweist. Die Balken zeigen 1 mm (A), 20 μm (B) und 4 μm (C) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ratiometrische Vergleiche von opTDP-43h und EGFP-TDP-43z vor und nach der Lichtstimulation. (A) ROIs, die die Somas von vier einzelnen mnr2b-positiven Zellen bei 48 und 72 hpf abdecken, wurden basierend auf dem EGFP-TDP-43z-Signal gezeichnet und sind in Magenta dargestellt. Die rechteckigen ROIs (bg) wurden verwendet, um das Hintergrundsignal (Hintergrund-ROI) zu subtrahieren. Die Zahlen stammen aus Asakawa et al.14 (B) Die relativen Intensitäten von opTDP-43h zu EGFP-TDP-43z wurden für jede Zelle zu jedem Zeitpunkt als RFP/GFP-Verhältnis aufgetragen. Zelle Nr. 1, gekennzeichnet durch das Sternchen, war für den ratiometrischen Vergleich nicht geeignet, da ihr EGFP-TDP-43z-Signal gesättigt und ihr RFP/GFP-Wert überschätzt wurde. Der Balken zeigt 10 μm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die mnr2b-BAC-vermittelte Expression von opTDP-43h und EGFP-TDP-43z im Zebrafisch bietet eine einzigartige Möglichkeit für die Live-Bildgebung des TDP-43-Phasenübergangs in den spinalen Motoneuronen. Die optische Transparenz des Körpergewebes von Zebrafischlarven ermöglicht die einfache und nichtinvasive optogenetische Stimulation von opTDP-43h. Vergleiche zwischen einzelnen spinalen Motoneuronen im Laufe der Zeit zeigten, dass die lichtabhängige Oligomerisierung von opTDP-43h seine zytoplasmatische Clusterbildung verursacht, die an die ALS-Pathologie erinnert.

Einer der kritischen Parameter, die das Phasenverhalten eines intrinsisch gestörten Proteins definieren, ist die intrazelluläre Konzentration. Ein hohes Maß an opTDP-43h-Expression könnte möglicherweise zu lichtunabhängiger opTDP-43h-Oligomerisierung, Phasenübergang und Aggregation führen. Daher ist die Induktion eines stabilen, ungiftigen Niveaus der opTDP-43h-Expression in den spinalen Motoneuronen der Schlüssel zur erfolgreichen Bewertung der physiologischen und pathologischen Folgen des opTDP-43-Phasenübergangs auf die spinalen Motoneuronen. Die mnr2b-BAC-vermittelte Expression von opTDP-43 h scheint für diesen Zweck geeignet zu sein, da Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Fische überwiegend nukleares opTDP-43 aufweisen, mit einer aufgeblasenen Schwimmblase frei schwimmen können und auch nach dem Aufziehen unter den kontinuierlichen dunklen Bedingungen von 1-5 dpf die volle Lebensfähigkeit behalten. Im Zebrafisch ist ein konventioneller Ansatz, der verwendet wird, um ein Gen von Interesse exogen zu exogen zu exprimieren, die mRNA-Injektion im Einzelzellstadium. Eine hohe Dosis des TDP-43-Proteins, die aus der injizierten mRNA auf einmal übersetzt wird, verursacht jedoch frühe Entwicklungsdefekte14, die Analysen später differenzierender spinaler Motoneuronen ausschließen. Die Senkung der Menge der injizierten mRNA auf ein tolerierbares Niveau liefert jedoch zum Zeitpunkt ihrer Differenzierung nicht genügend opTDP-43h für die optogenetische Modulation in den spinalen Motoneuronen, was darauf hindeutet, dass die mRNA-Injektion keine geeignete Methode ist, um opTDP-43h an die spinalen Motoneuronen des Zebrafisches abzugeben. Ein weiterer möglicher Ansatz zur Expression von opTDP-43h in den spinalen Motoneuronen ist die Injektion eines Plasmids oder einer BAC-DNA, die das opTDP-43h-Konstrukt beherbergt, im Einzelzellstadium unter der Kontrolle eines Promotors, der im spinalen Motoneuron aktiv ist. Obwohl die Injektion von mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA die Expression von opTDP-43h in den spinalen Motoneuronen steuern kann, ist die Anzahl der opTDP-43h-positiven Motoneuronen gering, und in solchen numerisch eingeschränkten opTDP-43h-positiven Zellen ist das Expressionsniveau in der Regel hoch, oft verbunden mit einer lichtunabhängigen opTDP-43h-Aggregation. Diese Beobachtungen deuten insgesamt darauf hin, dass die transgene Expression eine unersetzliche Strategie ist, um opTDP-43h in den spinalen Motoneuronen auf ungiftiger Ebene stabil auszudrücken. Obwohl das mnr2b-BAC fast alle spinalen Motoneuronen im Zebrafisch markiert20,23, könnten die Expressionsniveaus von opTDP-43h zwischen einzelnen mnr2b-positiven Zellen variieren. Diese Variation kann teilweise auf das intrinsische Expressionsmuster von mnr2b zurückzuführen sein, das mit seiner regulatorischen Rolle bei der Differenzierung von Motoneuronen verbunden ist. Eine weitere mögliche Ursache für die variegierte Expression kann sich aus einem Chromosomenpositionseffekt auf die mnr2b-BAC-Inserts ergeben. Was auch immer die Ursache ist, die unterschiedlichen opTDP-43-Expressionsniveaus zwischen mnr2b-positiven Zellen könnten variationen in der Zytotoxizität im Zusammenhang mit einem lichtabhängigen opTDP-43h-Phasenübergang verursachen.

Bei Zebrafischlarven sind die Somas der spinalen Motoneuronen im ventralen Rückenmark dicht ausgerichtet, und das somale Zytoplasma hat ein viel geringeres Volumen als das des axonalen Zytoplasmas. Dieses anatomische Merkmal schränkt quantitative Analysen des zytoplasmatischen opTDP-43h in den spinalen Motoneuronen ein: opTDP-43h ist nur quantitativ im Zellkern und im somalen Zytoplasma messbar, nicht aber in der gesamten Zelle von Motoneuronen. Die quantitative Bildgebung eines Proteins in der gesamten Zelle spinaler Motoneuronen, einschließlich des Somas und des peripheren Nerventerminals, bleibt eine herausfordernde Aufgabe. Trotz der Beschränkungen für quantitative Assays wurde gezeigt, dass das opTDP-43h/EGFP-TDP-43z-Verhältnis im Soma durch die ALS-verursachende Mutation in der IDR (A315T)14 erhöht ist. Daher ist die vorliegende Methode anwendbar, um die Auswirkungen der TDP-43-Mutation auf die Proteinstabilität im Zusammenhang mit dem Phasenübergang im Soma spinaler Motoneuronen zu bewerten.

Prinzipiell kann der mnr2b-BAC-Ansatz erweitert werden, um das LLPS zu modulieren und die Zytotoxizität anderer ALS-bezogener RNP-Proteine mit IDRs jenseits von TDP-43 zu bewerten. Möglicherweise müssen mehrere Protokollschritte angepasst werden, um ein optimales Expressionsniveau solcher optogenetischen Sonden in den spinalen Motoneuronen zu erhalten. Erstens wurde im transgenen Konstrukt Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] der hsp70l-Promotor als basaler Promotor verwendet, um die opTDP-43h-Expression zu steigern, die von mnr2b-Enhancern angetrieben wird. Der hsp70l-Promotor kann aus dem BAC-Konstrukt entfernt werden, wenn das Expressionsniveau eines interessierenden Proteins so hoch ist, dass es einen lichtunabhängigen ektopischen Phasenübergang verursacht. Zweitens ist opTDP-43h mit dem CRY2olig-Tag ausgestattet, einer Photolyase-Homologie-Domäne (PHR), die eine Punktmutation trägt, die die Clustering-Kapazität bei Blaulichtbeleuchtung erhöht22. Das Wildtypprotein CRY2PHR kann als lichtabhängiges Oligomerisierungs-Tag verwendet werden, wenn eine Dämpfung der lichtabhängigen Clustering-Aktivität erforderlich ist. Schließlich, um die ALS-Pathologie bei Zebrafischen genauer zu rekapitulieren, ist es wünschenswert, ein Beleuchtungsprotokoll zu erstellen, bei dem die Fischphysiologie durch die Feldbeleuchtung von blauem Licht während der juvenilen und adulten Stadien minimal beeinflusst wird. Das vorliegende Verfahren verwendet eine kontinuierliche Blaulichtbeleuchtung von 48 bis 72 hpf (für 24 h), und die Beleuchtungsdauer kann bis zu 120 hpf (für 72 h) verlängert werden, ohne die Lebensfähigkeit der Fische zu verlieren14, obwohl lichtempfindliche physiologische Funktionen wie das Sehen beeinträchtigt werden können. Durch die Entwicklung eines Protokolls für die intermittierende Lichtbeleuchtung kann eine viel längerfristige Lichtstimulation möglich werden, was wiederum die Entwicklung von opTDP-43h zu reiferen pathologischen Aggregaten erleichtern kann. Um dies zu erreichen, könnten auch andere optogenetische Sonden zur Modulation von Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung verschiedener Lichtwellenlängen, die physiologisch weniger störend sind24 , eine weitere Untersuchung wert sein. Kombinationen solcher verbesserten optogenetischen TDP-43-Sonden, geeigneter Promotoren, die auf krankheitsgefährdete Zelltypen abzielen, und Beleuchtungsprotokollen mit minimalen Auswirkungen auf physiologische Funktionen würden Wege eröffnen, um die Pathologien von TDP-43-Proteinopathien nicht nur im Rückenmark, sondern auch im Gehirn originalgetreu zu modellieren.

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Disclosures

KA und KK sind die Erfinder des in diesem Manuskript beschriebenen geistigen Eigentums und vorläufige Patente wurden vom Nationalen Institut für Genetik eingereicht.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant Nummern JP19K06933 (KA) und JP20H05345 (KA) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

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References

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Neuroscience Ausgabe 180 Neurodegenerative Erkrankungen ALS OptoTroplettsystem Cryptochrom 2 TDP-43 Zebrafisch Spinalmotoruron, mnr2b BAC-Transgenese
Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven
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Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

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