Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetisk faseovergang av TDP-43 i spinalmotor neuroner av sebrafisk larver

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Summary

Vi beskriver en protokoll for å indusere faseovergang av TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) ved lys i ryggmotornevronene ved hjelp av sebrafisk som modell.

Abstract

Unormal proteinaggregering og selektiv nevronsårbarhet er to store kjennetegn på nevrodegenerative sykdommer. Årsakssammenhenger mellom disse funksjonene kan bli forhørt ved å kontrollere faseovergangen av et sykdomsrelatert protein i en sårbar celletype, selv om denne eksperimentelle tilnærmingen har vært begrenset så langt. Her beskriver vi en protokoll for å indusere faseovergang av RNA/DNA-bindende protein TDP-43 i spinalmotoriske nevroner av sebrafisklarver for modellering av cytoplasmisk aggregering av TDP-43 som forekommer ved degenerering av motoriske nevroner i amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Vi beskriver en bakteriell kunstig kromosom (BAC)-basert genetisk metode for å levere en optogenetisk TDP-43-variant selektivt til spinalmotoriske nevroner av sebrafisk. Den høye gjennomskinneligheten til sebrafisk larver tillater faseovergangen av den optogenetiske TDP-43 i spinalmotornevronene ved en enkel ekstern belysning ved hjelp av en lysdiode (LED) mot uhemmet fisk. Vi presenterer også en grunnleggende arbeidsflyt for levende avbildning av sebrafisk spinalmotor nevroner og bildeanalyse med fritt tilgjengelig Fiji / ImageJ-programvare for å karakterisere responsen til den optogenetiske TDP-43 til lysbelysningen. Denne protokollen muliggjør karakterisering av TDP-43 faseovergang og aggregert dannelse i et ALS-sårbart cellemiljø, noe som bør lette en undersøkelse av cellulære og atferdsmessige konsekvenser.

Introduction

Ribonucleoprotein (RNP) granulater kontrollerer et utall cellulære aktiviteter i kjernen og cytoplasma ved å montere membranløse partisjoner via væske-væskefase separasjon (LLPS), et fenomen der en homogen væske demixes i to distinkte væskefaser1,2. Den dysregulerte LLPS av RNA-bindende proteiner som normalt fungerer som RNP-granulatkomponenter, fremmer unormal faseovergang, noe som fører til proteinaggregering. Denne prosessen har vært involvert i nevrodevelopmentale og nevrodegenerative sykdommer3,4,5. Den nøyaktige evalueringen av en årsakssammenheng mellom avvikende LLPS av RNA-bindende proteiner og sykdomspatogenese er avgjørende for å avgjøre om og hvordan LLPS kan utnyttes som et effektivt terapeutisk mål. LLPS av RNA-bindende proteiner er relativt lett å studere in vitro og i encellede modeller, men er vanskelig i multicellulære organismer, spesielt i vertebrater. Et kritisk krav for å analysere slike LLPS i enkeltceller i et vevsmiljø er å stabilt uttrykke en sonde for avbildning og manipulering av LLPS i en sykdomsseipømt celletype.

Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en til slutt dødelig nevrologisk lidelse der motoriske nevroner i hjernen og ryggmargen er selektivt og gradvis tapt på grunn av degenerasjon. Til dags dato har mutasjoner i mer enn 25 gener vært assosiert med den arvelige (eller familiære) formen av ALS, som står for 5% -10% av totale ALS-tilfeller, og noen av disse ALS-forårsakende genene koder RNA-bindende proteiner som består av RNPer, for eksempel hnRNPA1, TDP-43 og FUS6,7. Videre er den sporadiske formen for ALS, som står for 90% -95% av totale ALS-tilfeller, preget av cytoplasmisk aggregering av TDP-43 deponert i degenererende motoriske nevroner. En viktig egenskap ved disse ALS-assosierte RNA-bindende proteinene er deres iboende uordnede regioner (IDRs) eller lavkompleksitetsdomener som mangler bestilte tredimensjonale strukturer og formidler svake proteinproteininteraksjoner med mange forskjellige proteiner som driver LLPS7,8. Det faktum at ALS-forårsakende mutasjoner ofte forekommer i IDR-ene, har ført til ideen om at avvikende LLPS og faseovergang av disse ALS-relaterte proteinene kan underbemanne ALS-patogenese9,10.

Nylig ble optoDroplet-metoden, en Cryptochrome 2-basert optogenetisk teknikk som tillater modulering av proteinproteininteraksjoner med lys, utviklet for å indusere faseovergang av proteiner med IDRs11. Siden denne teknikken har blitt utvidet til TDP-43, har den begynt å avdekke mekanismene som ligger til grunn for den patologiske faseovergangen til TDP-43 og den tilhørende cytotoksisiteten12,13,14,15. I denne protokollen skisserer vi en genetisk metode for å levere en optogenetisk TDP-43 til ALS-sårbare celletyper, nemlig spinalmotoriske nevroner i sebrafisk ved hjelp av BAC for mnr2b/mnx2b-genet som koder et homeodomainprotein for motorisk nevronspesifikasjon16,17. Den høye gjennomskinneligheten til sebrafisk larver gir enkel, ikke-invasiv lysstimulering av optogenetisk TDP-43 som utløser sin faseovergang i ryggmotornevronene. Vi presenterer også en grunnleggende arbeidsflyt for levende bildebehandling av sebrafisk spinalmotor nevroner og bildeanalyse ved hjelp av den fritt tilgjengelige Fiji / ImageJ-programvaren for å karakterisere responsen til den optogenetiske TDP-43 til lysstimuleringen. Disse metodene muliggjør en undersøkelse av TDP-43 faseovergang i et ALS-sårbart cellulært miljø og bør bidra til å utforske sine patologiske konsekvenser på cellulære og atferdsmessige nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt fiskearbeid ble utført i henhold til Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Institutional Animal Care and Use Committee (godkjenningsidentifikasjonsnummer 24-2) fra National Institute of Genetics (Japan), som har en animal welfare assurance on file (sikkerhetsnummer A5561-01) ved Office of Laboratory Animal Welfare of the National Institutes of Health (NIH, USA).

1. Bygging av BACs for uttrykk for optogenetisk TDP-43 gen fra mnr2b-promotoren

  1. BAC forberedelse
    1. Kjøp en sebrafisk BAC-klone som inneholder sebrafisk mnr2b locus (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Rens BAC DNA fra en 5 ml over natten LB-kultur av DH10B Escherichia coli (E. coli) som huser CH211-172N16 som beskrevet i Warming et al.18.
    2. Forvandle CH211-172N16 til SW102 E. coli-celler ved elektroporasjon, som beskrevet i Warming et al.18.
      MERK: Rensing av BAC DNA fra E. coli på samme dag av elektroporasjon gir vanligvis en høyere suksessrate for BAC-transformasjon18. Ellers holdes det rensede BAC DNA ved -20 °C til bruk.
    3. Introduser iTol2-amp-kassetten for Tol2 transposonmediert BAC-transgenese19 i ryggraden i CH211-172N16 ved elektroporasjon, som beskrevet i Asakawa et al.20.
      1. Lag en glyserol lager av E. coli-cellekloner som bærer CH211-172N16 med iTol2-amp kassettintegrasjon (CH211-172N16-iTol2A) etter å ha bekreftet den homologe rekombinasjonsmedierte integrasjonen ved polymerasekjedereaksjon (PCR) (Ex Taq) ved hjelp av primerparet Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') og pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') og følgende betingelser: et denatureringstrinn ved 98 °C i 1 min, etterfulgt av 25 sykluser med denaturering ved 95 °C i 10 s, primer annealing ved 55 °C i 15 s, og primerforlengelse ved 72 °C i 1 min, noe som forsterker et PCR-produkt på 354 basepar (bp).
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h konstruksjon
    1. Konstruer en plasmid som bærer uttrykkskassett for den menneskelige villtypen TDP-43/TARDBP (TDP-43h) som er merket med mRFP1 og CRY2olig ved henholdsvis N- og C-termini (heretter opTDP-43h)14.
      MERK: OpTDP-43h fragmentet skal flankeres med sebrafisk hsp70l genpromotorsekvens (650 bp) og polyadenyleringssignalsekvens (polyA), etterfulgt av et kanamycinresistensgen (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Forsterk hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-kassetten med primere som anneal hsp70l og Kan og inneholder 45 bp sekvenser av oppstrøms og nedstrøms av initiatorkokonene til mnr2b-genet av PCR (GXL DNA Polymerase) ved hjelp av primerparet mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') og Km-r (5'-ggt tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') med følgende forhold: et denatureringstrinn ved 98 °C i 1 min, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 95 °C i 10 s, primer annealing ved 55 °C i 15 s, og primerforlengelse ved 68 °C i 30 s, forsterker et PCR-produkt på ~ 5,7 bp.
    3. Skill PCR-produktene ved agarose gelelektroforese (100 V) og rens hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA-båndet med en DNA-kolonne. Juster konsentrasjonen av den rensede hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-kassetten til 50 ng/μL i Tris-EDTA-bufferen (TE) som inneholder 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 1 mM EDTA.
    4. Introduser hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-kassetten i CH211-172N16-iTol2A ved elektroporasjon som beskrevet i Warming et al.18 og utvalgte ampicillin- og kanamycinresistente transformanter på LB agarplater. CH211-172N16-iTol2A som bærer hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-kassetten er utpekt som mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Rens mnr2b-hs:opTDP-43h ved hjelp av et BAC-rensesett og oppløs det ved 250 ng/μL i TE etter fenol/kloroformekstraksjon.
  3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z konstruksjon
    1. Konstruer en annen plasmid som bærer sebrafisk villtype tardbp som er merket med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) ved sin N-terminus (EGFP-TDP-43z) i stedet for opTDP-43h, men er ellers identisk med hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-konstruksjonen (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Bruk EGFP-TDP-43z som internkontroll for lysstimulering av opTDP-43h.
    2. Konstruer CH211-172N16-iTol2A som huser hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan-kassetten i mnr2b-locus som beskrevet i 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A som bærer hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan-kassetten er utpekt som mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Tol2 transposonmediert BAC-transgenese i sebrafisk

  1. Forbered injeksjonsoppløsningen som inneholder 40 mM KCl, fenolrød (10% v / v), 25 ng / μL av mnr2b-hs: opTDP-43h DNA og 25 ng / μL Tol2 transposase mRNA19.
  2. Injiser 1 nL av injeksjonsoppløsningen (en dråpe med en diameter på ca. 123 μm kalibrert i mineralolje) i cytosolen av villtype sebrafiskembryoer i encellet stadium. Screen den injiserte fisken for dannelsen av rødt fluorescerende protein (RFP)-positive aggregater i ulike embryonale vev, inkludert spinalmotoriske nevroner, under et fluorescens stereomikroskop ved 2-3 dager etter befruktning (dpf). Løft den RFP-positive fisken til voksen alder.
  3. Injiser mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA som beskrevet i 2.1 og 2.2. Hev EGFP-positiv fisk til voksen alder.
  4. Etter noen måneder, legg seksuelt modnet injisert fisk og villfisk i par i standard 2 L parringsmerder for å oppnå F1 avkom. Skjerm F1 fisk ved 3 dpf for RFP (opTDP-43h) eller EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescens i ryggmotorkolonnen ved hjelp av et epifluorescensmikroskop utstyrt med et Plan-Neofluar 5x / 0,15 objektiv linse. Vanligvis er en av grunnleggerne identifisert fra 10-20 injisert fisk (bakterieoverføringshastigheten er 5%-10%).
  5. Isoler og sammenlign flere Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] og Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] innlegg fra forskjellige grunnleggerfisk, da intensiteten, men ikke mønsteret, av opTDP-43h eller EGFP-TDP-43z uttrykk kan variere mellom grunnleggerfisk på grunn av kromosomale posisjonseffekter.
  6. Cross Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] og Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] fiskelinjer for å få avkom som inneholder Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgenisk fisk i et mendelisk forhold.
  7. Løft fisken i en plastfat som inneholder 30 ml E3 buffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% Metylenblå) og tilsett 0,003% (w/v) N-fenylthiourea ved 8-10 h etterbefruktning (HPF) for å hemme melanogenese.
  8. Dekk plastfatet med aluminiumsfolie etter 30 hkf.

3. Forberedelse av LED for blått lysbelysning

  1. Slå på et LED-panel ved hjelp av det tilknyttede programmet som er installert på et nettbrett / en telefon. Sett proben på et spektrometer i en tom brønn på en 6 brønnfat og juster LED-lyset til bølgelengden som topper seg på ~ 456 nm gjennom applikasjonen. Plasser den optiske sensoren til en optisk kraftmåler i den tomme brønnen og juster kraften til LED-lyset (~0,61 mW/cm2). LED-lysinnstillingen kan lagres og kan hentes i applikasjonen.
  2. Sett inn parabolen/LED-panelinnstillingen på inkubatoren ved 28 °C. Fullfør dette trinnet før avbildning av fisk starter på 48 hkf.

4. Avbildning av sebrafisk larver som uttrykker optogenetisk TDP-43

  1. Velg Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk minst før 47 hkf, basert på RFP (opTDP-43h) eller EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescens i ryggmotorkolonnen ved hjelp av epifluorescensmikroskopet som er beskrevet ovenfor.
  2. Dechorionate Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk.
  3. Forvarm 1% lav smeltetemperatur agarose som inneholder 250 μg / ml etyl 3-aminobenzoat metansulfat salt ved 42 °C.
  4. Bedøv kort Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] dobbelttransgen fisk ved 48 hkf i E3-buffer som inneholder samme konsentrasjon av Tricane.
  5. Sett en dråpe av den forvarmede 1% lave smeltetemperaturen som oppsto på glassbasefatet ved romtemperaturen. Diameteren på den kuppelformede agarosedråpen på glassfatet er 8-10 mm.
  6. Bruk en Pasteur pipette, tilsett bedøvet fisk til den lave smeltetemperaturen som oppsto på glassbunnsfatet, og bland deretter ved pipettering et par ganger. Minimer mengden av E3-bufferen som legges til agarose sammen med fisken.
  7. Vedlikehold fisken på siden ved å bruke en sprøytenål under størkning av agarose (vanligvis ~ 1 min) for å sikre at ryggmargen er i riktig horisontal stilling. Etter størkningen legger du et par dråper E3-buffer på den kuppelformede agarosemonterte fisken.
  8. Skaff deg serielle konfokale z-deler av ryggmargen ved å skanne med et konfokalt mikroskop utstyrt med et 20x vanninnlevelsesmål objektiv med den numeriske blenderåpningen 1,00, ved hjelp av en skannehastighet på 4,0 μs per piksel (12 biter per piksel), en trinnstørrelse på 1,0 μm per stykke for målet, og en kombinasjon av eksitasjons-/utslippsbølgelengder: Kanal 1) 473/510 nm for EGFP og kanal 2) 559/583 nm for mRFP1.
    MERK: Cloaca på ventral side av fisken er inkludert i interesseområdene (ROI) som referanse, noe som bidrar til å identifisere og sammenligne ryggsegmentene (nivå 16-17) på tvers av tidspunktene.
  9. Fjern fisken fra agarose ved å forsiktig knekke agarose med en sprøytenål så snart avbildningen er fullført. Hold tiden fisken er innebygd i agarose så kort som mulig, selv om agarose innebyggingen i <30 min ikke påvirker fiskens levedyktighet.

5. Lysstimulering av opTDP-43h-uttrykkende fisk ved feltbelysning av et blått lysdiodelys (LED)

  1. Tilsett 7,5 ml E3-buffer i brønnen og plasser bildet Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk inn i brønnen. Plasser den seks-brønns parabolen på LED-panelet ved å holde parabolen og LED-panelet 5 mm fra hverandre med et avstandsstykke (for eksempel med fem lysbildebriller stablet).
  2. Slå på det blå LED-lyset. Behold noe av Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk i en separat seks-brønns tallerken dekket med aluminiumsfolie når uforlignelig kontrollfisk er nødvendig (dvs. under mørke forhold)14.
  3. Etter belysningen (f.eks. i 24 timer ved 72 hkf i figur 3), kan du se for deg ryggmargen til den opplyste fisken ved å gjenta trinnene 4,3 - 4,9.

6. Visualisering av cytoplasmisk flytting av optogenetisk TDP-43 i spinalmotoriske nevroner

  1. Åpne bildefilen i ImageJ/Fiji21 (versjon: 2.1.0/1.53c), et java-bildebehandlingsprogram med åpen kildekode utviklet av NIH Image, som kan lastes ned fra https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Bruk Z-rullefeltet til å bevege deg gjennom fokusplanene. Opprett en maksimal intensitetsprojeksjon av flere stykker ved å klikke Bilde | Stabler | Z-prosjekt | Maksimal intensitet og innstilling Start-stykke og Stopp-stykke som dekker hemisegmentene i ryggmotorkolonnen.
  3. Del flerkanalsbildet i to enkanalsbilder ved å klikke Bilde | Farge | Delte kanaler.
  4. Forbedre EGFP-TDP-43z-signalet for å sikre at cytoplasmisk EGFP-TDP-43z er synlig tydelig ved å klikke på Bilde | Juster | Lysstyrke/kontrast og justering Minimum
  5. Åpne avkastningen ved å klikke Analyser | Verktøy | Avkastningssjef. Finn cellene som er identifiserbare i begge bildene på 48 HPF og 72 HPF, basert på de relative posisjonene til cellekroppene. Angi ROIene ved å skissere konturene av cellelegemer av enkle spinalmotoriske nevroner visualisert av EGFP-TDP-43z-signalet ved hjelp av Freehand-valg, og klikk deretter Legg til[t] i ROI-lederen.
  6. Angi en hovedakse for soma ved å tegne en rett linje ved hjelp av Rett og klikk Analyser | Plottprofil for EGFP-TDP-43z (C1) og opTDP-43h (C2) bilder med 48 og 72 hk.
  7. Normaliser plottprofilen ved å dele verdiene med den største verdien for hvert EGFP-TDP-43z- og opTDP-43h-signal. Tegn inn de normaliserte verdiene med x-y-koordinater, der x og y representerer hovedaksen til henholdsvis soma og relative fluorescerende intensiteter ved hjelp av XY-graf i en statistisk programvare.

7. Forholdsmetrisk sammenligning mellom opTDP-43h- og EGFP-TDP-43z-signaler ved hjelp av ImageJ / Fiji

  1. Åpne bildefilen i ImageJ/Fiji og angi ROIer for enkeltmnr2b-positive celler ved hjelp av et maksimalt intensitetsprojeksjonsbilde av EGFP-TDP-43z som i 6.1-6.5. Tilsett en avkastning utenfor ryggmargen (f.eks. notokord) for å representere bakgrunnssignalet (bakgrunns-AVKASTNING).
  2. For hvert EGFP-TDP-43z- og opTDP-43-bilde oppretter du en projeksjon av flere stykker ved å klikke bilde | Stabler | Z-prosjekt | Summer stykker og sett Start-stykke og Stopp-stykke som dekker den hemispinale motorkolonnen.
  3. Åpne ROI-lederen som er opprettet med bildet for maksimal intensitetsprojeksjon. Vis ROIene på Sum Slices-bildet ved å velge bildevinduet for EGFP-TDP-43z og deretter klikke Vis alt i ROI-behandling. Klikk mål i avkastningsstyringen for å få gjennomsnittsverdier for hver avkastning.
  4. Hent gjennomsnittsverdier for opTDP-43h etter samme prosedyre som er angitt i 7.3.
  5. For hver avkastning, etter å ha trukket fra gjennomsnittet for bakgrunns-AVKASTNINGEN, deler du det trukket gjennomsnittet for opTDP-43h med det trukket gjennomsnittet for EGFP-TDP-43z for å oppnå den rasjonsmetriske verdien. De forholdsmetriske verdiene kan sammenlignes mellom ulike tidspunkter og presenteres ved hjelp av kolonnegraf i Prism-programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Levende avbildning av optogenetiske og ikke-optogenetiske TDP-43 proteiner i mnr2b+ spinalmotoriske nevroner av sebrafisk larver
For å indusere TDP-43 faseovergang i spinalmotoriske nevroner i sebrafisk, ble et menneske TDP-43h som er merket med mRFP1 og CRY2olig22 ved henholdsvis N- og C-termini, konstruert og utpekt som opTDP-43h14 (figur 1A). OpTDP-43h-genfragmentet ble introdusert i en BAC som inneholder mnr2b locus (figur 1B). Den resulterende BAC, utpekt som mnr2b-hs:opTDP-43h, ble introdusert i sebrafiskgenomet av Tol2 transposonmediert BAC-transgenese19. For å overvåke lokaliseringen av ikke-optogenetisk TDP-43 i spinalmotornevronene ble en sebrafisk TDP-43 kodet av tardbpgen tagget med EGFP ved N-terminus (figur 1A) og EGFP-TDP-43z genfragment ble introdusert i mnr2b BAC, lik opTDP-43h (figur 1B). Den resulterende BAC, utpekt som mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, ble introdusert i sebrafiskgenomet av Tol2 transposonmediert BAC-transgenese. Fisken injisert med hver BAC-konstruksjon ble krysset med en villfisk og den resulterende F1 fisken ble screenet på dag 3 for rød (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) eller grønn (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) fluorescens i ventral ryggmargen. Den isolerte røde eller grønne fluorescenspositive F1-fisken ble utpekt som Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] eller Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z], henholdsvis.

Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk ved 48 hkf ble bedøvet og innebygd i en lav smeltende agarose på deres side; Etter agarose størkning ble de dekket med E3-buffer for å tillate observasjoner av sidesiden av ryggmargen ovenfra. Confocal laser skanning mikroskopi ble utført med en 20x vann nedsenking objektiv linse og en kombinasjon av eksitasjon / utslipp bølgelengder: 473/510 nm for EGFP og 559/583 nm for mRFP1. Den skannede fisken ble umiddelbart og forsiktig tatt fra agarose, overført til E3 buffer i en seks-brønns plate, og opplyst av et blått LED-lys ved å plassere platen på et LED-panel ved 28 °C (figur 2A, B). Etter en 24-timers belysning ble fisken bedøvet og innebygd igjen i agarose før den ble skannet med en konfokal mikroskopi ved hjelp av de samme bildeforholdene, bortsett fra at avkastningen ble justert til å inkludere den tilsvarende ryggmargen som ble avbildet ved 48 hkf (figur 2B). Hele hemispinalmargen på 4-5 sammenhengende ryggsegmenter ble avbildet under mikroskopiøkten (vanligvis 20-30 min), og genererte z-serie bilder som inneholder 20-40 skiver avhengig av horisontaliteten til lengdeaksen til ryggmargen til den monterte fisken i forhold til det kondole skanneplanet.

Visualisering av cytoplasmisk flytting av optogenetisk TDP-43 i spinalmotoriske nevroner
For å visualisere den cytoplasmatiske flyttingen av opTDP-43h i enkle spinalmotoriske nevroner, ble z-seriebildene (vanligvis 20-40 skiver) oppnådd ved 48 og 72 hpf åpnet med Fiji og delt inn i hver EGFP-TDP-43z og opTDP-43h kanal. Maks intensitet projeksjon bilder av EGFP-TDP-43z ble opprettet for bilder på 48 og 72 HPF og en enkelt isolert spinal neuron identifiserbar i begge bildene på 48 og 72 HPF ble valgt (Figur 2B, piler). Spinalmotoriske nevroner med cellelegemer plassert på dorsalsiden av motorkolonnen ble ansett som egnet for målinger av cellekroppsformen på grunn av deres sparsomme distribusjonsmønstre.

Etter å ha justert intensiteten til EGFP-signalet i EGFP-TDP-43z-bilder, ble ROIer som dekker somas av motornevronene satt ved å spore kanten av EGFP-signalet ved 48 og 72 hkf (figur 2C). Den fluorescerende intensiteten langs hovedaksen til soma ble målt for EGFP-TDP-43z- og opTDP-43h-signalene ved 48 og 72 hk (figur 2C, høyre). Ved 48 hkf overlappet mønstrene til opTDP-43h og EGFP-TDP-43z i stor grad hverandre.

I motsetning, på 72 hpf, ble toppen av opTDP-43h-signalet funnet i regionen der EGFP-TDP-43z-signalet var lavt, nemlig i cytoplasma, noe som indikerer den cytoplasmatiske flyttingen av opTDP-43h. Den lysavhengige cytoplasmatiske opTDP-43h-flyttingen initieres i stor grad uavhengig av ikke-optogenetisk TDP-4314. I denne analysen ble max intensitetsprojeksjonsbilder brukt til å estimere posisjonen til kjernen / cytoplasmagrensen på bekostning av kvantitative målinger.

Ratiometrisk sammenligning av fluorescensintensiteten til optogenetiske og ikke-optogenetiske TDP-43 i spinalmotornevronene
For å evaluere effekten av blålystimulering på de svingende opTDP-43h proteinnivåene ble opTDP-43h-signaler i cellekroppen målt før og etter lysstimuleringen med referanse til EGFP-TDP-43z-signalet. Z-seriebildene, inkludert spinal hemisegmentet, ble åpnet med Fiji. For å angi ROIer som dekker enkle spinalmotoriske nevroner, ble Max intensitetsprojeksjonsbilder av EGFP-TDP-43z-signalet opprettet for 48 og 72 HPF, og enkeltisolerte spinalnevroner som var identifiserbare i både 48 og 72 HPF-bilder ble valgt (figur 3A). Ved hjelp av frihåndsvalg ble ROIer tegnet og registrert i en ROI-behandling for hvert av de 48 og 72 HPF-bildene (figur 3A). Maksimal intensitetsprojeksjon av EGFP-TDP-43z-signalet ble ansett som egnet til å stille inn ROIene på grunn av den høye kontrasten.

For å kvantifisere opTDP-43h- og EGFP-TDP-43z-signalene ble sumskiveprojeksjonsbilder for hver kanal med de samme z-seriebildene produsert for 48 og 72 hkf (figur 3A). Ved hjelp av de registrerte ROI-settene ble de fluorescerende intensitetene til opTDP-43h og EGFP-TDP-43z målt for hvert tidspunkt. Relative mengder opTDP-43h til EGFP-TDP-43z (RFP/GFP-verdier) ble beregnet for hver celle og hvert tidspunkt ved å dividere RFP-verdien med GFP-verdien (figur 3B). Av de fire mnr2b-positive cellene som ble undersøkt, viste celle #1 spesielt et mettet EGFP-TDP-43z-signal (figur 3A). Celler med mettede fluorescerende signaler bør utelukkes fra datasettene ved kvantitative analyser. Celler #2-#4 viste synkende trender for relative opTDP-43h-nivåer til EGFP-TDP-43z etter blått lysbelysning (figur 3B), selv om en større analyse tidligere viste at nedgangen i relative opTDP-43h-nivåer til EGFP-TDP-43z ikke var statistisk signifikant (65 celler fra tre uavhengige dyr)14.

Figure 1
Figur 1: Konstruksjon av BAC DNA ved hjelp av mnr2b locus. (A) Strukturer av uttrykkskassettene for opTDP-43h og EGFP-TDP-43z. (B) Sebrafiskgenomiske regionen som bæres av CH211-172N16 BAC DNA. PcR-forsterket uttrykk kassetter for opTDP-43h og EGFP-TDP-43z er satt nedstrøms av 5′-untranslated regionen (UTR) av mnr2b (rød pil) i den første exon av mnr2b ved homolog rekombinasjon. Stolpene indikerer 500 (A) og 10k (B) bp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Levende bildebehandling av opTDP-43h før og etter lysstimulering. (A) En ordning for lysstimulering av opTDP-43h uttrykt i spinalmotoriske nevroner av uhemmet Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk gjennom en feltbelysning av blått LED-lys fra 48 til 72 hk. (B) Maks intensitet projeksjon bilder av z-serien konfekt bilder av ventral ryggmargen før (48 HPF) og etter (72 HPF) lysstimulering. De stiplede linjene avgrenser ryggmargens ventrale grense. Tall er tilpasset fra Asakawa et al.14 (C) Cytoplasmic mislocalization av opTDP-43 etter 24-timers blå lysbelysning. Konturene av soma av en mnr2b-positiv celle (røde piler i B) observert ved 48 og 72 hpf er vist i magenta. De store aksene i somaene ble vist med lyseblå. Den normaliserte fluorescerende intensiteten langs de store aksene ble plottet inn. Stjernen indikerer en klynge med sterke opTDP-43-signaler som ikke viser et sterkt EGFP-TDP-43z overlappende signal, noe som indikerer cytoplasmatisk opTDP-43h feillokalisering. Stolpene indikerer 1 mm (A), 20 μm (B) og 4 μm (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Forholdsmetriske sammenligninger av opTDP-43h og EGFP-TDP-43z før og etter lysstimulering. (A) ROIer som dekker somas av fire enkelt mnr2b-positive celler på 48 og 72 hkf ble trukket basert på EGFP-TDP-43z-signalet og vises i magenta. De rektangulære ROIene (bg) ble brukt til å trekke fra bakgrunnssignalet (bakgrunns-ROI). Tallene er tilpasset fra Asakawa et al.14 (B) De relative intensitetene av opTDP-43h til EGFP-TDP-43z ble plottet for hver celle på hvert tidspunkt som RFP / GFP-forholdet. Celle #1, indikert av stjernen, var ikke egnet for den forholdsmetriske sammenligningen fordi EGFP-TDP-43z-signalet var mettet og RFP/ GFP-verdien ble overvurdert. Baren indikerer 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det mnr2b-BAC-medierte uttrykket for opTDP-43h og EGFP-TDP-43z i sebrafisk gir en unik mulighet for levende bildebehandling av TDP-43 faseovergang i ryggmotornevronene. Den optiske gjennomsiktigheten av kroppsvev av sebrafisk larver gir mulighet for enkel og ikke-invasiv optogenetisk stimulering av opTDP-43h. Sammenligninger mellom enkle spinalmotoriske nevroner over tid viste at den lysavhengige oligomeriseringen av opTDP-43h forårsaker sin cytoplasmatiske klynger, som minner om ALS-patologi.

En av de kritiske parametrene som definerer faseoppførselen til et iboende forstyrret protein er intracellulær konsentrasjon. Et høyt nivå av opTDP-43h-uttrykk kan potensielt føre til lysuavhengig opTDP-43h oligomerisering, faseovergang og aggregasjon. Dermed er induksjonen av et stabilt, ikke-giftig nivå av opTDP-43h-uttrykk i spinalmotornevronene nøkkelen til vellykket evaluering av de fysiologiske og patologiske konsekvensene av opTDP-43 faseovergang på ryggmotornevronene. Det mnr2b-BAC-medierte uttrykket for opTDP-43 h ser ut til å være egnet for dette formålet fordi Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] fiskedisplay overveiende kjernefysisk opTDP-43, de er i stand til fri svømming med en oppblåst svømmeblære og de opprettholder full levedyktighet selv etter å ha blitt hevet under de kontinuerlige mørke forholdene fra 1-5 dpf. I sebrafisk er en konvensjonell tilnærming som brukes til å eksogent uttrykke et gen av interesse mRNA-injeksjon på encellet stadium. Imidlertid forårsaker en høy dose av TDP-43-proteinet oversatt fra den injiserte mRNA på en gang tidlige utviklingsfeil14 som utelukker analyser av senere differensiering av spinalmotoriske nevroner. Senking av mengden injisert mRNA til et tolerabelt nivå klarer imidlertid ikke å levere tilstrekkelig opTDP-43h for optogenetisk modulasjon i spinalmotornevronene ved tidspunktet for differensiering, noe som indikerer at mRNA-injeksjon ikke er en passende metode for å levere opTDP-43h til ryggmotorne til sebrafisk. En annen mulig tilnærming som brukes til å uttrykke opTDP-43h i spinalmotornevronene injiserer, på encellet stadium, et plasmid- eller BAC DNA som skjuler opTDP-43h-konstruksjonen under kontroll av en promotor som er aktiv i ryggmotornevronen. Selv om injeksjonen av mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA kan lede uttrykket av opTDP-43h i spinalmotornevronene, er antall opTDP-43h-positive motornevroner lave, og i slike numerisk begrensede opTDP-43h-positive celler er uttrykksnivået vanligvis høyt, ofte forbundet med lysuavhengig opTDP-43h aggregering. Disse observasjonene antyder samlet at transgent uttrykk er en uerstattelig strategi for å stabilt uttrykke opTDP-43h i ryggmotoriske nevroner på et ikke-giftig nivå. Spesielt, selv om mnr2b-BAC merker nesten alle spinalmotoriske nevroner i sebrafisk20,23, kan uttrykksnivåene til opTDP-43h variere mellom individuelle mnr2b-positive celler. Denne variasjonen kan delvis skyldes det iboende uttrykksmønsteret til mnr2b forbundet med sin regulatoriske rolle i motorisk nevrondifferensiering. En annen potensiell årsak til det varierte uttrykket kan skyldes en kromosomal posisjonseffekt på mnr2b-BAC-innsatsene. Uansett årsak kan de varierte opTDP-43-uttrykksnivåene blant mnr2b-positive celler forårsake variasjon i cytotoksisitet forbundet med lysavhengig opTDP-43h faseovergang.

I sebrafisk larver er somas av spinalmotoriske nevroner tett justert i ventral ryggmargen, og den somaliske cytoplasma har et mye lavere volum enn axonal cytoplasma. Denne anatomiske funksjonen begrenser kvantitative analyser av cytoplasmatisk opTDP-43h i spinalmotornevronene: opTDP-43h er bare kvantitativt målbar i kjernen og somal cytoplasma, men ikke i hele cellen av motoriske nevroner. Kvantitativ avbildning av et protein i hele cellen av spinalmotoriske nevroner, inkludert soma og perifer nerveterminal, er fortsatt en utfordrende oppgave. Til tross for restriksjonene på kvantitative analyser, viste det seg at opTDP-43h/EGFP-TDP-43z-forholdet i soma ble forhøyet av ALS-forårsakende mutasjon i IDR (A315T)14. Derfor gjelder den nåværende metoden for å evaluere effekten av TDP-43-mutasjonen på proteinstabilitet forbundet med faseovergang i soma av spinalmotoriske nevroner.

I prinsippet kan mnr2b-BAC-tilnærmingen utvides for å modulere LLPS og evaluere cytotoksisiteten til andre ALS-relaterte RNP-proteiner med IDRs utover TDP-43. Flere protokolltrinn må kanskje justeres for å oppnå et optimalt uttrykksnivå av slike optogenetiske sonder i ryggmotornevronene. For det første, i Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] transgen konstruksjon, ble hsp70l-promotoren brukt som en basalpromotor for å øke opTDP-43h-uttrykket drevet av mnr2bforsterkere . Hsp70l-promotoren kan fjernes fra BAC-konstruksjonen hvis uttrykksnivået til et protein av interesse er så høyt at det forårsaker lysuavhengig ektopisk faseovergang. For det andre er opTDP-43h utstyrt med CRY2olig tag, som er et fotolyase homology (PHR) domene som bærer en punktmutasjon som forbedrer klyngekapasiteten på blått lys belysning22. Wild-type proteinet CRY2PHR kan brukes som en lysavhengig oligomeriseringskode hvis det er behov for å dempe lysavhengig klyngeaktivitet. Til slutt, for å mer trofast rekapitulere ALS-patologi i sebrafisk, er det ønskelig å etablere en belysningsprotokoll der fiskefysiologi er minimalt påvirket av feltbelysningen av blått lys under ungdoms- og voksenstadiene. Den nåværende metoden bruker en kontinuerlig blått lysbelysning fra 48 til 72 hkf (i 24 timer), og belysningsvarigheten kan forlenges til 120 hkf (i 72 timer) uten å miste fiskens levedyktighet14, selv om lysresponsive fysiologiske funksjoner, som syn, kan påvirkes. Ved å utvikle en protokoll for periodisk lysbelysning kan mye langsiktig lysstimulering bli mulig, noe som igjen kan lette utviklingen av opTDP-43h til mer modne patologiske aggregater. For å oppnå dette kan andre optogenetiske sonder for modulering av proteinproteininteraksjoner ved hjelp av forskjellige lysbølgelengder som er mindre fysiologisk forstyrrende24 , også være verdt å undersøke videre. Kombinasjoner av slike forbedrede optogenetiske TDP-43-sonder, passende promotorer rettet mot sykdoms-sårbare celletyper og belysningsprotokoller med minimal effekt på fysiologiske funksjoner ville åpne veier for trofast modellering av patologiene til TDP-43 proteinopatier, ikke bare i ryggmargen, men også i hjernen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

KA og KK er oppfinnerne av åndsverk som er beskrevet i dette manuskriptet, og foreløpige patenter er sendt inn av National Institute of Genetics.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant-nummer JP19K06933 (KA) og JP20H05345 (KA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 180 nevrodegenerativ sykdom ALS optoDroplet-system Cryptochrome 2 TDP-43 sebrafisk spinalmotorisk nevron, mnr2b BAC-transgenese
Optogenetisk faseovergang av TDP-43 i spinalmotor neuroner av sebrafisk larver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. … More

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter