Summary
Multiplex in situ hybridization (ISH) blev ansat til samtidig at visualisere udskrifter for to G protein-koblede receptorer og en transskription faktor i hele vagal ganglionic kompleks af den voksne mus. Denne protokol kan bruges til at generere nøjagtige kort over de transskriptionelle profiler af vagale afferent neuroner.
Abstract
Denne undersøgelse beskriver en protokol for multiplex in situ hybridisering (ISH) af musen jugular-nodose ganglier, med særlig vægt på at opdage udtrykket af G protein-koblede receptorer (GPCRs). Formalin-faste jugular-nodose ganglier blev behandlet med RNAscope teknologi til samtidig at opdage udtrykket af to repræsentative GPCRs (cholecystokinin og ghrelin receptorer) i kombination med en markør gen af enten nodose (parret-lignende homeobox 2b, Phox2b) eller halspulsåren afferent neuroner (PR domæne zink finger protein 12, Prdm12). Mærket ganglier blev afbildet ved hjælp af konfokal mikroskopi til at bestemme fordelingen og udtryk mønstre af de ovennævnte udskrifter. Kort, Phox2b afferent neuroner blev fundet at rigeligt udtrykke cholecystokinin receptor (Cck1r), men ikke ghrelin receptor (Ghsr). En lille delmængde af Prdm12 afferent neuroner blev også fundet at udtrykke Ghsr og / eller Cck1r. Potentielle tekniske forbehold i design, forarbejdning og fortolkning af multiplex ISH diskuteres. Den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne artikel, kan hjælpe forskere med at generere nøjagtige kort over transskriptionsprofilerne for vagale afferent neuroner.
Introduction
Cellekroppe af vagale afferents er indeholdt i jugular, petrosal, og nodose ganglier1,2,3. Deres axoner rejser sammen via flere grene af vagusnerven til craniocervical, thorax og abdominal territorier4,5,6,7. Fra deres viscerale slutninger kan vagale afferents reagere på en bred vifte af fysiologiske og skadelige stimuli8,9,10. Imidlertid er fordelingen af signalmolekyler og receptorer, der er involveret i vagal sensing, stadig dårligt karakteriseret. Dette skyldes til dels, at vagal ganglier, på trods af deres lille størrelse, udtrykker et bredt spektrum af receptorer, herunder et stort antal GPCRs8,11,12,13. Desuden er vagale afferent neuroner i sagens natur heterogene og viser forskellige molekylære profiler14. For at komplicere sagen er halspulsåren, petrosal og nodose ganglier fastgjort i musen og danner derved en enkelt ganglionic masse. Endelig er nodose ganglion i en delmængde af dyr knyttet til den sympatiske overlegne cervikal ganglion15.
Tidligere har efterforskere henvendt sig til immunohistochemistry for at studere den neurokemiske make-up af vagale afferent neuroner16,17,18. Mens immunohistochemistry ved hjælp af validerede antistoffer er nyttige, skal resultaterne af immunohistokemiske undersøgelser fortolkes med forsigtighed. For eksempel har talrige bestræbelser på at identificere specifikke antistoffer mod GPCR undladt19,20,21,22,23,24,25, førende efterforskere til at konkludere, at de fleste antistoffer mod GPCR er upålidelige. For at omgå disse spørgsmål er kvantitativ PCR (qPCR) blevet meget brugt til at vurdere genekspression i gnaverens vagale ganglionic masse26,27,28,29. Men, undersøgelse genekspression ved hjælp af qPCR sker på bekostning af et tab af rumlige oplysninger. Det kan især ikke forudsiges, hvor mange celler eller hvilken eller flere celletyper der udtrykker et bestemt interessegen (f.eks. nodose vs. halspulsårer). Tilbagevendende spørgsmål omfatter også forurening med tilstødende væv og inddragelse af variable længder af vagus nerve, overlegen cervikal, og halspulsåren ganglier under dissektion15. Som et resultat af ovenstående vanskeligheder, kontroverser omgiver udtryk og distribution af flere GPCRs i vagal afferent neuroner. Et særligt gådefuldt eksempel vedrører ghrelin receptor (Ghsr). Mens nogle undersøgelser har fundet udbredt udtryk for denne receptor i vagal afferent neuroner30,31,32, andre har fundet Ghsr mRNA at være næsten målbart i nodose ganglion11,14. En detaljeret kortlægning af Ghsr mRNA i den vagale ganglionic masse er derfor berettiget.
In situ hybridisering (ISH) er også blevet brugt til at vurdere genekspressionsmønstre i vagal ganglionic masse7,11,12,33,34,35. Fordi RNA-baserede teknikker forbliver mere pålidelige og specifikke end antistofbaserede teknikker under de fleste omstændigheder36,37, har ISH-undersøgelser vist sig værdifulde for bedre forståelse af den neurokemiske kodning af vagale afferent neuroner. Ikke desto mindre er traditionelle ISH-teknikker i sig selv ikke uden forbehold. Radioaktiv ish er følsom, men genererer baggrund og forbliver besværlig38. Ikke-radioaktiv ish er mindre kompliceret, men også mindre følsom38. I modsætning hertil er den nyligt udviklede RNAscope ISH-metode meget følsom og genererer minimal baggrund39. Den nuværende undersøgelse anvendt multiplex fluorescerende RNAscope til påvisning af GPCRs i vagal afferent neuroner af musen. Vi fokuserede på at kortlægge fordelingen af Ghsr og sammenlignede dens fordeling med fordelingen af cholecystokinin receptor (Cck1r), en anden GPCR kendt for at være udtrykt i nodose ganglion34. Endelig blev de to transskriptionsfaktorer, parret-lignende homeobox 2b (Phox2b) og PR domæne zink finger protein 12 (Prdm12), brugt som selektive markører for nodose og jugular afferent neuroner, henholdsvis14. Uden at visualisere Phox2b eller Prdm12, ville det være udfordrende at identificere jugular vs nodose afferents med sikkerhed. Potentielle tekniske faldgruber diskuteres også i hele artiklen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Mus, der blev anvendt i denne undersøgelse, var vilde hanner på en ren C57BL/6J-baggrund. I alt 4 mus blev brugt til multiplex ISH. Alle mus var ca. 8 uger gamle på tidspunktet for ofring. En hanmus (ca. et år gammel) blev også brugt til at demonstrere endogene fluorescens forbundet med aldring. Dyr blev anbragt i ventilerede bure i et barriereanlæg med ad libitum adgang til mad og vand. UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee gennemgik og godkendte de procedurer, der er beskrevet nedenfor. Detaljer om reagenser og værktøjer kan findes i materialetabellen.
1. Prøveindsamling
- På offerdagen skal du give musene en overdosis chloralhydrat (500 mg/kg, dvs. Gennemgå de dybt bedøvede mus transcardially ved hjælp af en peristaltisk pumpe med 5 mL 1x fosfat-buffered saltvand (PBS) efterfulgt af 50 mL af 10% formalin ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Dette gøres i en røghætte for at forhindre indånding af formalin. - Da nodose, petrosal og jugular ganglier er smeltet sammen til at danne en enkelt ganglionic masse i musen15, omhyggeligt indsamle hele vagal ganglionic masse fra hver side (venstre og højre) ved hjælp af en dissekering omfang og fine fjeder saks og sammenkrulninger (se tabellen af materialer).
- Når du halshugger musen med en saks (se materialebordet), skal du undgå at knuse hjernestammen.
- Efter en dissektionsmetode, der er beskrevet før i rotten40, skal du fjerne sternohyoid- og omohyoidmusklerne lateralt til luftrøret med små sammenkæd (Materialetabel) for at eksponere occipital knoglen. Ryd hele regionen af muskel, fedtvæv, og konjunktiv væv, indtil halspulsåren, vagus nerve, hypoglossal nerve, og foramen magnum er synlige. Skær hele hypoglossalnerven med lille fjedersaks(Materialetabel).
- Kig efter nodose ganglion som en gennemsigtig masse tæt på foramen magnum15. Brug lille saks (Tabel over materialer),omhyggeligt bryde occipital knoglen til yderligere at udsætte jugular ganglion. Kig efter sorte melanocytter på overfladen af halspulsåren som et visuelt vartegn.
- Skær nerve vedhæftede filer mellem vagal ganglionic masse og udtrække hele ganglionic masse ved forsigtigt at trække på den perifere ende af vagus nerve samtidig skære jugular ganglion mod hjernestammen med lille fjeder saks (Tabel af materialer).
- Fjern konjunktiv væv og fedt klæber til vagus nerve og ganglionic masse så meget som muligt.
- Da det er let at miste en ganglion under overførslen fra det ene rør til det andet, skal du holde ~ 0,5 cm af vagusnerven for at lette håndtering og lokalisering af prøver.
- Sæt ganglier ved hjælp af fine sammenkrammer i 1,5 mL mikrocentrifugrør og inkuber ved 4 °C i formalin i 24 timer og med 30% saccharose i yderligere 24 timer.
- Placer ganglier inde i et lille fald (~ 4 mm Ø) af optimal skæretemperatur (OKT) medium på et stykke aluminiumsfolie. Derefter fryses prøven på en seng tøris.
- Prøverne skæres med en kryostat ved -20 °C i sektioner med en tykkelse på 14 μm, og saml på glasmikroskoprutschebaner med 3 serie 42 μm fra hinanden.
BEMÆRK: Undgå at placere sektioner tæt på kanterne af diaset. For at redde reagenser skal vævssektionerne holdes så tæt pakket som muligt, men uden overlapning. - Prøverne opbevares i en fryser på -80 °C, indtil de er nødvendige for ISH i mindst 6 måneder.
BEMÆRK: Se figur 1 for fejlfinding af endogene fluorescens.
2. Forbehandling og ISH
- Før dagen for forsøgene, autoklave laboratorium glasvarer, der skal anvendes til ISH, herunder farvning opvask og vask buffer krukker.
BEMÆRK: Mens det ikke er kritisk at arbejde under RNase-friforhold, skal du altid bære handsker. Hold RNase dekontamineringsopløsningsflasker (Materialetabel) inden for rækkevidde, hvis der er mistanke om forurening. - På den første dag skal du bringe diasene til stuetemperatur på en bænk specielt dedikeret til ISH. Skyl rutsjebanerne i 1x PBS og bag dem i 30 minutter ved 60 °C i en bageovn (Materialebord).
- Post-fix dias i 4% formalin i 15 min ved 4 °C.
- Bring reagenserne i multiplexsættet(Materialetabel)til stuetemperatur.
- Dehydrere dias i 50%, 70% og 100% ethanol i 5 min hver. H2O2 opløsning på prøverne i 10 min og skyl derefter i dobbeltdestilleret vand (ddH2O).
- Forkæl prøverne med målbagegenset i 5 min, skyl i ddH2O efterfulgt af 100% ethanol og lufttørre. Ved hjælp af en hydrofob pen, skabe en barriere omkring prøverne.
BEMÆRK: Påfør ikke den hydrofobiske barriere for tæt på vævssektionerne. - Protease påføres protease i 30 min ved 40 °C i en hybridiseringsovn (Materialetabel).
- I mellemtiden skal sonderne afkøles ved 40 °C før krigen og afkøles ved stuetemperatur før brug. Inkuberes diasene med den ønskede kombination af målsonder (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; eller Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) i 2 timer ved 40 °C i en hybridiseringsovn.
- Inkuber negativt kontrolvæv med dihydrodipicolinatren (DapB) mål C1-sonde i 2 timer ved 40 °C i en hybridiseringsovn.
- Skyl lysbillederne i vaskebufferen, og opbevar natten over i 5x saltvandscitrat (SSC) ved stuetemperatur. For nemheds skyld, opdele eksperimentet i to dage. Den følgende dag skylles lysbillederne med vaskebufferen, og inkuber dem med forstærkningsreagenser, der er angivet nedenfor (se brugsanvisningen i Materialetabel).
- Påfør AMP1 (30 min ved 40 °C), AMP2 (30 min ved 40 °C) og AMP 3 (15 min ved 40 °C). Skyl i vaskebuffer mellem hvert trin.
- Opalfarvestofet opløses (Materialetabel)i dimethylsulfoxid, og opløsningerne opbevares ved 4 °C, indtil det er nødvendigt.
- For kanal 1 inkuberes diasene med HRP-C1 (15 min ved 40 °C) og Opal 520 (grøn farve; fortynding 1/1.500; 30 minutter ved 40 °C). Skyl i vaskebuffer mellem hvert trin.
- For kanal 2 inkuberes diasene med HRP-C2 (15 min ved 40 °C) og Opal 570 (gul farve; fortynding 1/1.500; i 30 min ved 40 °C). Skyl i vaskebuffer mellem hvert trin.
- For kanal 3 inkuberes diasene med HRP-C3 (15 min ved 40 °C) og Opal 690 (langt rød farve; fortynding 1/1.500; i 30 min ved 40 °C). Skyl i vaskebuffer mellem hvert trin.
- Vask dias og udsætte dem for 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for 30 s.
- Straks anvende montering medium på hver dias og placere en coverlip over vævssektionen.
- Hold vævene vandrette i en glideholder ved 4 °C, indtil det billeddannelser er.
3. Mikroskopi og dataanalyse
BEMÆRK: Multiplex ISH-data kan afbildes med en lang række instrumenter med de relevante filtre. En foretrukken billeddannelsesmetode er imidlertid konfokal mikroskopi med 20x og 63x (olie) mål; henvise til diskussionen af årsagerne. Der henvises til figur 2 for at finde det optimale signal-til-støj-forhold.
- Brug et konfokalt mikroskop udstyret med 488, 561 og 633 nm laserlinjer. Brug følgende anskaffelsesparametre (se tabel 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, detektionsområde 668-696 nm, effekt 2.0, gevinst 724); Opal 570 (DPSS laser 561 nm, detektionsområde 579-627 nm,
- For at forbedre kvaliteten af billederne, erhverve med en linje gennemsnit på 4 og en pixel størrelse på mindst 1024 x 1024.
BEMÆRK: Ovenstående parametre er kun angivet som et eksempel, og ændringer anbefales afhængigt af et instrument, forstørrelse (20x eller 63x), udtryksniveauer og endogene niveauer af fluorescens for et givet væv.- Når du er tilfreds med anskaffelsesparametrene, skal du indsamle billeder ved hjælp af de samme indstillinger. Tilskrive falske farver til hver kanal for at lette visualiseringen.
BEMÆRK: For eksempel rød (Phox2b eller Prdm12), cyan (Cck1r), gul (Ghsr) og grå (DAPI).- Udfør celletælling ved hjælp af de digitale billeder ved at identificere omridset af RNAscope-positive profiler med en kerne let farvet med DAPI. Beregn procentdelen af RNAscope-positive profiler, der udtrykker hver udskrift [Figur 3A-C].
- For at forbedre estimaternes stringens og nøjagtighed skal du tælle mindst 2.000 neuronale profiler fra mindst 4 forskellige dyr. Udfør optælling fra venstre og højre ganglier separat.
- Indtaste dataene i et cirkeldiagram med det samlede antal optalte profiler.
- Brug billedbehandlingssoftware til at hente billeder og sy 20x billeder sammen. Brug ImageJ-Fiji og en anden foto- og designsoftware til at generere de endelige plader. Anvend justeringer på kontrast og lethed ensartet på alle billeder.
- For at forbedre kvaliteten af billederne, erhverve med en linje gennemsnit på 4 og en pixel størrelse på mindst 1024 x 1024.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens RNAScope kan anvendes på dyr i alle aldre, køn eller genetisk baggrund, er det tilrådeligt at arbejde med unge voksne (<3 måneder gammel). Dette skyldes, at fluorescerende artefakter (f.eks lipofuscin) er almindelige fund i neuroner af ældre dyr41. De formalin-faste ganglier fra ældre mus indeholder ofte overraskende intens endogene fluorescens, der let kan forveksles med ægte farvning (Figur 1A,B). Under alle omstændigheder er det tilrådeligt at kontrollere niveauet af endogene fluorescens i vævet før forarbejdning.
Det er vigtigt at fastlægge optimale anskaffelsesparametre og signal-til-støj-forhold for hver laser og forstørrelse ved hjælp af sektioner fra et negativt kontrolvæv, der er inkuberet med DapB-negativsonden som vist i figur 2A, B. Fordi DapB er et prokaryote gen, RNAscope signaler bør være helt fraværende fra den negative kontrol væv. Bortset fra lejlighedsvise snavs og krystaller, ubetydelig fluorescens ses i billeder fra negative kontrolvæv, forudsat erhvervelse parametre anvendes er passende. Men over en vis laserkraft og gain begynder uønsket baggrund og tilfældige fluorescerende prikker at dukke op (Figur 2C). Et andet formål med at minimere laserkraft er at undgå pixelmætning og fotobleaching. Ingen større spørgsmål om fluorescens blegning blev observeret, når der arbejdes med ovenstående parametre. Hvis der kan opstå et sådant problem, er det tilrådeligt at dække vævet med et monteringsmedium til fluorescerende mærkede celler (Materialetabel) ud over at sænke lasereffekten så meget som muligt (se de anbefalede parametre i tabel 1).
RNAscope-teknikken blev anvendt til påvisning af 3 gener i vævsafsnit af musens vagale ganglionic masse (figur 3 og figur 4). En profil blev anset for positiv for Ghsr og/eller Cck1r, når henholdsvis gule og/eller cyanblå prikker blev set overlejre en profil fyldt med røde prikker (Figur 3A-C). Eksemplet i figur 3 viser mange profiler, der indeholder både Phox2b- og Cck1r-udskrifter (figur 3D). Phox2b blev brugt til at identificere nodose afferent neuroner. Rigelige Phox2b signaler akkumuleret i neuroner af nodose ganglion (Figur 4A,B). Cck1r-signaler blev detekteret i ca. 52 % af Phox2b-cellerne (Figur 4C). Bemærk, udtryksniveauer for Cck1r varierede meget mellem celler, lige fra moderat (~ 20 prikker pr profil) til intens mærkning (cytoplasme fyldt). I modsætning hertil var signalerne til Ghsr yderst sparsomme i nodose ganglion (Figur 4A,B). Kun anslået 0,65 % af phox2b-positive celler var også positive for Ghsr-udskrifter (figur 4C). Ghsr-udtrykkende celler ofte co-udtrykt Cck1r. En visuel undersøgelse af vævene afslørede ikke åbenlyse forskelle mellem venstre og højre ganglier. ISH-signaler var stort set fraværende fra områder uden neuroner (f.eks. epineurium og fiberkanal).
Prdm12 blev brugt til at identificere halspulsåren afferent neuroner. Som forventet var Prdm12-udtrykket højt beriget i jugular ganglionens neuroner og et par neuroner infiltrere rostraldelen af nodose ganglion (Figur 5A-C). Interessant nok blev Cck1r-signaler registreret i en delmængde af Prdm12-celler (Figur 5B, C). Lidt mindre end 9 % af Prdm12-positive neuroner udtrykte også Cck1r (figur 5D). Men den jugular ganglion indeholder kun celler med moderate niveauer af Cck1r (<20 prikker pr celler) snarere end stærkt mærket Cck1r-positive celler almindeligt forekommende i nodose ganglion. Ghsr-positive celler var betydeligt mere udbredt i halspulsåren end i nodose (Figur 5C). Ca. 3 % af Prdm12-cellerne var også Ghsr-positive (figur 5D). Interessant nok var 1% af alle Prdm12 co-udtrykt både Ghsr og Cck1r. Udtryksniveauer for Ghsr var altid moderate (<20 prikker pr. Celle). Ingen ISH-signaler kunne ses i områder blottet for neuroner.
Figur 1: Fejlfinding i forbindelse med spørgsmål om endogen fluorescens. (A, B) Endogen fluorescens i nodose/jugular ganglion af en aldrende mus (~ 1 år gammel). Digitale billeder blev erhvervet ved konfokal mikroskopi ved hjælp af laser linjer angivet i farver og erhvervelse parametre identisk med dem, der anvendes til multiplex ISH med yngre mus (se senere). Det er vigtigt, at det faste væv ikke blev behandlet på anden måde end at blive opbevaret ved -80 °C og udsat for DAPI. Som vist i A, et betydeligt niveau af uønsket fluorescens observeres i neuronale og ikke-neuronale celler, især når de udsættes for 488 nm laser (grøn). Dette er et almindeligt fund i histologi, som berettiger vurdering af endogene fluorescens før histologisk analyse. (B) Ved højere forstørrelse lignede fluorescens lipofuscinpigmenter, der ofte ophobes i aldrende celler og let kan forveksles med ægte immunreaktivitet og / eller RNAScope-signaler. Skalastænger = 158 μm (A) og 15 μm (B). (B). Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; NG = nodose ganglion; ISH = in situ hybridisering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bestemmelse af optimalt signal-til-støj-forhold. (A, B) Negativ kontrol bestående af RNAScope-detektion for prokaryotegen DapB. Bemærk, at endogene fluorescens i nodose ganglion af en ung voksen mus er minimal, og at inkubation med DapB sonden ikke resulterede i signaler. Anskaffelsesparametre var identiske med dem, der blev anvendt til multiplex ISH. Dette viser, at selve RNAScope-proceduren ikke giver nogen væsentlig baggrund, hvis anskaffelsesparametre vælges omhyggeligt. (C) Digitale billeder af det samme væv erhvervet ved stigende effekt laser og gevinst med 488 nm laser. Bemærk, hvordan nogle fuzzy grøn baggrund og lejlighedsvis prikker opstår over en bestemt laser magt og gevinst. Det er derfor vigtigt omhyggeligt at vælge erhvervelsesparametre for hver laser baseret på mængden af uspecifik fluorescens opnået i det negative kontrolvæv. Skalastænger = 158 μm (A) og 15 μm (B, C). Forkortelser: DapB = dihydrodipicolinat reduktase; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; NG = nodose ganglion; ISH = in situ hybridisering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Identifikation og optælling af positive profiler. (A) Repræsentativt digitalt billede af Phox2b-mærkede profiler (rød) i den rosenkranse del af nodose ganglion. I dette eksempel blev der identificeret i alt 18 mobilprofiler (mærket som 1 til 18). Bemærk, at DAPI farvning yderligere hjælper med at lokalisere neuroner, som typisk viste en stor og rund kerne med lys DAPI plet. I modsætning hertil er kernerne af ikke-neuronale celler stærkt mærket, langstrakt og mindre i størrelse. Samlet set er RNAScope-signalerne i overensstemmelse med fordelingen og formen af neuronale snarere end ikke-neuronale celler. (B) To mærket Ghsr-positive neuroner (gul) er vist (profil 19 og 20). Ghsr-signaler var sparsomme og vanskelige at se. Derfor blev letheden og mætningen af de gule signaler selektivt og ensartet forbedret i fotosoftware. (C) I alt ni Cck1r-mærkede profiler (cyan) er identificeret (mærket som 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 og 19). Bemærk, hvordan intensiteten af Cck1r signaler varierede meget mellem celler. For eksempel indeholder profil 11 kun et par positive signaler, mens profil 7 næsten er fyldt med Cck1r-signaler. (D) En flettet visning af alle kanaler gjorde det muligt at identificere colocalization mønstre. Mange Phox2b-positive profiler var også co-udtrykte Cck1r (f.eks. profil 2, 8 og 14), som det fremgår af røde og cyane RNAScope-prikker inden for samme cellulære profil. I modsætning hertil expressede Phox2b-positive profiler ikke Ghsr-udskrifter (profil 19 og 20). Men en Ghsr-positiv celle udtrykte også lave niveauer af Cck1r (profil 19). De to store DAPI-farvede kerner mærket med en hvid stjerne formentlig svarer til placeringen af Phox2b-negative afferent neuroner blottet for RNAScope signaler. I de repræsentative resultater, der er beskrevet nedenfor, blev mindst 2.000 neuronale profiler talt fra venstre og højre ganglionic masser fra 4 forskellige dyr. Skalastænger = 24 μm. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; Phox2b = parret-lignende homeobox 2b; Ghsr = ghrelin receptor; Cck1r = cholecystokinin receptor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative resultater af multiplex ISH i nodose afferent neuroner. Digitale billeder af en repræsentativ vagal ganglionic masse mærket med multiplex RNAscope for Phox2b, Cck1r, og Ghsr. Billeder blev erhvervet med 20x (A) og 63x (B, C)mål for en konfocal mikroskop (Zeiss LSM880). I A, 20× flere billeder blev syet sammen ved hjælp af Zen software og præsenteret som enten ublandet kanaler eller fusioneret. Phox2b signaler (rød) specielt akkumuleret i afferent neuroner placeret i nodose ganglion. Som forventet, Cck1r signaler (cyan) intenst mærket mange, men ikke alle, neuroner i nodose ganglion. Ved lav forstørrelse kunne celler, der udtrykker lave niveauer af Cck1r eller celler med Ghsr-signaler (gul), ikke observeres let. DAPI (grå) hjalp visualisere vævet og identificere vagal afferent neuroner med en stor og let farvet kerne. Den hvide inset i det flettede billede svarer til placeringen af billedet nedenfor. (B) Ved høj forstørrelse er Phox2b-positive profiler (rød) tydelige. Mange celler udtrykte også Cck1r, men på forskellige niveauer, lige fra moderat til meget høj. Profilen "1" er et eksempel på en Phox2b celle negativ for Cck1r og Ghsr. Profiler "2" og "3" er Phox2b celler med høje og moderate Cck1r signaler, henholdsvis. Moderate signaler til Ghsr (gul) blev lejlighedsvis set i rostral nodose ganglion, men næsten altid i celler negative for Phox2b, som vist med profil "4". Interessant nok udtrykte profil "4" både Ghsr og Cck1r. Som det fremgår af det næste tal, ghsr var mere rigelige i Prdm12 celler. (C) Cirkeldiagram, der opsummerer estimaterne for procentdelen af Phox2b-celler (rød), der sammen udtrykker enten Ghsr (gul), Cck1r (cyan) eller begge dele (grå). Det samlede antal optalte profiler er angivet ved siden af diagrammet (n=4 forskellige ganglier, venstre og højre kombineret). Resultater fra hver side blev samlet, fordi der ikke blev bemærket nogen forskelle. Skalastænger = 158 μm (A) og 15 μm (B). Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; NG = nodose ganglion; JG = jugular ganglion; ISH = in situ hybridisering; Phox2b = parret-lignende homeobox 2b; Ghsr = ghrelin receptor; Cck1r = cholecystokinin receptor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative resultater af halspulsåren afferent neuroner multiplex ISH. Digitale billeder af en repræsentativ vagal ganglionic masse mærket med multiplex RNAscope Prdm12, Cck1r, og Ghsr. Billeder blev erhvervet med 20x (A) og 63x (B, C)mål for en konfocal mikroskop (Zeiss LSM880). I A, 20× flere billeder blev syet sammen ved hjælp af Zen software og præsenteret som enten ublandet kanaler eller fusioneret. Prdm12 udskrift (rød) specielt akkumuleret i afferent neuroner placeret i jugular ganglion og kun et par neuroner infiltrere rostral del af nodose ganglion. Cck1r signaler (cyan) intenst mærket nodose ganglion. Ved lav forstørrelse kunne celler, der udtrykker lave niveauer af Cck1r eller celler med Ghsr-signaler (gul), ikke ses let. DAPI (grå) hjalp visualisere vævet og identificere vagal afferent neuroner med en stor og let farvet kerne. De to hvide insets i det flettede billede svarer til placeringen af billederne nedenfor. (B, C) Ved høj forstørrelse kan Prdm12-positive celleprofiler (rød) afgrænses. Moderate signaler til Cck1r blev også registreret i profilerne "1" og "2". Profil "3" er repræsentativ for Prdm12 celler negative for Cck1r eller Ghsr. I Cses Ghsr-signaler (gul) i repræsentativ profil "4", men ikke i "5". (D) Cirkeldiagram, der opsummerer estimaterne for procentdelen af Prdm12-celler (rød), der sammen udtrykker enten Ghsr (gul), Cck1r (cyan) eller begge (grå). Det samlede antal optalte profiler er angivet ved siden af diagrammet (n=4 forskellige ganglier, venstre og højre kombineret). Resultater fra hver side blev samlet, fordi der ikke blev bemærket nogen forskelle. Skalastænger = 158 μm (A) og 15 μm (B, C). Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; NG = nodose ganglion; JG = jugular ganglion; ISH = in situ hybridisering; Prdm12 = PR domæne zink finger protein 12; Phox2b = parret-lignende homeobox 2b; Ghsr = ghrelin receptor; Cck1r = cholecystokinin receptor. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Opal | Laserlinje | Registreringsområde | magt | vinde | Linjegennemsnit | Pixelstørrelse |
| Opal 690 | HeNe 633 nm | 668-696 nm | 2 | 724 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opal 570 | DPSS laser 561 nm | 579-627 nm | 15 | 450 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opal 520 | argon laser 488 nm | 499-535 nm | 6 | 830 | 4 | 1024 x 1024 |
| DAPI | diode laser 405 | 415-502 nm | 12 | 532 | 4 | 1024 x 1024 |
Tabel 1: Anskaffelsesparametre. Forkortelse: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken med ISH blev opfundet i slutningen af 1960'erne42. Det er dog først i midten af 1980'erne , at det blev ansøgt om påvisning af mRNAs i de centrale og periferenervesystemer 43,44. I betragtning af nervesystemets heterogenitet og tilbagevendende problemer med antistoffer forbliver lokalisering af en bestemt udskrift på cellulært niveau et uvurderligt værktøj. Ikke desto mindre er traditionelle ISH-metoder forblevet besværlige og variably følsomme. Heldigvis, denne undersøgelse ansat en meget følsom ISH procedure kaldet RNAscope, som normalt genererer ingen baggrund og tillader påvisning af flere udskrifter udtrykt på lave niveauer45,46. Specifikt blev multiplex fluorescerende RNAScope anvendt til samtidig påvisning af Ghsr- og Cck1r-udskrifterne. Transskription faktorer, Phox2b og Prdm12, blev yderligere brugt som selektive markører til at differentiere nodose og jugular afferent neuroner, henholdsvis. Uden at visualisere Phox2b og Prdm12, ville det være udfordrende at identificere jugular vs nodose afferent neuroner med sikkerhed. Som forklaret ovenfor omfatter et kritisk trin en konsekvent og korrekt dissektionsteknik. Derudover er verifikationen af endogene fluorescens også en vigtig faktor, da den let kan forveksles med RNAScope-signaler. Desuden anbefales det kraftigt at vælge passende anskaffelsesparametre baseret på negativt kontrolvæv. Som tidligere nævnt er konfokal mikroskopi den foretrukne billeddannelsesmetode med 20x og 63x (olie) mål, fordi 1) udskrifter udtrykt ved lave niveauer og / eller i sparsomme celler kan kun være mærkbar ved høj forstørrelse. 2) Confocal mikroskopi tillader indsamling af en enkelt fokal plan, hvilket er vigtigt i betragtning af, at to celler oven på hinanden fejlagtigt kan fremstå som en celle, når afbildet ved epifluorescence. 3) Confocal mikroskopi giver også mulighed for mere selektive og fleksible erhvervelse parametre. Ovenstående anskaffelsesparametre leveres kun som et eksempel, og modifikationer anbefales afhængigt af et instrument, forstørrelse (20x eller 63x), udtryksniveauer og endogene niveauer af fluorescens for et givet væv. Selve farvningsproceduren forblev meget tæt på den anbefalede protokol med kun små justeringer. Det er klart, at den protokol, der er beskrevet her, kan anvendes til påvisning af udskrifter, ikke kun GPCR'er. Den procedure , der er beskrevet her, er ikke desto mindre særlig nyttig i betragtning af de tilbagevendende problemer med antistoffer , der er rejst mod GPCR24.
Som tidligere diskuteret15, musen nodose ganglion er undertiden knyttet til den overlegne cervikal ganglion af en celle bro. Inddragelsen af denne cellebro kan føre til forvirrende resultater, f.eks. ikke-vagale markører, der opdages i nodose ganglionen. Efterforskeren ønsker måske systematisk at kontrollere, om nodose ganglion er knyttet til den overlegne cervikal ganglion under dissektion. Ellers vil inkonsekvent dissektion færdigheder mellem ganglier indføre eksperimentel variation. Det er også vigtigt at bemærke, at både petrosale og nodose afferent neuroner udtrykke Phox2b47. Således omfattede det, vi kaldte nodose afferent neuroner, både petrosale og nodose neuroner. Endelig bør man, når man sammenligner forskellige undersøgelser, huske på, at forskellige metoder til aktiv dødshjælp kan forårsage ændringer i genekspression48.
I teorien kan de fluorophorer, der anvendes til detektion, i flæng tilskrives enhver kanal. Men, Opal 690 viste sig at udsende et lavt niveau af grøn fluorescens. Under de fleste omstændigheder, i tilfælde af stærkt udtrykte udskrifter (f.eks Prdm12), uønsket grøn fluorescens blev set, hvis laser intensiteten var for høj. Opal 690 anbefales derfor til gener med moderat/lavt udtryk. Hvis det kun arbejder med stærkt udtrykte gener, anbefales det at fortynde Opal 690 yderligere (dvs. 1/3.000) og ikke fange uspecifik grøn fluorescens under billedopkøb. RNAscope-signaler er separate prikker i forskellige farver, selv når udskrifter udtrykkes inden for samme celleprofil. Men for stærkt udtrykte udskrifter, kan det ikke være muligt at se individuelle prikker, men snarere fluorescens fylde cytoplasma. Når prikker udsender fluorescens i forskellige farver, kan man overveje et problem med uspecifik fluorescens på grund af blandt andet utilstrækkelige erhvervelsesparametre og / eller endogene pigmenter. Endelig må Opal 570 og 620 ikke anvendes samtidigt, fordi deres emissionsspektre overlapper hinanden.
Hvis der ikke observeres RNAscope-signaler for et gen, der vides at være udtrykt i interessevævet, anbefales det at kontrollere vævets integritet ved at køre en positiv sonde til rådighed (dvs. peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B husholdningsgen). DAPI counterstaining er også nyttigt i fastsættelsen af vævskvalitet. DAPI-mærkede kerner, der ser strimlet ud, kan indikere overdreven fordøjelse eller forkert fast væv.
Som følge heraf blev Ghsr udtrykt i en lille delmængde af Prdm12-positive jugular afferent neuroner. I modsætning hertil, og i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse11, Ghsr mRNA var næsten fraværende fra nodose afferent neuroner. Det udledes , at lave niveauer af Ghsr mRNA, der tidligere blev opdaget af qPCR og ISH, sandsynligvis skyldtes halspulsåren afferent neuroner30,31,32. En tidligere calcium signalering undersøgelse viste, at 3% af kultiverede vagal afferent neuroner reagerer på ghrelin49, et tal, der er bemærkelsesværdigt svarer til den procentdel af Ghsr-udtrykke halspulsåren afferent neuroner. Cck1r blev udtrykt i mange Phox2b-positive nodose afferent neuroner og mere overraskende i en delmængde af Prdm12-positive halspulsåren afferent neuroner. Sammenfattende demonstrerer dette papir den vellykkede tilpasning af eksisterende ISH-teknikker til at vurdere den cellulære fordeling af udvalgte GPCR'er i jugular-nodose ganglionic masse i sin helhed.
Afslutningsvis blev multiplex ISH ansat til at opdage og samtidig visualisere udskrifterne for to GPCR'er (Cck1r og Ghsr) og en transskriptionsfaktor (Phox2b eller Prdm12) i hele vagal ganglionic komplekset af den voksne mus. Protokollen beskrevet her kan være et supplerende værktøj til RNA-Sekventering, qPCR, og traditionel histologi. Denne protokol kan dog anvendes på andre ganglier af samme størrelse. Som beskrevet ovenfor er erhvervelsesparametre, dyrs alder og konsistens af dissektion vigtige faktorer at overveje under eksperimentelt design. Derfor kan det tilbyde unik information om de topografiske genekspressionsmønstre i en meget heterogen og lille ganglion. Denne protokol kan bruges til at bestemme ændringer i de transskriptionelle profiler af jugular vs nodose afferent neuroner i forbindelse med forskellige fysiologiske og patofysiologiske tilstande, herunder, men ikke begrænset til, ændringer i fodringsstatus. Det kan også bruges til at sammenligne den neurokemiske make-up af vagale afferent neuroner i dyrearter, der almindeligvis anvendes i præklinisk forskning, herunder primater og svin50,51.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Neuroanatomi / Histology / Brain Injection Core finansieret af NIH tilskud #5P01DK119130-02. Forfatterne vil gerne anerkende bistand fra UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (ledet af Dr. Phelps) og dets personale (Abhijit Bugde og Marcel Mettlen), støttet delvist af NIH Grant #1S10OD021684-01, en fælles ressource af Harold C. Simmons Cancer Center, delvist støttet af en NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
References
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
