Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Påvisning av G Protein-koblet reseptoruttrykk i mus Vagal Afferent Neurons ved hjelp av Multiplex In Situ Hybridization

Published: September 20, 2021 doi: 10.3791/62945
Automatic Translation
1, 1
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

Summary

Multiplex in situ hybridisering (ISH) ble brukt til samtidig å visualisere transkripsjonene for to G protein-koblede reseptorer og en transkripsjonsfaktor i hele vagal ganglionic komplekset av den voksne musen. Denne protokollen kan brukes til å generere nøyaktige kart over transkripsjonsprofilene til vagal afferent nevroner.

Abstract

Denne studien beskriver en protokoll for multiplex in situ hybridisering (ISH) av musen jugular-nodose ganglia, med særlig vekt på å oppdage uttrykket av G protein-koblede reseptorer (GPCRs). Formalin-fast jugular-nodose ganglia ble behandlet med RNAscope-teknologien for samtidig å oppdage uttrykket av to representative GPCRs (cholecystokinin og ghrelinreseptorer) i kombinasjon med ett markørgen av enten nodose (parret-lignende homeobox 2b, Phox2b) eller jugular afferent neuroner (PR-domene sink finger protein 12, Prdm12). Merket ganglia ble avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi for å bestemme fordelings- og uttrykksmønstrene til de nevnte transkripsjonene. Kort sagt, Phox2b afferent nevroner ble funnet å rikelig uttrykke cholecystokinin reseptoren (Cck1r), men ikke ghrelin reseptoren (Ghsr). En liten undergruppe av Prdm12 afferent neuroner ble også funnet å uttrykke Ghsr og / eller Cck1r. Potensielle tekniske advarsler i design, behandling og tolkning av multiplex ISH diskuteres. Tilnærmingen beskrevet i denne artikkelen kan hjelpe forskere med å generere nøyaktige kart over transkripsjonsprofilene til vagal afferent nevroner.

Introduction

Cellelegemene til vagal afferents finnes i jugular, petrosal og nodose ganglia1,2,3. Deres axoner reiser sammen via flere grener av vagusnerven til kraniocervical, thoracic og abdominal territorier4,5,6,7. Fra deres viscerale avslutninger kan vagal afferents reagere på et bredt spekter av fysiologiske og skadelige stimuli8,9,10. Fordelingen av signalmolekyler og reseptorer involvert i vagal sensing er imidlertid fortsatt dårlig karakterisert. Dette skyldes delvis at vagal ganglia, til tross for sin lille størrelse, uttrykker et bredt spekter av reseptorer, inkludert et stort antall GPCRs8,11,12,13. Videre er vagal afferent nevroner iboende heterogene og viser distinkte molekylære profiler14. For å komplisere saken er jugularet, petrosal og nodose ganglia festet i musen, og danner dermed en enkelt gangionisk masse. Til slutt, i en undergruppe av dyr, er nodose ganglion festet til den sympatiske overlegne Cervical ganglion15.

Tidligere har etterforskere vendt seg til immunhiistokjemi for å studere den nevrokjemiske sminken av vagal afferent nevroner16,17,18. Mens immunhiistokjemi ved hjelp av validerte antistoffer er nyttig, må resultatene av immunhiistokjemiske studier tolkes med forsiktighet. For eksempel har mange anstrengelser for å identifisere spesifikke antistoffer mot GPCRs mislyktes19,20,21,22,23,24,25, noe som fører til at etterforskere konkluderer med at flertallet av antistoffer mot GPCRs er upålitelige. For å omgå disse problemene har kvantitativ PCR (qPCR) blitt mye brukt til å vurdere genuttrykk i gnager vagal ganglionic mass26,27,28,29. Imidlertid skjer undersøkelse av genuttrykk ved hjelp av qPCR på bekostning av tap av romlig informasjon. Spesielt kan det ikke forutsies hvor mange celler eller hvilke celletyper som uttrykker et bestemt gen av interesse (f.eks. nodose vs. jugularceller). Tilbakevendende problemer inkluderer også forurensning med tilstøtende vev og inkludering av variable lengder av vagusnerven, overlegen cervical og jugular ganglia under disseksjon15. Som et resultat av de ovennevnte vanskelighetene omgir kontroverser uttrykket og distribusjonen av flere GPCRs i vagal afferent nevroner. Et spesielt forvirrende eksempel er ghrelinreseptoren (Ghsr). Mens noen studier har funnet utbredt uttrykk for denne reseptoren i vagal afferent nevroner30,31,32, andre har funnet Ghsr mRNA å være nesten uoppdagelig i nodose ganglion11,14. Detaljert kartlegging av Ghsr mRNA i vagal ganglionic mass er derfor berettiget.

In situ hybridisering (ISH) har også blitt brukt til å vurdere genuttrykksmønstre i vagal ganglionic mass7,11,12,33,34,35. Fordi RNA-baserte teknikker forblir mer pålitelige og spesifikke enn antistoffbaserte teknikker under de fleste omstendigheter36,37, har ISH-studier vist seg verdifulle for bedre forståelse av nevrokjemisk koding av vagal afferent nevroner. Likevel er tradisjonelle ISH-teknikker i seg selv ikke uten forbehold. Radioaktiv ISH er følsom, men genererer bakgrunn og forblir tungvint38. Ikke-radioaktiv ISH er mindre komplisert, men også mindre følsom38. Derimot er den nylig utviklede RNAscope ISH-metoden svært følsom og genererer minimal bakgrunn39. Den nåværende studien anvendte multipleks fluorescerende RNAscope til påvisning av GPCRs i vagal afferent neuroner av musen. Vi fokuserte på å kartlegge fordelingen av Ghsr og sammenlignet distribusjonen med kolecystokininreseptoren (Cck1r), en annen GPCR kjent for å bli uttrykt i nodose ganglion34. Til slutt ble de to transkripsjonsfaktorene, parret-lignende homeobox 2b (Phox2b) og PR-domene sinkfingerprotein 12 (Prdm12), brukt som selektive markører for henholdsvis nodose og jugular afferent neuroner, henholdsvis14. Uten å visualisere Phox2b eller Prdm12, ville det være utfordrende å identifisere jugular vs. nodose afferents med sikkerhet. Potensielle tekniske fallgruver diskuteres også gjennom hele artikkelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Mus som ble brukt i denne studien var menn av vill type på ren C57BL/6J-bakgrunn. Totalt 4 mus ble brukt til multipleks ISH. Alle mus var omtrent 8 uker gamle på offertidspunktet. En mannlig mus (ca. ett år gammel) ble også brukt til å demonstrere endogen fluorescens forbundet med aldring. Dyr ble plassert i ventilerte merder i et barriereanlegg med ad libitum tilgang til mat og vann. UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee gjennomgikk og godkjente prosedyrene beskrevet nedenfor. Detaljer om reagenser og verktøy finner du i Materiallisten.

1. Eksempelsamling

  1. På offerdagen, administrer en overdose klorhydrat (500 mg / kg, dvs.) til musene. Perfuse de dypt bedøvede musene transkardialt ved hjelp av en peristaltisk pumpe med 5 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) etterfulgt av 50 ml 10% formalin ved romtemperatur.
    MERK: Dette gjøres i en avtrekkshette for å forhindre innånding av formalin.
  2. Som nodose, petrosal og jugular ganglia er smeltet sammen for å danne en enkelt gangionisk masse i musen15, samle nøye hele vagal ganglionic massen fra hver side (venstre og høyre) ved hjelp av et dissekerende omfang og fine vår saks og tang (se materialtabellen).
  3. Når du halshugger musen med et par store saks (se materialtabellen), unngå å knuse hjernestammen.
  4. Etter en disseksjon tilnærming beskrevet før i rotte40, fjern sternohyoid og omohyoid muskler lateral til luftrøret med små tang (Tabell over materialer) for å eksponere occipital bein. Fjern hele regionen av muskel, fettvev og konjunktivt vev til halspulsåren, vagusnerven, hypoglossalnerven og foramen magnum er synlige. Klipp hele hypoglossalnerven med liten vårsaks (Tabell over materialer).
  5. Se etter nodose ganglion som en gjennomsiktig masse nær foramen magnum15. Bruk liten saks (Materialbord), bryt forsiktig oksipitalbenet for å eksponere jugular ganglion ytterligere. Se etter svarte melanocytter på overflaten av jugularet som et visuelt landemerke.
  6. Klipp nervefester mellom vagal ganglionic massen og trekk ut hele ganglionic massen ved å forsiktig trekke på den perifere enden av vagusnerven samtidig som du kutter jugular ganglion mot hjernestammen med liten vårsaks (Tabell over materialer).
  7. Fjern konjunktivt vev og fett som stikker til vagusnerven og ganglionmassen så mye som mulig.
  8. Da det er lett å miste en ganglion under overføringen fra det ene røret til det andre, hold ~ 0,5 cm av vagusnerven for å lette håndtering og lokalisering av prøver.
  9. Plasser ganglia ved hjelp av fine tang i 1,5 ml mikrosenterrør og inkuber ved 4 °C i formalin i 24 timer og med 30 % sukrose i ytterligere 24 timer.
  10. Plasser ganglia inne i et lite fall (~ 4 mm Ø) med optimal skjæretemperatur (OCT) medium på et stykke aluminiumsfolie. Deretter fryser du prøven på en seng med tørris.
  11. Klipp prøvene med en kryostat ved -20 °C i seksjoner med 14 μm tykkelse og samle på glassmikroskop glir som 3-serie 42 μm fra hverandre.
    MERK: Unngå å plassere seksjoner nær kantene på lysbildet. For å redde reagenser, hold vevsdelene så tett pakket som mulig, men uten overlapping.
  12. Oppbevar prøvene i en -80 °C fryser til det er nødvendig for ISH i minst 6 måneder.
    MERK: Se figur 1 for feilsøking for endogen fluorescens.

2. Forbehandling og ISH

  1. Før dagen for forsøkene, autoklave laboratorieglass som skal brukes til ISH, inkludert farging retter og vask buffer krukker.
    MERK: Selv om det ikke er viktig å arbeide under RNase-frie forhold, bruk hansker til enhver tid. Oppbevar RNase-dekontamineringsløsningsflasker (Materialliste) innen rekkevidde i tilfelle forurensning mistenkes.
  2. På den første dagen, ta lysbildene til romtemperatur på en benk spesielt dedikert til ISH. Skyll lysbildene i 1x PBS og stek dem i 30 minutter ved 60 °C i en stekeovn (Materialbord).
  3. Etterfiks lysbildene i 4% formalin i 15 min ved 4 °C.
  4. Ta reagensene i multiplekssettet (Materialbord) til romtemperatur.
  5. Dehydrer lysbildene i 50%, 70% og 100% etanol i 5 min hver. Påfør H2O2 oppløsning på prøvene i 10 min og skyll deretter i dobbeltdestillert vann (ddH2O).
  6. Behandle prøvene med målgjenvinningsreagenset i 5 min, skyll i ddH2O etterfulgt av 100% etanol og lufttørk. Bruk en hydrofob penn, lag en barriere rundt prøvene.
    MERK: Ikke bruk den hydrofobe barrieren for nær vevsdelene.
  7. Påfør protease i 30 min ved 40 °C i en hybridiseringsovn (Materialbord).
  8. I mellomtiden, prewarm sondene ved 40 °C og avkjøl dem ved romtemperatur før bruk. Inkuber lysbildene med ønsket kombinasjon av målsonder (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; eller Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) i 2 timer ved 40 °C i en hybridiseringsovn.
  9. Inkuber negativt kontrollvev med dihydrodipicolinate reduktase (DapB) mål C1-sonde i 2 timer ved 40 °C i en hybridiseringsovn.
  10. Skyll lysbildene i vaskebufferen og oppbevar dem over natten i 5x saltvannsnatriumsitrat (SSC) ved romtemperatur. For enkelhets skyld, del eksperimentet i to dager. Påfølgende dag skyll lysbildene med vaskebuffer og inkuber dem med forsterkningsreagenser som er oppført nedenfor (se bruksanvisningen i Materialfortegnelse).
  11. Påfør AMP1 (30 min ved 40 °C), AMP2 (30 min ved 40 °C) og AMP 3 (15 min ved 40 °C). Skyll i vaskebufferen mellom hvert trinn.
  12. Løs opp hvert Opal fargestoff (Materialbord) i dimetylsulfoksid og oppbevar løsningene ved 4 °C til det er nødvendig.
  13. For kanal 1, inkuber lysbildene med HRP-C1 (15 min ved 40 °C) og Opal 520 (grønn farge; fortynning 1/1500; 30 min ved 40 °C). Skyll i vaskebufferen mellom hvert trinn.
  14. For kanal 2, inkuber lysbildene med HRP-C2 (15 min ved 40 °C) og Opal 570 (gul farge; fortynning 1/1500; i 30 min ved 40 °C). Skyll i vaskebufferen mellom hvert trinn.
  15. For kanal 3, inkuber lysbildene med HRP-C3 (15 min ved 40 °C) og Opal 690 (langt rød farge; fortynning 1/1500; i 30 min ved 40 °C). Skyll i vaskebufferen mellom hvert trinn.
  16. Vask lysbildene og eksponer dem for 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) i 30 s.
  17. Påfør umiddelbart monteringsmedium på hvert lysbilde og legg en deksleslip over vevsdelen.
  18. Hold vevet horisontalt i en skyveholder ved 4 °C til avbildning.

3. Mikroskopi og dataanalyse

MERK: Multiplex ISH-data kan avbildes med et bredt spekter av instrumenter med de aktuelle filtrene. En foretrukket bildemetode er imidlertid konfokal mikroskopi med mål på 20x og 63x (olje). se diskusjonen av årsakene. Se figur 2 for fastsettelse av det optimale signal-til-støy-forholdet.

  1. Bruk et konfokalt mikroskop utstyrt med 488, 561 og 633 nm laserlinjer. Bruk følgende anskaffelsesparametere (se tabell 1): Opal 690 (HeNe 633 nm, deteksjonsområde 668-696 nm, effekt 2.0, gevinst 724); Opal 570 (DPSS laser 561 nm, deteksjonsområde 579-627 nm,
  2. For å forbedre kvaliteten på bildene, skaff deg med en linjegjennomsnitt på 4 og en pikselstørrelse på minst 1024 x 1024.
    MERK: Parameterne ovenfor er bare gitt som et eksempel, og modifikasjoner anbefales avhengig av ett instrument, forstørrelse (20x eller 63x), uttrykksnivåer og endogene nivåer av fluorescens for et gitt vev.
  3. Når du er fornøyd med anskaffelsesparametrene, samler du inn bilder med de samme innstillingene. Tilskrive falske farger til hver kanal for å gjøre det enklere å visualisere.
    MERK: For eksempel rød (Phox2b eller Prdm12), cyan (Cck1r), gul (Ghsr) og grå (DAPI).
  4. Utfør celletelling ved hjelp av de digitale bildene ved å identifisere omrisset av RNAscope-positive profiler med en kjerne lett farget med DAPI. Beregn prosentandelen av RNAscope-positive profiler som uttrykker hver transkripsjon [Figur 3A-C].
  5. For å forbedre strengheten og nøyaktigheten av estimatene, tell minst 2000 nevronprofiler fra minst 4 forskjellige dyr. Utfør telling fra venstre og høyre ganglia separat.
  6. Skriv inn dataene i et sektordiagram med totalt antall opptelte profiler.
  7. Bruk bildebehandling programvare for å skaffe bilder og sy sammen 20x bilder. Bruk ImageJ-Fiji og en annen foto- og designprogramvare for å generere de endelige platene. Bruk justeringer på kontrast og lyshet jevnt på alle bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mens RNAScope kan brukes på dyr i alle aldre, kjønn eller genetisk bakgrunn, er det tilrådelig å jobbe med unge voksne (<3 måneder gammel). Dette er fordi fluorescerende artefakter (f.eks. lipofuscin) er vanlige funn hos nevroner av eldre dyr41. Den formalin-faste ganglia fra eldre mus inneholder ofte overraskende intens endogen fluorescens som lett kan forveksles med ekte farging (Figur 1A, B). I alle fall er det tilrådelig å verifisere nivåene av endogen fluorescens i vevet før behandling.

Det er viktig å bestemme optimale anskaffelsesparametere og signal-til-støy-forhold for hver laser og forstørrelse ved hjelp av seksjoner fra et negativt kontrollvev inkubert med DapB negativ sonde som vist i figur 2A,B. Fordi DapB er et prokaryotisk gen, bør RNAscope-signaler være helt fraværende fra det negative kontrollvevet. Bortsett fra sporadisk rusk og krystaller, er ubetydelig fluorescens sett på bilder fra negativt kontrollvev, forutsatt at oppkjøpsparametrene brukes er passende. Men over en viss laserkraft og forsterkning begynner uønsket bakgrunn og tilfeldige fluorescerende prikker å dukke opp (Figur 2C). Et annet formål med å minimere laserkraft er å unngå pikselmetning og fotobleaching. Ingen store problemer med fluorescensbleking ble observert når du arbeider med de ovennevnte parametrene. Hvis et slikt problem kan oppstå, anbefales det å dekke vevet med et monteringsmedium for fluorescerende merkede celler (Materialliste) i tillegg til å senke laserkraften så mye som mulig (se de anbefalte parametrene i tabell 1).

RNAscope-teknikken ble brukt til påvisning av 3 gener i vevsseksjoner av musens vagale ganglionic masse (figur 3 og figur 4). En profil ble ansett som positiv for Ghsr og/eller Cck1r når henholdsvis gule og/eller cyan prikker ble sett over én profil fylt med røde prikker (Figur 3A-C). Eksemplet gitt i figur 3 viser mange profiler som inneholder både Phox2b- og Cck1r-transkripsjoner (Figur 3D). Phox2b ble brukt til å identifisere nodose afferent nevroner. Rikelige Phox2b-signaler akkumulert i nevronene i nodose ganglion (Figur 4A, B). Cck1r-signaler ble påvist i ca. 52 % av Phox2b-cellene (figur 4C). Vær oppmerksom på at uttrykksnivåene for Cck1r varierte sterkt mellom celler, alt fra moderate (~ 20 prikker per profil) til intens merking (cytoplasma fylt). Derimot var signalene for Ghsr ekstremt sparsommelige i nodose ganglion (Figur 4A,B). Bare anslagsvis 0,65% av Phox2b-positive celler var også positive for Ghsr transkripsjoner (Figur 4C). Ghsr-uttrykkende celler ofte co-uttrykt Cck1r. En visuell undersøkelse av vevet avslørte ikke åpenbare forskjeller mellom venstre og høyre ganglia. ISH-signaler var tilnærmet fraværende fra områder uten nevroner (f.eks. epineurium og fiberkanal).

Prdm12 ble brukt til å identifisere jugulære afferente nevroner. Som forventet ble Prdm12-uttrykket sterkt beriket i nevronene i jugulær ganglion og noen få nevroner som infiltrerte rostraldelen av nodose ganglion (Figur 5A-C). Interessant nok ble Cck1r-signaler oppdaget i et delsett av Prdm12-celler (Figur 5B,C). Litt mindre enn 9% av Prdm12-positive nevroner uttrykte også Cck1r (Figur 5D). Imidlertid inneholder jugular ganglion bare celler med moderate nivåer av Cck1r (<20 prikker per celler) i stedet for de sterkt merkede Cck1r-positive cellene som vanligvis finnes i nodose ganglion. Ghsr-positive celler var betydelig mer utbredt i jugularet enn i nodose (Figur 5C). Omtrent 3% av Prdm12-cellene var også Ghsr-positive (Figur 5D). Interessant nok var 1% av alle Prdm12 co-uttrykte både Ghsr og Cck1r. Expression nivåer for Ghsr var alltid moderat (<20 prikker per celle). Ingen ISH-signaler kunne sees i områder uten nevroner.

Figure 1
Figur 1: Feilsøking av problemer med endogen fluorescens. (A, B) Endogen fluorescens i nodose/jugular ganglion av en aldrende mus (~1 år gammel). Digitale bilder ble anskaffet ved konfokal mikroskopi ved hjelp av laserlinjene angitt i farger og oppkjøpsparametere som er identiske med de som brukes til multipleks ISH med yngre mus (se senere). Det er viktig at det faste vevet ikke ble behandlet på noen annen måte enn å bli lagret ved -80 °C og eksponert for DAPI. Som vist i A, observeres et betydelig nivå av uønsket fluorescens i nevronale og ikke-nevronale celler, spesielt når de utsettes for 488 nm laser (grønn). Dette er et vanlig funn i histologi, som garanterer å vurdere endogen fluorescens før histologisk analyse. (B) Ved høyere forstørrelse lignet fluorescens lipofuscinpigmenter som ofte akkumuleres i aldrende celler og lett kan forveksles med ekte immunoreaktivitet og / eller RNAScope-signaler. Skalastenger = 158 μm (A) og 15 μm (B). (B). Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; NG = nodose ganglion; ISH = in situ hybridisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bestemme optimalt signal-til-støy-forhold. (A, B) Negativ kontroll som består av RNAScope-deteksjon for det prokaryote genet DapB. Legg merke til at endogen fluorescens i nodose ganglion av en ung voksen mus er minimal, og at inkubasjon med DapB-sonden ikke resulterte i signaler. Anskaffelsesparametere var identiske med parameterne som ble brukt for multipleks ISH. Dette viser at selve RNAScope-prosedyren ikke gir noen betydelig bakgrunn hvis anskaffelsesparametere velges nøye. (C) Digitale bilder av samme vev ervervet ved å øke kraftlaseren og få tak i 488 nm laser. Legg merke til hvordan noen uklare grønne bakgrunner og sporadiske prikker oppstår over en viss laserkraft og gevinst. Dermed er det viktig å nøye velge oppkjøpsparametere for hver laser basert på mengden uspesifisert fluorescens oppnådd i det negative kontrollvevet. Skalastenger = 158 μm (A) og 15 μm (B, C). Forkortelser: DapB = dihydrodipicolinate reduktase; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; NG = nodose ganglion; ISH = in situ hybridisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Identifikasjon og telling av positive profiler. (A) Representativt digitalt bilde av Phox2b-merkede profiler (rød) i rostraldelen av nodose ganglion. I dette eksemplet ble totalt 18 mobilprofiler (merket som 1 til 18) identifisert. Vær oppmerksom på at DAPI-farging ytterligere hjelper til med å lokalisere nevroner, som vanligvis viste en stor og rund kjerne med lys DAPI-flekk. I motsetning er kjernen av ikke-nevronale celler sterkt merket, langstrakt og mindre i størrelse. Totalt sett samsvarte RNAScope-signalene med fordelingen og formen på nevronale i stedet for ikke-nevronale celler. (B) To merkede Ghsr-positive nevroner (gul) vises (profiler 19 og 20). Ghsr-signalene var sparsomme og vanskelige å se. Derfor ble lysheten og metningen av de gule signalene selektivt og jevnt forbedret i fotoprogramvare. (C) Totalt ni Cck1r-merkede profiler (cyan) identifiseres (merket som 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 og 19). Legg merke til hvordan intensiteten til Cck1r-signaler varierte sterkt mellom cellene. For eksempel inneholder profil 11 bare noen få positive signaler, mens profil 7 nesten er fylt med Cck1r-signaler. (D) En sammenslått visning av alle kanaler tillot identifisering av colokaliseringsmønstre. Mange Phox2b-positive profiler var også med-uttrykte Cck1r (f.eks. profiler 2, 8 og 14), som det fremgår av røde og cyan RNAScope prikker innenfor samme mobilprofil. Phox2b-positive profiler uttrykte derimot ikke Ghsr-transkripsjoner (profil 19 og 20). Imidlertid uttrykte en Ghsr-positiv celle også lave nivåer av Cck1r (profil 19). De to store DAPI-fargede kjernene merket med en hvit stjerne tilsvarer antagelig plasseringen av Phox2b-negative afferente nevroner blottet for RNAScope-signaler. I de representative resultatene beskrevet nedenfor ble minst 2000 nevronprofiler talt fra venstre og høyre gangioniske masser fra 4 forskjellige dyr. Skalastenger = 24 μm. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; Phox2b = parret-lignende homeobox 2b; Ghsr = ghrelin reseptor; Cck1r = cholecystokininreseptor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater av multipleks ISH i nodose afferent neuroner. Digitale bilder av en representativ vagal ganglionic masse merket med multiplex RNAscope for Phox2b, Cck1r og Ghsr. Bilder ble anskaffet med 20x (A) og 63x (B, C) mål for et konfokalt mikroskop (Zeiss LSM880). I A,20× ble flere bilder sydd sammen ved hjelp av Zen-programvaren og presentert som enten umiksede kanaler eller slått sammen. Phox2b-signaler (rød) spesielt akkumulert i afferente nevroner som ligger i nodose ganglion. Som forventet merket Cck1r signaler (cyan) intenst mange, men ikke alle, nevroner i nodose ganglion. Ved lav forstørrelse kunne celler som uttrykker lave nivåer av Cck1r eller celler med Ghsr-signaler (gul) ikke observeres lett. DAPI (grå) bidro til å visualisere vevet og identifisere vagal afferent nevroner med en stor og lett farget kjerne. Det hvite innsettet i det sammenslåtte bildet tilsvarer plasseringen av bildet som er inkludert nedenfor. (B) Ved høy forstørrelse er Phox2b-positive profiler (røde) tydelige. Mange celler uttrykte også Cck1r, men på forskjellige nivåer, alt fra moderat til svært høy. Profilen "1" er et eksempel på en Phox2b celle negativ for Cck1r og Ghsr. Profiler "2" og "3" er Phox2b celler med henholdsvis høye og moderate Cck1r-signaler. Moderate signaler for Ghsr (gul) ble av og til sett i rostral nodose ganglion, men nesten alltid i celler negative for Phox2b, som vist med profil "4". Interessant nok uttrykte profil "4" både Ghsr og Cck1r. Som vist i neste figur var Ghsr mer rikelig i Prdm12-celler. (C) Sektordiagram som oppsummerer estimatene for prosentandelen av Phox2b-celler (rød) som uttrykker enten Ghsr (gul), Cck1r (cyan) eller begge deler (grå). Totalt antall talte profiler angis ved siden av diagrammet (n=4 forskjellige ganglia, venstre og høyre kombinert). Resultatene fra hver side ble samlet fordi ingen forskjeller ble lagt merke til. Skalastenger = 158 μm (A) og 15 μm (B). Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; NG = nodose ganglion; JG = jugular ganglion; ISH = in situ hybridisering; Phox2b = parret-lignende homeobox 2b; Ghsr = ghrelin reseptor; Cck1r = cholecystokininreseptor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater av jugulære afferente nevroner multipleks ISH. Digitale bilder av en representativ vagal ganglionic masse merket med multiplex RNAscope Prdm12, Cck1r og Ghsr. Bilder ble anskaffet med 20x (A) og 63x (B, C) mål for et konfokalt mikroskop (Zeiss LSM880). I A,20× ble flere bilder sydd sammen ved hjelp av Zen-programvaren og presentert som enten umiksede kanaler eller slått sammen. Prdm12 transkripsjon (rød) spesielt akkumulert i afferent nevroner ligger i jugular ganglion og bare noen få nevroner infiltrere rostral del av nodose ganglion. Cck1r-signaler (cyan) merket intenst nodose ganglion. Ved lav forstørrelse kunne ikke celler som uttrykker lave nivåer av Cck1r eller noen celler med Ghsr-signaler (gul) ses lett. DAPI (grå) bidro til å visualisere vevet og identifisere vagal afferent nevroner med en stor og lett farget kjerne. De to hvite rammesettene i det sammenslåtte bildet tilsvarer plasseringen av bildene som er inkludert nedenfor. (B, C) Ved høy forstørrelse kan Prdm12-positive celleprofiler (rød) avgrenses. Moderate signaler for Cck1r ble også oppdaget i profilene "1" og "2". Profil "3" er representativ for Prdm12 celler negativ for Cck1r eller Ghsr. I Cvises Ghsr-signaler (gul) i representativ profil "4", men ikke i "5". (D) Sektordiagram som oppsummerer estimatene for prosentandelen av Prdm12-celler (rød) som uttrykker enten Ghsr (gul), Cck1r (cyan) eller begge deler (grå). Totalt antall talte profiler angis ved siden av diagrammet (n=4 forskjellige ganglia, venstre og høyre kombinert). Resultatene fra hver side ble samlet fordi ingen forskjeller ble lagt merke til. Skalastenger = 158 μm (A) og 15 μm (B, C). Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; NG = nodose ganglion; JG = jugular ganglion; ISH = in situ hybridisering; Prdm12 = PR-domene sinkfingerprotein 12; Phox2b = parret-lignende homeobox 2b; Ghsr = ghrelin reseptor; Cck1r = cholecystokininreseptor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Opal Laserlinje Deteksjonsområde kraft vinne Linjegjennomsnitt Pikselstørrelse
Opal 690 HeNe 633 nm 668-696 nm 2 724 4 1024 x 1024
Opal 570 DPSS laser 561 nm 579-627 nm 15 450 4 1024 x 1024
Opal 520 argon laser 488 nm 499-535 nm 6 830 4 1024 x 1024
DAPI diode laser 405 415-502 nm 12 532 4 1024 x 1024

Tabell 1: Parametere for anskaffelse. Forkortelse: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Teknikken til ISH ble oppfunnet på slutten av 1960-tallet42. Det er imidlertid ikke før på midten av 1980-tallet at det ble brukt til påvisning av mRNAer i de sentrale og perifere nervesystemene43,44. Tatt i betraktning nervesystemets heterogenitet og tilbakevendende problemer med antistoffer, er lokalisering av en bestemt transkripsjon på cellenivå fortsatt et uvurderlig verktøy. Likevel har tradisjonelle ISH-metoder forblitt arbeidskrevende og variably følsomme. Heldigvis brukte denne studien en svært følsom ISH-prosedyre kalt RNAscope, som vanligvis ikke genererer noen bakgrunn og tillater deteksjon av flere transkripsjoner uttrykt på lave nivåer45,46. Nærmere bestemt ble multipleks fluorescerende RNAScope brukt for samtidig deteksjon av Ghsr- og Cck1r-transkripsjonene. Transkripsjonsfaktorene Phox2b og Prdm12 ble videre brukt som selektive markører for å skille henholdsvis nodose og jugulære afferente nevroner. Uten å visualisere Phox2b og Prdm12, ville det være utfordrende å identifisere jugular vs. nodose afferent nevroner med sikkerhet. Som forklart ovenfor inkluderer ett kritisk trinn en konsekvent og riktig disseksjonsteknikk. I tillegg er verifisering av endogen fluorescens også en viktig faktor, da det lett kan forveksles med RNAScope-signaler. Videre anbefales valget av passende oppkjøpsparametere basert på negativt kontrollvev sterkt. Som nevnt tidligere er konfektmikroskopi den foretrukne bildemetoden med mål på 20x og 63x (olje) fordi 1) transkripsjoner uttrykt på lave nivåer og / eller i sparsomme celler bare kan være merkbare ved høy forstørrelse. 2) Konfokal mikroskopi tillater innsamling av et enkelt fokusplan, noe som er viktig med tanke på at to celler oppå hverandre feilaktig kan vises som en celle når de er avbildet av epifluorescence. 3) Konfektmikroskopi gir også mer selektive og fleksible anskaffelsesparametere. De ovennevnte oppkjøpsparametrene er bare gitt som et eksempel, og modifikasjoner anbefales avhengig av ett instrument, forstørrelse (20x eller 63x), uttrykksnivåer og endogene nivåer av fluorescens for et gitt vev. Fargingsprosedyren i seg selv forble svært nær den anbefalte protokollen med bare små justeringer. Åpenbart kan protokollen beskrevet her brukes på deteksjon av transkripsjoner, ikke bare GPCRs. Prosedyren beskrevet her er likevel spesielt nyttig med tanke på de tilbakevendende problemene med antistoffer reist mot GPCRs24.

Som tidligere diskutert15, musen nodose ganglion er noen ganger festet til overlegen cervical ganglion av en cellebro. Inkluderingen av denne cellebroen kan føre til forvirrende resultater, for eksempel at ikke-vagale markører blir oppdaget i nodose ganglion. Etterforskeren kan ønske å systematisk verifisere om nodose ganglion er festet til overlegen Cervical ganglion under disseksjon. Ellers vil inkonsekvente disseksjonsevner mellom ganglia introdusere eksperimentell variasjon. Det er også viktig å merke seg at både petrosale og nodose afferent nevroner uttrykker Phox2b47. Dermed inkluderte det vi refererte til som nodose afferent nevroner både petrosale og nodose nevroner. Til slutt, når man sammenligner forskjellige studier, bør man huske på at forskjellige metoder for eutanasi kan forårsake endringer i genuttrykk48.

I teorien kan fluoroforene som brukes til deteksjon, om hverandre tilskrives enhver kanal. Opal 690 ble imidlertid funnet å avgi et lavt nivå av grønn fluorescens. Under de fleste omstendigheter, når det gjelder svært uttrykte transkripsjoner (f.eks. Prdm12), ble uønsket grønn fluorescens sett hvis laserintensiteten var for høy. Opal 690 anbefales derfor for gener med moderat/lavt uttrykk. Hvis du bare arbeider med sterkt uttrykte gener, anbefales det å fortynne Opal 690 ytterligere (dvs. 1/3000) og ikke fange opp uspesifisert grønn fluorescens under bildeoppkjøp. RNAscope-signaler er separate prikker av forskjellige farger, selv når transkripsjoner uttrykkes innenfor samme celleprofil. For svært uttrykte transkripsjoner er det imidlertid kanskje ikke mulig å se individuelle prikker, men heller fluorescens som fyller opp cytoplasmaet. Når prikker avgir fluorescens av forskjellige farger, kan man vurdere et problem med uspesifisert fluorescens på grunn av blant annet utilstrekkelige oppkjøpsparametere og / eller endogene pigmenter. Til slutt må ikke Opal 570 og 620 brukes samtidig fordi utslippsspektraet overlapper.

Hvis det ikke observeres RNAscope-signaler for et gen som er kjent for å uttrykkes i vevet av interesse, anbefales det å verifisere vevets integritet ved å kjøre en positiv sonde tilgjengelig (dvs. peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B rengjøringsgen). DAPI-motstaining er også nyttig for å bestemme vevskvaliteten. DAPI-merkede kjerner som ser ut til å være makulert, kan indikere overdreven fordøyelse eller feil fast vev.

Som et resultat ble Ghsr uttrykt i en liten undergruppe av Prdm12-positive jugulære afferente nevroner. I motsetning, og i samsvar med en tidligere studie11, Ghsr mRNA var nesten fraværende fra nodose afferent nevroner. Det er utledet at lave nivåer av Ghsr mRNA tidligere oppdaget av qPCR og ISH var sannsynlig på grunn av jugular afferent nevroner30,31,32. En tidligere kalsiumsignaleringsstudie viste at 3% av dyrkede vagal afferent nevroner reagerer på ghrelin49, et tall som er bemerkelsesverdig lik prosentandelen ghsr-uttrykkende jugulære afferent nevroner. Cck1r ble uttrykt i mange Phox2b-positive nodose afferent nevroner og, mer overraskende, i en undergruppe av Prdm12-positive jugulære afferente nevroner. Oppsummert demonstrerer dette dokumentet vellykket tilpasning av eksisterende ISH-teknikker for å vurdere cellulær distribusjon av utvalgte GPCRs i jugular-nodose ganglionic massen i sin helhet.

Til slutt ble multiplex ISH brukt til å oppdage og samtidig visualisere transkripsjonene for to GPCRs (Cck1r og Ghsr) og en transkripsjonsfaktor (Phox2b eller Prdm12) i hele vagal ganglionic komplekset til den voksne musen. Protokollen som er beskrevet her, kan være et komplementært verktøy til RNA-sekvensering, qPCR og tradisjonell histologi. Denne protokollen kan imidlertid brukes på andre ganglia av lignende størrelse. Som diskutert ovenfor er oppkjøpsparametere, dyrealder og konsistens av disseksjon viktige faktorer å vurdere under eksperimentell design. Derfor kan den tilby unik informasjon om topografiske genuttrykksmønstre i en svært heterogen og liten ganglion. Denne protokollen kan brukes til å bestemme endringer i transkripsjonsprofilene til jugulære vs. nodose afferent nevroner i sammenheng med ulike fysiologiske og patofysiologiske forhold, inkludert, men ikke begrenset til, endringer i fôringsstatus. Det kan også brukes til å sammenligne den nevrokjemiske sminken av vagal afferent nevroner i dyrearter som vanligvis brukes i preklinisk forskning, inkludert primater og griser50,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core finansiert av NIH grant #5P01DK119130-02. Forfatterne ønsker å anerkjenne hjelpen fra UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (ledet av Dr. Phelps) og dets ansatte (Abhijit Bugde og Marcel Mettlen), delvis støttet av NIH Grant #1S10OD021684-01, en delt ressurs for Harold C. Simmons Cancer Center, støttet delvis av et NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
20x SSC Invitrogen AM9763
-80°C freezer PHCBI MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021 Adobe photo and design software
Baking oven Thermo Scientific Model:658
Confocal microscope Zeiss LSM880 Airyscan
Cover glass Brain Research Laboratories 2460-1.5D
Cryostat Leica CM 3050 S
Dumont #5 Forceps F.S.T. 11252-20
Ecomount Biocare Medical EM 897L mounting medium
HybEZ oven hybridization oven
Hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
ImageJ-Fiji NIH
Large scissors Henry Schein 100-7561
Micro centrifuge tubes VWR 20170-333
Minipump variable flow Fisher Scientific 13-876-1
Opal 520 Akoya biosciences FP1 1487001KT Fluorescent biomarker
Opal 570 Akoya biosciences FP1 1488001KT Fluorescent biomarker
Opal 690 Akoya biosciences FP1 1497001KT Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 ACD /Bio-Techne 323100 multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 ACD /Bio-Techne 313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB ACD /Bio-Techne 310043
RNAscope probe Mouse Ghsr ACD /Bio-Techne 426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 ACD /Bio-Techne 407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 ACD /Bio-Techne 524371-C2
RnaseZap Sigma R2020 Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors Millipore Sigma Z265977
Superfrost Plus slides Fisherbrand 1255015
Tissue Tek OCT medium Sakura 4583
User manual ACD 323100 USM
Vannas Spring Scissors Roboz RS 5620
ZEN Imaging Software Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 175 Nevroanatomi signalering histologi transkripsjon transmembranreseptorer perifert nervesystem disseksjon konfektmikroskopi fluorescens
Påvisning av G Protein-koblet reseptoruttrykk i mus Vagal Afferent Neurons ved hjelp av Multiplex <em>In Situ</em> Hybridization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bob-Manuel, J., Gautron, L.… More

Bob-Manuel, J., Gautron, L. Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (175), e62945, doi:10.3791/62945 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter