Summary
백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.
Abstract
동맥 형성은 성장하는 측부 혈관의 혈관 주위 공간으로의 백혈구 및 혈소판 모집에 크게 의존합니다. 동맥 형성에서 측부 동맥 및 백혈구를 분석하기 위한 표준 접근법은 생체 외 (면역-) 조직학적 방법론입니다. 그러나 이 기술은 혈류, 전단 응력, 세포-세포 상호 작용 및 입자 속도와 같은 동적 과정을 측정할 수 없습니다. 이 논문은 생체 내 이미징을 활용하여 동맥 형성 동안 성장하는 측부 동맥의 생체 내 과정을 모니터링하는 프로토콜을 제시합니다. 여기에 설명된 방법은 역학 측정을 위한 신뢰할 수 있는 도구이며 다광자 여기 현미경으로 제공하는 광세포 독성을 최소화하면서 고대비 분석을 제공합니다. 성장하는 측부 동맥을 분석하기 전에, 대퇴 동맥의 일측성 결찰에 의해 마우스의 내전근에서 동맥 형성이 유도되었습니다.
결찰 후, 기존의 측부 동맥은 전단 응력 증가로 인해 성장하기 시작했습니다. 수술 24시간 후, 측부 동맥 위의 피부와 피하 지방을 제거하여 추가 분석을 위한 주머니를 만들었습니다. 생체 내 이미징 동안 혈류와 면역 세포를 시각화하기 위해 CD41-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(혈소판) 및 CD45-피코에리트린(PE)(백혈구) 항체를 마우스의 꼬리 정맥에 삽입된 카테터를 통해 정맥내(i.v.) 주사했습니다. 이 기사에서는 동맥 형성과 관련된 과정을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 정적 생체 외(면역) 조직학적 분석에 대한 대안 또는 생체 내 보완으로 생체 내 다광자 이미징을 소개합니다. 요약하면, 이 논문은 동맥 형성의 뒷다리 모델에서 면역 세포 이동, 혈류 및 전단 응력을 조사하기 위한 새롭고 역동적인 생체 내 방법을 설명하며, 이는 평가 가능성을 현저하게 향상시킵니다.
Introduction
최근 몇 년 동안 집중적인 연구 관심에도 불구하고 허혈성 심장 질환 및 뇌졸중과 같은 심혈관 질환은 여전히 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다1. 이러한 질환에 대한 현재 치료법은 경피적 경혈관 성형술, 경피적 경혈관 관상동맥 성형술 또는 우회 수술과 같은 고도 침습적 치료법이다2. 따라서 대안적인 비침습적 치료 옵션의 개발이 시급합니다. 신체는 협착되거나 폐색된 혈관 주위에 자연적인 우회로를 만들어 중단된 혈류를 협착의 원위 부분으로 리디렉션할 수 있습니다. 이 과정을 동맥 형성2라고 합니다. 최근의 많은 연구에 따르면 증가된 유체 전단은 동맥 형성 동안 중요한 역할을 하는 백혈구 모집에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다3. 동맥 형성 중 백혈구 모집을 분석하기 위한 주요 현재 옵션은 생체 외 (면역) 조직학적 분석 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법론입니다4. 동맥 형성 중 백혈구 역학을 평가할 수 있도록 이 논문은 다광자 현미경을 사용한 생체 내 이미징 프로토콜을 제시합니다.
백혈구는 동맥 형성 과정에서 모집되는 주요 혈액 세포이다3. 이 프로토콜은 쥐 뒷다리 허혈 모델 5,6을 사용하여 대퇴 동맥 결찰술(FAL)에 의한 동맥 형성 유도 후 24시간 후에 측부 동맥에 주입된 항-CD45-PE 항체로 표지된 부착 백혈구의 크롤링을 보여주기 위해 다광자 이미징을 사용합니다. 대안적으로, 생체 외에서 면역 세포를 표지하고 생체 내 현미경을 이용한 혈관신생에 관한 연구에서 볼 수 있듯이 생쥐에 조심스럽게 주입할 수 있다7. 혈관 및 동맥 내부의 혈류는 CD41-FITC(혈소판 표지), 덱스트란-FITC(혈장) 또는 혈관 트리의 일부 기저막에 존재하는 콜라겐 유형 1을 시각화하는 2차 고조파 생성(SHG)에 의해 시각화될 수 있습니다. SHG는 다광자 여기의 독특한 자유 라벨링 효과입니다. 다광자 이미징은 조직에 해를 끼치지 않고 레이저 파워 여기로 세포를 활성화하지 않고 장기적인 세포 추적을 가능하게 합니다. 다광자 현미경은 형광단을 최소한의 광독성으로 조직/기관 깊숙이 여기시킬 수 있는 능력으로 인해 살아있는 동물의 형광 표지된 세포 및 구조를 시각화하기 위해 선택되는 이미징 방법입니다8.
펨토초 간격 내에서 전달되는 펄스와 함께 조정된 적외선 레이저를 사용하면 초점면에서만 형광색소를 여기시키고 초점면 위와 아래에는 여기가 없습니다(8). 따라서 다광자 현미경은 장기 내부의 역동적인 생물학적 사건을 연구하기 위해 높은 시공간 해상도, 더 적은 광 손상 및 증가된 조직 침투 이미징을 허용합니다. 살아있는 동물 이미징을 위한 이상적인 현미경 도구입니다. 그러나 다광자 및 기타 생체 내 현미경 기술은 심장 박동, 호흡, 연동 운동, 근육 긴장도 및 기타 생리적 기능으로 인한 조직 운동에 의해 제한되어 이미징 획득 및 분석을 방해합니다. 이러한 움직임은 시간적 및 공간적 해상도를 손상시키고 때로는 후속 분석을 방해하기도 하므로 정확한 데이터 분석 및 해석이 가능하도록 적절하게 해결해야 합니다. 조직 운동으로 인한 인공물을 낮추거나 방지하기 위한 몇 가지 전략이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 VivoFollow9라는 현장 드리프트 보정 소프트웨어를 적용하여 이미지 획득 중 조직 드리프트를 교정합니다. 이 접근 방식은 필요한 이미지 안정화를 제공하여 장기 이미징 및 세포 추적 분석을 가능하게 합니다.
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Protocol
이 연구는 바이에른 동물 관리 및 사용 위원회(윤리 강령: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99에 의해 승인됨)의 승인을 받았습니다. 이 실험은 독일 동물 법규 지침에 따라 엄격하게 수행되었습니다.
1. 동물 및 대퇴 동맥 결찰술(FAL)
참고: 무균 염증 및 동맥 형성을 유도하기 위해 8-10주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 마우스들 중 어느 마우스도 각각 FAL 또는 가짜 수술 중 또는 후-상처 감염 또는 상처 치유 장애로 사망하거나 고통받지 않았다.
- 마취
참고: MMF-mix 마취를 주입하기 전에 마우스가 잠들 때까지 먼저 5% 이소플루란으로 마취하는 것이 좋습니다.- 마우스의 무게를 측정하고 미다졸람 5.0mg/kg, 메데토미딘 0.5mg/kg 및 펜타닐 0.05mg/kg의 용량으로 MMF 혼합물을 준비합니다.
- 1mL 주사기에 MMF-mix를 채우고 30G 바늘을 사용하여 100μL s.c.의 최종 부피를 주입합니다(5% 이소플루란으로 마취 후).
- 따뜻한 패드에 마우스를 놓고 마우스가 완전히 마취될 때까지 기다립니다. 타이머를 35분으로 설정합니다. 이 시간 후, s.c. MMF-믹스 용량의 절반(50μL)을 주입합니다.
- 마우스의 페달과 디지털 간 반사 (단단한 발가락 핀치)를 테스트하여 마취 깊이를 확인하십시오.
참고: 반응이 없으면 적절한 진통 깊이를 나타냅니다.
- 대퇴동맥 결찰술(FAL)
참고: 멸균 수술 기구와 봉합사를 사용하십시오. 개봉 전과 폐회 후에 소독제로 피부를 소독하십시오.- 마취된 마우스를 생리적 체온을 유지하기 위해 가열판(35-37°C)에 올려 놓는다. 마취하에 눈의 건조를 방지하기 위해 각 눈에 아이 크림 (dexpanthenol)을 바릅니다.
- FAL 전후에 마취된 마우스를 레이저 도플러 이미징(LDI) 챔버로 옮겨 혈류 및 관류를 확인합니다(그림 1A-C).
- 머리카락을 제거하고 피부를 소독하고 대퇴 동맥에 접근하기 위해 절개하십시오. 수술 현미경 하에서, 꼰 실크 봉합사(7-0)를 사용하여 마우스 뒷다리의 우측 대퇴 동맥을 결찰하고, 좌측 대퇴 동맥에 가짜 수술을 수행하여 앞서 설명한바와 같이 내부 대조군 역할을 한다 6(도 1D-K).
알림: 피부에 가까운 혈관이 직접 손상되는 것을 방지하기 위해 작은 가위로 피부를 절개했습니다. - 꼰 실크 봉합사 (6-0)를 사용하여 피부를 닫습니다. 부프레노르핀(0.1mg/kg) s.c. 통증 완화를 위해 마취를 길항하기 전에 10분부터 시작하여 12시간마다. 수술 후 24시간 동안 통증 신호, 즉 그루밍 활동 감소, 움직이기 꺼림 또는 구부정한 자세에 대해 동물을 관찰합니다.
- 날록손(1.2mg/kg), 플루마제닐(0.5mg/kg) 및 아티파메졸(2.5mg/kg)의 조합을 주사(s.c.) FAL을 마치고 피부를 닫은 후 마취를 길항합니다.
- 수술 후 마우스를 따뜻한 패드에 올려 놓고 똑바로 선 자세를 유지하고 케이지 주위를 정상적으로 걷기 시작할 때까지 동물을 지속적으로 모니터링하십시오.
- 마우스가 완전히 깨어 나면 다른 마우스와 함께 케이지에 다시 넣고 케이지를 동물 사육실로 되돌립니다.
2. 다광자 생체 내 이미징을 위한 조직 준비
- 꼬리 정맥 주사
참고: 동물은 생체 내 이미징 준비를 시작하기 전에 마취 상태에 있어야 합니다. 정맥 카테터의 바늘을 삽입하기 전에 꼬리에 피부 소독제를 바르는 것이 좋습니다. 이것은 또한 혈관을 시각화하는 데 도움이 될 것입니다.- 2 x 30G 바늘, 10cm의 미세 보어 폴리에틸렌 튜브(내경 0.28mm, 외경 0.61mm), 1mL 주사기 및 히스토아크릴 접착제를 사용하여 꼬리 정맥 주사 카테터를 준비하여 마우스 꼬리에 카테터를 고정합니다.
- i.v. 주사를 위한 항체 용액 준비: CD45-PE 및 CD41-FITC(20μg/마우스)를 최종 부피 100μL로 합니다.
- 꼬리에 옆으로 위치한 꼬리 정맥이 있는지 확인하고 정맥을 댐핑하여 꼬리 정맥을 식별합니다. 꼬리를 소독하고 정맥 카테터를 삽입한 다음 조직 히스토아크릴 접착제를 사용하여 고정합니다(그림 2B).
- 이미징 전(최소 15분 전)과 조직 준비를 마친 후 항체를 주입합니다.
- 조직 준비
알림: 조직을 준비하기 전에 항상 따뜻한 패드를 사용하고 각 눈에 아이 크림(dexpanthenol) 한 방울을 투여하십시오. 멸균 수술 기구와 봉합사를 사용하십시오. 개봉 전과 폐회 후에 소독제로 피부를 소독하십시오.- 마취된 마우스를 안정적이고 휴대용 패드에 놓습니다. 접착 테이프를 사용하여 패드에 4점 고정된 상태에서 마우스를 앙와위 자세로 고정합니다(그림 2B).
- 두 조각의 모델링 점토를 성형하고 조각을 마우스의 위쪽 뒷다리 아래에 놓아 내전근의 평면 위치를 확인합니다(그림 2B, 빨간색 화살표로 표시).
- 마우스의 체온이 37°C로 안정되도록 하기 위해, 마우스와 함께 패드를 0.64-4.0배 줌으로 수술 현미경 하에서 가열판 위에 올려놓았다(도 1L).
- 양쪽 다리에서 털을 제거하고 피부를 소독한 다음 오른쪽 뒷다리의 초기 대퇴 동맥 결찰술 흉터 주위에 원을 그리며 피부를 자릅니다(그림 1M).
- 다리 상단에서 피부와 지방층을 제거하고(그림 1N,O) 봉합사를 사용하여 나머지 피부를 옆으로 당겨 내전근 주위에 주머니를 만듭니다(그림 1P,Q).
- 피하 지방을 제거하여 내전근과 심부 동맥/정맥 및 측부 혈관을 명확하게 볼 수 있습니다(그림 1Q,R).
- 미세한 집게로 조심스럽게 해부하여 측부 혈관 상단의 표면 근육층을 조심스럽게 제거하기 시작합니다(그림 1R).
참고: 측부 동맥과 측부 정맥이 명확하게 보이고 이미징할 준비가 되어 있습니다(그림 1S). - 조직의 건조를 피하기 위해 준비된 주머니에 식염수를 채우고 가짜 수술 왼쪽 뒷다리와 동일한 절차를 계속하십시오. 이미징하기 전에 두 포켓에 초음파 젤을 추가하여 건조를 방지하고 대물렌즈와의 광학 결합을 위한 침지 매체 역할을 합니다(그림 2C 및 그림 2F).
3. 생체 내 다광자 현미경 검사
- 준비
참고: 현미경의 인큐베이터 챔버 내부에 초음파 젤이 있는 주사기를 보관하여 장기간 이미징하는 동안 주머니를 다시 채울 수 있도록 따뜻한 온도를 유지하십시오.- 준비된 두 개의 포켓에서 식염수를 제거하고 초음파 젤로 교체하여 측부 혈관을 덮습니다 (그림 2C).
- 꼬리 정맥 카테터를 통해 항체 용액을 주입합니다. 항체 주입 15분 후, 고정된 마우스가 있는 패드를 따뜻하게 된 다광자 이미징 챔버로 옮깁니다(그림 2F).
- 이미지 획득이 완료된 후, 깊은 마취 상태에서 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킵니다.
- 다광자 현미경 이미지 획득
알림: 레이저 안정화를 위해 이미징 30분 전에 현미경을 켭니다. 현미경의 최상의 광학적 안정성을 위해 현미경 챔버를 영구적으로 가열하는 것이 좋습니다.- Ti:Sapphire 레이저 상자, 전자 인터페이스 상자, 배양 챔버의 가열 장치, 형광등 및 컴퓨터의 키를 켭니다(그림 2D,E).
- 수집 소프트웨어(Inspector 소프트웨어)를 시작합니다. 파장을 800nm로 설정하고 현미경 셔터를 엽니다(그림 3A ii).
- 측정 마법사 대화 상자에서 기기 모드(단일 빔)와 측정 모드 (3D 스캔 타임랩스)를 선택합니다(그림 3A i).
- 마취된 마우스를 현미경의 예열된 배양 챔버로 옮깁니다. 대물 렌즈 (그림 2F)와 직접 접촉하는 초음파 젤 (2.2.8 단계)이있는 영역을 배치합니다.
- 에피형광 현미경 셔터를 열고 FITC 시각화를 위한 적절한 필터/이색성 설정(4)을 선택하여 에피형광 조명 아래에서 혈류를 따라 관심 영역을 찾습니다. 관심 영역을 중앙 시야로 가져온 후 epifluorescence 현미경 셔터를 닫습니다.
- xy-Scanner 대화 상자에서 이미지 크기(554x554), 픽셀(512x512), 빈도(400), 라인 평균(1) 매개변수를 설정합니다(그림 3A iii). 레이저 출력(5%)을 조정하고(그림 3A iv) 녹색(66), 빨간색(66) 및 파란색(63) 채널에 대한 광전자 증배관(PMT) 게인을 설정합니다(그림 3A v).
- 생체 내 이미징 및 드리프트 보정 설정에 적합한 대물렌즈를 선택합니다(자세한 내용은 3.2.11 참조).
참고: 여기서 선택한 대물렌즈는 Nikon LWD 16x입니다(그림 3A vi). - 측정 마법사 대화 상자 창의 오른쪽 상단 모서리에 있는 빨간색 버튼을 눌러 미리보기 획득 모드를 시작하여 이미지 스택 범위를 정의합니다(그림 3A i).
- 좋은 이미지를 얻기 위해 초점을 맞춰 관심 영역과 구조를 정의합니다. 그런 다음 화면을 관찰하면서 이미지가 사라질 때까지 대물렌즈를 위로 이동하여 초점을 변경하고 0(first=0)으로 설정합니다. 이미지가 화면에서 다시 사라질 때까지 대물렌즈를 아래로 이동하여 반대 방향으로 초점을 변경하고 축 방향의 마지막(끝=40μm) 위치로 설정합니다(그림 3A vii).
- 스텝 크기를 2μm로 설정합니다. 측정 마법사 대화 상자의 오른쪽 상단 모서리에 있는 빨간색 버튼을 클릭하여 미리보기 스캔을 중지합니다.
알림: 이미지 수는 그림 21A vii에 표시된 대로 자동으로 계산되고 설정됩니다(3개 이미지). - 현미경에 실시간 드리프트 보정9가 장착되어 있는 경우 드리프트 보정 소프트웨어(예: VivoFollow)를 시작하고 아래 설명된 단계를 따르십시오.
- Measurement Wizard(측정 마법사) 대화 상자에서 Python 축(Python Ax)(그림 3A viii)을 첫 번째 축 장치로 선택합니다. 자동 저장 모드를 활성화하지 마십시오. 시간 축(Time Time)에서만 자동 저장(AS) 상자를 선택합니다. 사용 가능한 장치 창(그림 3A ix)에서 Python 아이콘을 눌러 Python 대화 상자 창을 엽니다.
- Python 대화 상자 축 설정에서 시작(0 영) 및 끝(-40)을 입력합니다. 그림 21A x에 표시된 대로 단계 수(3)를 입력합니다.
- xyz Stage Z 대화상자 창으로 이동하여 양쪽 끝에서 스캔 범위를 200μm 확대합니다: 시작에 (200μm)를 입력하고 종료에 (-240μm)를 입력하면 범위가 자동으로 설정됩니다(-440μm). 그림 3A xi와 같이 스텝 크기(2μm)를 유지합니다.
- VivoFollow Frontend 대화 상자를 열고 Motion Profile 상자를 클릭합니다(그림 3A xii).
- Inspector 소프트웨어의 Measurement Wizard(측정 마법사) 대화 상자의 왼쪽 상단 모서리에 있는 녹색 화살표를 눌러 이미지 수집을 시작합니다(그림 3A i).
- 라이브 드리프트 보정을 사용하는 경우 그림 3A xiii에 표시된 대로 드리프트 보정 구성에 대한 대화 상자가 나타나는지 확인합니다. 움직이지 않는 랜드마크 참조로 사용할 획득 채널을 설정합니다(이 프로토콜의 경우 혈관 추적자 신호가 기록될 채널 2 선택). 첫 번째 및 마지막 z 위치(여기서는 200μm)에 추가된 최대 보정 오프셋(μm)을 입력하고 확인을 클릭합니다.
- VivoFollow 전면 대화 상자 창에서 이미지를 획득하는 동안 x, y 및 z의 현재 드리프트 오프셋을 실시간으로 모니터링합니다. 그림 3A xiv.
- 또 다른 주기의 마취 재주입이 필요한 ~35분 후에 영상 획득을 중지합니다. MMF-mix(50 μl s.c)의 절반 용량을 주입하고 녹색 화살촉을 다시 눌러 이미징 획득을 다시 시작합니다(단계 3.2.11.5).
- 실험이 완료될 때까지 이 절차를 반복합니다.
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Representative Results
다광자 현미경은 백혈구 추적을 위한 높은 시공간 분해능을 제공하며, 세포 이동 단계와 속도를 추적하고 모니터링할 수 있습니다(그림 4A,B). 그러나 샘플의 생리학적 움직임은 특히 장기간의 생체 내 현미경 이미지 획득에 어려움을 야기합니다. 따라서, 조직 드리프트에 대한 실시간 이미징 보정과 같은 좋은 조직 준비 및 조직 고정 도구 및 홀더가 성공적이고 안정적인 이미징 획득을 위해 요구된다. 여기서는 라이브 드리프트 도구인 VivoFollow를 사용하여 장기 이미징 획득 중에 생성된 조직 드리프트를 보정했습니다.
이 도구를 사용하면 장기적인 이미지 수집이 가능하며 속도 측정을 위한 셀 추적에 적합한 고품질 데이터를 수집할 수 있습니다. 그림 3B에서 볼 수 있듯이 드리프트 보정이 없으면 관심 영역이 기록 보기에서 점진적으로 멀어지면서 속도 분석을 위해 셀을 추적하는 기능에 영향을 미칩니다. 그러나 그림 3C에서 볼 수 있듯이 드리프트 보정 소프트웨어를 사용하면 안정적인 동영상을 녹화할 수 있으며 장기간에 걸쳐 더 많은 셀을 추적할 수 있습니다. 드리프트 보정 소프트웨어는 그림 3D와 같이 시스템이 보정한 시간 경과에 따른 x, y 및 z 오프셋의 시각화도 제공할 수 있습니다.
그림 1: 레이저 도플러 이미징 설정 및 대퇴 동맥 결찰을 위한 준비 및 생체 내 이미징을 위한 조직 준비. (A) LDI 이미징 설정. (B) 마우스는 이미지 획득을 위해 LDI 온난화 챔버 내부에 배치됩니다. (C) 결찰 후 뒷다리 관류를 확인하기 위해 오른쪽 및 왼쪽 다리 전(상부 패널)과 FAL 후(하부 패널)의 LDI 이미지. 우측 대퇴동맥은 결찰/폐색되었고, 좌측 대퇴동맥은 가짜로 수술(Sham)되어 내부 통제 역할을 했습니다. 색상 막대에서 파란색은 낮은 관류를 나타내고 빨간색은 높은 관류를 나타냅니다. (D-케이) 이미지는 대퇴 동맥 결찰술의 수술 단계를 나타냅니다. 스케일 바 = 10mm. (LS) FAL 후 생체 내 이미징을 위한 조직 준비. 이미지화할 영역은 담보 용기가 있는 검은색 원으로 표시됩니다. 스케일 바 = 5mm. 약어: LDI = 레이저 도플러 이미징; FAL = 대퇴 동맥 결찰술; Occ = 폐색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다광자 생체 내 이미징을 위한 설정. (a) 정맥 카테터 준비; 10 cm의 미세 폴리에틸렌 튜브, 2 : 2x 30 G 바늘; 3: 1 mL 주사기로 연결된 장착된 카테터; 4: 조직 히스토아크릴 접착제; 5 : 바늘 홀더. (B) 이미징을 위해 준비된 검은색 모델링 점토(빨간색 화살표) 조각 위에 양쪽 뒷다리를 놓고 앙와위 자세로 마우스를 배치합니다. (C) Occluded(Occ) 오른쪽 뒷다리 및 왼쪽, 이미징 준비가 된 가짜 작동 뒷다리. (D) 레이저 상자, 형광 램프 상자, 인큐베이터 챔버 가열용 튜브를 보여주는 다광자 현미경 설정. (E) 다광자 현미경의 인큐베이터 챔버. (F) 초음파 젤로 덮인 조직에 닿는 16x 대물렌즈와 함께 현미경 챔버 내부에 배치된 마우스. 항체 주입을 위해 꼬리 정맥에 고정된 정맥 카테터를 보여주는 세부 사항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: VivoFollow 드리프트 보정 소프트웨어 설정. (ᅡ) (i-xiv) 프로토콜 단계 3.2.2-3.2.11.9에 설명된 소프트웨어 설정 단계. (B) 드리프트 보정 소프트웨어를 켜지 않은 상태에서 이미징 드리프트를 보여주는 대표적인 시계열 이미지. 측부 동맥은 흰색 단절된 선으로 구분됩니다(비디오 1 및 비디오 2). (C) 이미징 획득 중에 라이브 드리프트 보정이 적용될 때 안정적인 시계열을 보여주는 대표적인 시계열 이미지. 백혈구는 CD45-PE 항체 (적색)로 표지되었고, 혈소판은 CD41-FITC 항체 (녹색)로 표지되었고, 콜라겐 유형 1은 SGH (청색)로 표지되었다. 측부 동맥은 흰색 단종선으로 구분됩니다. (D) x, y 및 z 방향에 따른 실시간 보정을 보여주는 꺾은 선형 차트. 약어: PE = 피코에리트린; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; SGH = 2차 고조파 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표적인 결과 . (A) 가짜 수술(Sham) 및 대퇴 동맥 결찰 뒷다리의 측부 동맥에서 측정된 백혈구 속도. (B) 대표 이미지는 트랙이 색상으로 구분된 추적(자홍색)된 셀을 보여줍니다. 색상 코드 막대는 느린 셀은 파란색 트랙으로 표시되고 빠른 셀은 빨간색 트랙으로 표시되는 셀 속도를 나타냅니다. 백혈구는 주사된 CD45-PE 항체(빨간색)로 표지되었고, 혈소판은 주입된 CD41-FITC 항체(녹색)로 표지되었고, 콜라겐 유형 1은 SGH(파란색)로 표지되었습니다. 세 가지 개별 실험 결과. 스케일 바 = 20 μm. 비디오 3 및 비디오 4를 참조하십시오. 약어: Occ= 폐색/대퇴 동맥 결찰; PE = 피코에리트린; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; SGH = 2차 고조파 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 드리프트 보정 없이 측부 동맥의 다광자 생체 내 이미징. 4차원 이미지는 픽셀 크기 554 x 554 μm, 주파수 600 Hz, 간격 1100 ms/프레임, 스텝 크기 2 μm, 범위 40 μm로 기록되었습니다. 비디오는 VivoFollow 드리프트 보정 소프트웨어를 적용하지 않은 이미지 드리프트를 보여줍니다. 영상 하단에는 측부동맥이 나타나고, 영상의 상단에는 3분 후 측부정맥이 나타난다. 스케일 바 = 50 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 적용된 드리프트 보정을 사용한 측부 동맥의 다광자 생체 내 이미징. 픽셀 크기 554 x 554 μm, 주파수 600 Hz, 간격 1100 ms/frame, 스텝 크기 2 μm, 범위 40 μm로 4차원 이미지를 촬영했습니다. 영상은 라이브 드리프트 보정 소프트웨어인 VivoFollow로 촬영되었으며, 드리프트 보정 소프트웨어를 적용하여 향상된 이미징 안정성을 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 3: 가짜 수술 후 측부 동맥의 세포 추적 이미징. 주입된 항-CD45-PE 항체로 표지된 백혈구를 가짜 수술 다리의 휴식 측부 동맥에서 이미지화하고 세포 추적용 플러그인과 함께 Imaris 소프트웨어를 사용하여 추적했습니다. 추적된 세포는 선택되었고 마젠타색 점으로 표시되었습니다. 트랙은 셀 속도에 따라 색상으로 구분되었습니다. 느린 셀은 파란색 트랙으로, 빠른 셀은 빨간색 트랙으로 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어 = PE = 피코에리트린. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 4: FAL 후 측부 동맥의 세포 추적 이미징. 항-CD45-PE 항체로 표지된 백혈구는 FAL에 의한 동맥 형성 유도 후 24시간 후에 성장하는 측부 동맥에서 이미지화되고 세포 추적용 플러그인과 함께 Imaris 소프트웨어를 사용하여 추적되었습니다. 추적된 세포는 선택되었고 마젠타색 점으로 표시되었습니다. 트랙은 셀 속도에 따라 색상으로 구분되었습니다. 느린 셀은 파란색 트랙으로, 빠른 셀은 빨간색 트랙으로 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: FAL = 대퇴 동맥 결찰; PE = 피코에리트린. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 기술적 문제 | 제안된 해결책 | |
| 카테터를 삽입하기 위해 꼬리 혈관이 보이지 않는 경우 | • 국소 혈관 확장을 촉진하기 위해 마우스 꼬리 주위를 3-5분 동안 온찜질을 사용합니다. 정맥을 보이게하는 데 도움이 될 것입니다. | |
| 항체 주입을 위해 꼬리 카테터를 고정할 수 없는 경우 | • 30G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여 정맥에 삽입하고 이미징 전에 항체와 염료를 직접 주입합니다. | |
| • 경우에 따라(항체에 따라) 이미징 1시간 전에 주사를 적용할 수 있습니다. | ||
| 조직의 움직임이 영상의 안정성을 저해하는 경우 | • 생리적 복부 움직임을 피하기 위해 마우스 위쪽 힌트 다리의 위치를 변경하고 다시 고정하십시오. | |
| • 현미경 테이블에 진동을 제거하기에 충분한 공기가 있는지 확인하십시오. | ||
| • 마우스가 깊은 마취 상태에 있고 깨어나지 않는지 확인하십시오. | ||
| • 마우스의 호흡을 모니터링합니다. 마우스가 너무 빨리 숨을 쉬면 이미징 동작에 영향을 줄 수 있습니다. | ||
| 화질이 떨어지기 시작할 때 | • 초음파 젤이 마르지 않도록하십시오. | |
| • 초음파 젤을 다시 채우십시오. | ||
| • 대물렌즈가 깨끗한지 확인하십시오(새로운 재충전이 완료될 때마다 대물렌즈의 건조된 초음파 젤을 청소하십시오). | ||
| 영상 준비 중 동맥이 손상된 경우 | • 이 경우 이미지를 획득할 수 없습니다. 실험을 실행할 수 없습니다. | |
표 1: 문제 해결.
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Discussion
백혈구 모집의 다광자 생체내 분석의 설명된 방법은 (면역-) 조직학적 또는 FACS 분석과 같은 백혈구 모집 연구에 일반적으로 사용되는 도구에 대한 추가를 나타냅니다. 이 이미징 방법을 사용하면 동맥 형성 동안 백혈구 부착 및 혈관외 유출의 동적 과정을 더 자세히 시각화할 수 있습니다10. 이 방법의 부가가치에도 불구하고 제공된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계와 제한 사항이 포함되어 있습니다. 자세한 문제 해결 팁은 표 1 을 참조하십시오. 측부 동맥의 표재성 근육층을 제거하는 동안 이러한 동맥이 손상될 수 있으며 생체 내 영상에 유용하지 않습니다. 카테터는 항체 주입을 위해 잘 고정되어야 합니다. 그렇지 않으면 꼬리 정맥 카테터가 미끄러지면 항체가 꼬리의 혈관 주위 공간으로 유출되어 항체 주입을 위한 교체 및 추가 교정이 어려운 작업이 될 수 있습니다. 생체 내 현미경 검사 동안 측부 동맥과 측부 정맥의 정확한 식별은 이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계를 나타냅니다.
생체내 현미경 검사 중에 마우스가 기계적으로 환기되지 않는다는 점을 감안할 때, 지나치게 긴 마취로 인한 마우스의 신체적 손상을 방지하기 위해 동적 이미징 시간이 제한됩니다. 생체 내 현미경 검사의 단점 중 하나는 호흡, 심장 박동 및 연동 운동에 의해 생성되는 마우스 생리학적 움직임으로, 이미지 획득과 데이터 분석의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 조직 홀더 개선, 장착 및 고정은 움직임의 영향을 더욱 줄이는 단계입니다. 생리적 움직임 외에도 장기 이미징은 이미징 동안 조직 표류에 기여할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 바와 같이, 실시간 조직 드리프트 보정 소프트웨어인 VivoFollow를 사용하여 후속 세포 추적 및 세포 속도 분석에 적합한 이미징 데이터를 얻었습니다. 이 VivoFollow 소프트웨어는 이미지 획득 중에 x, y, z의 샘플 변위를 직접 보정합니다. 예를 들어, 교정 절차의 참조 랜드마크 역할을 하는 혈관 추적자로 혈관을 시각화할 때 움직이지 않는 해부학적 구조에 의존합니다.
Bitplane Imaris 또는 ImageJ용 플러그인과 같은 다른 획득 후 드리프트 수정 도구를 사용할 수 있지만 관심 영역의 복원을 허용하지 않기 때문에 수정 기능이 매우 제한적입니다. 원칙적으로, 관심 영역이 시야 밖으로 이동할 때 심각한 오프셋을 수정할 수 없습니다. 그러나 이 프로토콜은 라이브 드리프트 보정을 사용할 수 없고 획득 후 보정이 필요한 경우에도 적용할 수 있습니다. 그러나 이를 위해서는 조직 장착 및 고정에 대한 직원의 빈번한 교육이 필요합니다. 결론적으로, 다광자 생체 내 현미경은 백혈구 모집의 동적 구성 요소에 대한 보다 자세한 그림을 얻기 위해 (면역) 조직학적 분석과 같은 정적 확립 방법과 병행하여 적용할 수 있는 유용한 동적 방법입니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914(HI-A/SM, 프로젝트 Z01)의 자금 지원을 받았습니다. 원고를 읽어주신 Susanne Stutte 박사님께 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
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- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
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- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
