Summary
ल्यूकोसाइट्स और प्लेटलेट्स की भर्ती धमनीजनन के दौरान संपार्श्विक धमनियों के प्रभावी विकास के लिए आवश्यक एक आवश्यक घटक का गठन करती है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी विवो में उच्च स्थानिक-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ सेल गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए एक कुशल उपकरण है और धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट भर्ती और एक्स्ट्रावेसन का अध्ययन करने के लिए कम फोटो-टॉक्सिसिटी है।
Abstract
धमनीजनन दृढ़ता से बढ़ते संपार्श्विक वाहिकाओं के पेरिवास्कुलर स्थान पर ल्यूकोसाइट और प्लेटलेट भर्ती पर निर्भर करता है। धमनीजनन में संपार्श्विक धमनियों और ल्यूकोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए मानक दृष्टिकोण एक्स विवो (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल पद्धति है। हालांकि, यह तकनीक रक्त प्रवाह, कतरनी तनाव, सेल-सेल इंटरैक्शन और कण वेग जैसी गतिशील प्रक्रियाओं के माप की अनुमति नहीं देती है। यह पेपर इंट्रावाइटल इमेजिंग का उपयोग करके धमनीजनन के दौरान बढ़ती संपार्श्विक धमनियों में विवो प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यहां वर्णित विधि गतिशीलता माप के लिए एक विश्वसनीय उपकरण है और मल्टीफोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान की गई न्यूनतम फोटो-साइटोटॉक्सिसिटी के साथ एक उच्च-कंट्रास्ट विश्लेषण प्रदान करती है। बढ़ती संपार्श्विक धमनियों का विश्लेषण करने से पहले, ऊरु धमनी के एकतरफा बंधाव द्वारा चूहों की जोड़ की मांसपेशियों में धमनीजनन को प्रेरित किया गया था।
बंधाव के बाद, कतरनी तनाव में वृद्धि के कारण पहले से मौजूद संपार्श्विक धमनियां बढ़ने लगीं। सर्जरी के चौबीस घंटे बाद, संपार्श्विक धमनियों के ऊपर की त्वचा और चमड़े के नीचे की वसा को हटा दिया गया, जिससे आगे के विश्लेषण के लिए एक जेब का निर्माण हुआ। विवो इमेजिंग के दौरान रक्त प्रवाह और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, सीडी 41-फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) (प्लेटलेट्स) और सीडी 45-फाइकोएरिथ्रिन (पीई) (ल्यूकोसाइट्स) एंटीबॉडी को एक माउस की पूंछ की नस में रखे कैथेटर के माध्यम से अंतःशिरा (यानी) इंजेक्ट किया गया था। यह लेख इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन इमेजिंग को एक विकल्प के रूप में या आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले स्थैतिक एक्स विवो (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए विवो पूरक के रूप में पेश करता है ताकि धमनीजनन के लिए प्रासंगिक प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सके। सारांश में, यह पेपर धमनीजनन के हिंदलिम्ब मॉडल में प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी, रक्त प्रवाह और कतरनी तनाव की जांच करने के लिए विवो विधि में एक उपन्यास और गतिशील का वर्णन करता है, जो मूल्यांकन संभावनाओं को विशेष रूप से बढ़ाता है।
Introduction
हाल के वर्षों के दौरान गहन शोध रुचि के बावजूद, कार्डियोवैस्कुलर बीमारियां, जैसे, इस्केमिक हृदय रोग और स्ट्रोक, अभीभी मृत्यु का प्रमुख वैश्विक कारण हैं। इन बीमारियों के लिए वर्तमान उपचार अत्यधिक आक्रामक उपचार हैं जैसे कि पर्क्यूटेनियस ट्रांसल्यूमिनल एंजियोप्लास्टी, पर्क्यूटेनियस ट्रांसल्यूमिनल कोरोनरी एंजियोप्लास्टी, या बाईपास सर्जरी2। इसलिए, वैकल्पिक, गैर-इनवेसिव चिकित्सीय विकल्पों के विकास की तत्काल आवश्यकता है। शरीर स्टेनोसिस के बाहर के हिस्से में बाधित रक्त प्रवाह को पुनर्निर्देशित करने के लिए एक स्टेनोसेड या अवरुद्ध वाहिका के चारों ओर प्राकृतिक बाईपास बना सकता है। इस प्रक्रिया को धमनीजनन2 कहा जाता है। कई हालिया अध्ययनों से पता चला है कि द्रव कतरनी में वृद्धि ल्यूकोसाइट भर्ती को प्रभावित करती है, जो धमनीजनन3 के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट्स की भर्ती का विश्लेषण करने के लिए मुख्य वर्तमान विकल्प एक्स विवो (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण या फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) पद्धति4 हैं। धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट गतिशीलता के मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए, यह पेपर मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ एक इंट्रावाइटल इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।
ल्यूकोसाइट्स धमनीजनन की प्रक्रिया के दौरान भर्तीकी जाने वाली प्रमुख रक्त कोशिकाएं हैं। यह प्रोटोकॉल मल्टीफोटॉन इमेजिंग का उपयोग करता है ताकि संपार्श्विक धमनियों में इंजेक्टेड एंटी-सीडी 45-पीई एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए अनुयायी ल्यूकोसाइट्स के रेंगने को दिखाया जा सके, फेमोरल धमनी बंधाव (एफएएल) द्वारा धमनीजनन के प्रेरण के 24 घंटे बाद, एक मुराइन हिंदलिम्ब इस्किमिया मॉडल 5,6 का उपयोग करके। वैकल्पिक रूप से, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एक्स विवो लेबल किया जा सकता है और चूहों में सावधानीपूर्वक इंजेक्ट किया जा सकता है, जैसा कि इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी7 का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस पर अध्ययन में दिखाया गया है। वाहिकाओं और धमनियों के अंदर रक्त प्रवाह को सीडी 41-एफआईटीसी (प्लेटलेट्स लेबल करने के लिए), डेक्सट्रान-एफआईटीसी (प्लाज्मा), या दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) द्वारा देखा जा सकता है, जो संवहनी पेड़ के कुछ हिस्से के तहखाने झिल्ली में मौजूद कोलेजन टाइप 1 की कल्पना करता है। एसएचजी मल्टीफोटॉन उत्तेजना का एक अनूठा मुक्त लेबलिंग प्रभाव है। मल्टीफोटॉन इमेजिंग ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना और लेजर पावर उत्तेजना द्वारा कोशिकाओं को सक्रिय किए बिना दीर्घकालिक सेल ट्रैकिंग की अनुमति देता है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी जीवित जानवरों में फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं और संरचनाओं को देखने के लिए पसंद की इमेजिंग विधि है क्योंकि यह फ्लोरोफोर को ऊतक / अंगों में गहराई से उत्तेजित करने की क्षमता के कारणहै।
फेम्टोसेकंड अंतराल के भीतर वितरित दालों के साथ ट्यून किए गए इन्फ्रारेड लेजर का उपयोग केवल फोकल प्लेन पर फ्लोरोक्रोम को उत्तेजित करता है, जिसमें फोकल प्लेन8 के ऊपर और नीचे कोई उत्तेजना नहीं होती है। इस प्रकार, मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी अंगों के अंदर गतिशील जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उच्च स्थानिक-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन, कम फोटो-क्षति और ऊतक प्रवेश इमेजिंग में वृद्धि की अनुमति देता है। यह लाइव-पशु इमेजिंग के लिए एक आदर्श माइक्रोस्कोपी उपकरण है। हालांकि, मल्टीफोटॉन और इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी की कोई अन्य कला दिल की धड़कन, श्वसन, पेरिस्टाल्टिक आंदोलनों, मांसपेशियों की टोनैलिटी और अन्य शारीरिक कार्यों के कारण ऊतक गति से सीमित है, जो इमेजिंग अधिग्रहण और विश्लेषण को परेशान करती है। चूंकि ये आंदोलन अस्थायी और स्थानिक संकल्प को खराब करते हैं और कभी-कभी बाद के विश्लेषण को भी प्रतिबंधित करते हैं, इसलिए उन्हें सटीक डेटा विश्लेषण और व्याख्या को सक्षम करने के लिए उचित रूप से संबोधित किया जाना चाहिए। ऊतक गति से कलाकृतियों को कम करने या रोकने के लिए कई रणनीतियों का विकास किया गया है। यह प्रोटोकॉल छवि अधिग्रहण के दौरान ऊतक बहाव को सही करने के लिए VivoFollow9 नामक एक सीटू बहाव सुधार सॉफ्टवेयर लागू करता है। यह दृष्टिकोण आवश्यक छवि स्थिरीकरण प्रदान करता है, जो दीर्घकालिक इमेजिंग और सेल-ट्रैकिंग विश्लेषण को सक्षम करता है।
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Protocol
इस अध्ययन को बवेरियन पशु देखभाल और उपयोग समिति (नैतिक कोड द्वारा अनुमोदित: आरओबी-55.2वेट-2532.Vet_02-17-99) द्वारा अनुमोदित किया गया था; ये प्रयोग जर्मन पशु कानून दिशानिर्देशों के अनुसार सख्ती से किए गए थे।
1. पशु और ऊरु धमनी बंधाव (एफएएल)
नोट: बाँझ सूजन और धमनीजनन को प्रेरित करने के लिए, 8-10 सप्ताह के पुरुष C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया गया था। एफएएल या शाम सर्जरी के दौरान या बाद में क्रमशः किसी भी चूहे की मृत्यु नहीं हुई या घाव भरने में परेशानी नहीं हुई।
- संज्ञाहरण
नोट: एमएमएफ-मिक्स एनेस्थीसिया के इंजेक्शन से पहले, माउस के सोने तक 5% आइसोफ्लुरेन के साथ पहले एनेस्थेटाइज करने की सिफारिश की जाती है।- माउस का वजन करें और मिडाज़ोलम 5.0 मिलीग्राम / किग्रा, मेडेटोमिडीन 0.5 मिलीग्राम / किग्रा, और फेंटानिल 0.05 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक के साथ एमएमएफ मिश्रण तैयार करें।
- एमएमएफ-मिक्स के साथ 1 एमएल सिरिंज भरें और 30 ग्राम सुई का उपयोग करके 100 μL s.c. की अंतिम मात्रा इंजेक्ट करें (5% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण के बाद)।
- माउस को गर्म पैड पर रखें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज न हो जाए। टाइमर को 35 मिनट पर सेट करें। इस समय के बाद, एमएमएफ-मिश्रण की खुराक (50 μL) का आधा हिस्सा इंजेक्ट करें।
- माउस के पेडल और इंटरडिजिटल रिफ्लेक्सिस (दृढ़ पैर की अंगुली चुटकी द्वारा) का परीक्षण करके संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें।
नोट: प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति एनाल्जेसिया की पर्याप्त गहराई को इंगित करती है।
- फेमोरल आर्टरी लिगेशन (एफएएल)
नोट: बाँझ सर्जिकल उपकरणों और सीवन का उपयोग करें। खोलने से पहले और बंद होने के बाद कीटाणुनाशक के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें।- शारीरिक शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग प्लेट (35-37 डिग्री सेल्सियस) पर एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें। संज्ञाहरण के तहत आंखों के सूखने को रोकने के लिए प्रत्येक आंख पर आई क्रीम (डेक्सपैन्थेनॉल) लागू करें।
- रक्त प्रवाह और छिड़काव की जांच के लिए एफएएल से पहले और बाद में एनेस्थेटाइज्ड माउस को लेजर डॉपलर इमेजिंग (एलडीआई) कक्ष में स्थानांतरित करें (चित्रा 1 ए-सी)।
- बालों को हटाएं, त्वचा को कीटाणुरहित करें, और ऊरु धमनी तक पहुंचने के लिए एक कट बनाएं। एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, एक चोटी वाले रेशम सीवन (7-0) का उपयोग करके माउस हिंद अंग की दाईं ऊरु धमनी को अलग करें और आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए बाईं ऊरु धमनी पर एक दिखावटी ऑपरेशन करें जैसा कि पहले वर्णित6 (चित्रा 1 डी-के)।
नोट: त्वचा में चीरा छोटी कैंची के साथ किया गया था ताकि त्वचा के करीब रक्त वाहिकाओं को सीधी चोट से बचाया जा सके। - चोटी वाली रेशम सीवन (6-0) का उपयोग करके त्वचा को बंद करें। दर्द से राहत के लिए संज्ञाहरण का विरोध करने से पहले 10 मिनट से शुरू होने वाले हर 12 घंटे में ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) एस.सी. का उपयोग करें। दर्द के संकेतों के लिए जानवर का निरीक्षण करें, यानी, कम ग्रूमिंग गतिविधि, हिलने की अनिच्छा, या सर्जरी के बाद 24 घंटे के लिए झुकी हुई मुद्रा।
- एफएएल खत्म करने और त्वचा को बंद करने के बाद संज्ञाहरण को रोकने के लिए नालोक्सोन (1.2 मिलीग्राम / किग्रा), फ्लुमाजेनिल (0.5 मिलीग्राम / किग्रा), और एटिपामेज़ोल (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) का एक संयोजन इंजेक्ट करें।
- सर्जरी के बाद, माउस को गर्म पैड पर रखें और लगातार जानवर की निगरानी करें जब तक कि वह एक सीधा आसन बनाए रख सके और पिंजरे के चारों ओर सामान्य रूप से चलना शुरू न कर सके।
- जब माउस पूरी तरह से जाग जाता है, तो इसे अन्य चूहों के साथ पिंजरे में वापस रखें और पिंजरे को पशु आवास कक्ष में वापस कर दें।
2. मल्टीफोटॉन इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए ऊतक की तैयारी
- पूंछ की नस इंजेक्शन
नोट: इंट्रावाइटल इमेजिंग की तैयारी शुरू करने से पहले जानवर को संज्ञाहरण के तहत होना चाहिए। नस कैथेटर की सुई पेश करने से पहले, पूंछ पर त्वचा कीटाणुनाशक लगाने की सिफारिश की जाती है। यह जहाजों की कल्पना करने में भी मदद करेगा।- 2 x 30 ग्राम सुई, 10 सेमी एक बारीक बोर पॉलीथीन टयूबिंग (0.28 मिमी आंतरिक व्यास और 0.61 मिमी बाहरी व्यास), एक 1 एमएल सिरिंज, और एक हिस्टोक्रिल गोंद का उपयोग करके एक पूंछ शिरा इंजेक्शन कैथेटर तैयार करें ताकि माउस पूंछ पर कैथेटर को आगे के लिए ठीक किया जा सके यानी इमेजिंग के दौरान इंजेक्शन (चित्रा 2 ए, बी और चित्रा 2 एफ)।
- इंजेक्शन के लिए एंटीबॉडी समाधान तैयार करें: सीडी 45-पीई और सीडी 41-एफआईटीसी (20 μg / माउस) 100 μL की अंतिम मात्रा पर।
- पार्श्व स्थित पूंछ नसों के लिए पूंछ की जांच करें और पूंछ की नस की पहचान करने के लिए नस को बांध दें। पूंछ को कीटाणुरहित करें, नस कैथेटर डालें, और ऊतक हिस्टोक्रिल गोंद (चित्रा 2 बी) का उपयोग करके इसे ठीक करें।
- इमेजिंग से पहले (कम से कम 15 मिनट पहले) और ऊतक तैयार करने के बाद एंटीबॉडी इंजेक्ट करें।
- ऊतक की तैयारी
नोट: हमेशा एक गर्म पैड का उपयोग करें और ऊतक तैयार करने से पहले प्रत्येक आंख में आई क्रीम (डेक्सपैन्थेनॉल) की एक बूंद का प्रशासन करें। बाँझ सर्जिकल उपकरणों और सीवन का उपयोग करें। खोलने से पहले और बंद होने के बाद कीटाणुनाशक के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें।- एनेस्थेटाइज्ड माउस को एक स्थिर और पोर्टेबल पैड पर रखें। चिपकने वाला टेप (चित्रा 2 बी) का उपयोग करके पैड पर 4 बिंदु निर्धारण के साथ माउस को लापरवाह स्थिति में ठीक करें।
- मॉडलिंग मिट्टी के दो टुकड़ों को ढालें और टुकड़ों को माउस के ऊपरी पिछले अंग के नीचे रखें ताकि जोड़ की मांसपेशी की एक विमान स्थिति सुनिश्चित हो सके (चित्रा 2 बी, लाल तीर द्वारा इंगित)।
- माउस के 37 डिग्री सेल्सियस के स्थिर शरीर के तापमान को सुनिश्चित करने के लिए, माउस के साथ पैड को 0.64-4.0-गुना ज़ूम (चित्रा 1 एल) के साथ सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत हीटिंग प्लेट पर रखें।
- दोनों पैरों से बालों को हटा दें, त्वचा को कीटाणुरहित करें, और त्वचा को दाहिने पिछले अंग के पहले ऊरु धमनी बंधाव के निशान के चारों ओर एक सर्कल में काट लें (चित्रा 1 एम)।
- पैर के शीर्ष से त्वचा और वसा की परत को हटा दें (चित्रा 1 एन, ओ), और जोड़ की मांसपेशियों के चारों ओर एक जेब बनाने के लिए सीवन का उपयोग करके शेष त्वचा को एक तरफ खींचें (चित्रा 1 पी, क्यू)।
- जोड़ की मांसपेशियों और गहन धमनी / नस के साथ-साथ संपार्श्विक वाहिकाओं की स्पष्ट दृष्टि प्राप्त करने के लिए चमड़े के नीचे की वसा को हटा दें (चित्रा 1 क्यू, आर)।
- संपार्श्विक वाहिकाओं के शीर्ष पर सतही मांसपेशियों की परत को सावधानीपूर्वक हटाना शुरू करें, इसे ठीक बल (चित्रा 1 आर) के साथ सावधानीपूर्वक विच्छेदित करके।
नोट: संपार्श्विक धमनी और संपार्श्विक नस स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं और इमेजिंग के लिए तैयार हैं (चित्रा 1 एस)। - ऊतक के सूखने से बचने के लिए तैयार जेब को खारा से भरें और शाम संचालित बाएं हिंद अंग के लिए एक ही प्रक्रिया जारी रखें। इमेजिंग से पहले, दोनों जेबों में अल्ट्रासोनिक जेल जोड़ें, जो सूखने से बचाता है और उद्देश्य (चित्रा 2 सी और चित्रा 2 एफ) के साथ ऑप्टिकल युग्मन के लिए विसर्जन माध्यम के रूप में कार्य करता है।
3. इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी
- तैयारी
नोट: लंबी अवधि की इमेजिंग के दौरान जेब को फिर से भरने के लिए गर्म तापमान बनाए रखने के लिए माइक्रोस्कोप के इनक्यूबेटर कक्ष के अंदर अल्ट्रासोनिक जेल के साथ एक सिरिंज रखें।- दो तैयार जेबों से खारा निकालें और संपार्श्विक वाहिकाओं को कवर करने के लिए अल्ट्रासोनिक जेल के साथ बदलें (चित्रा 2 सी)।
- पूंछ शिरा कैथेटर के माध्यम से एंटीबॉडी समाधान इंजेक्ट करें। एंटीबॉडी इंजेक्शन के 15 मिनट बाद, पैड को निश्चित माउस के साथ गर्म मल्टीफोटॉन इमेजिंग चैंबर (चित्रा 2 एफ) में स्थानांतरित करें।
- छवि अधिग्रहण के पूरा होने के बाद, गहरे नार्कोसिस के तहत ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें।
- मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी छवि अधिग्रहण
नोट: लेजर स्थिरीकरण की अनुमति देने के लिए इमेजिंग से 30 मिनट पहले माइक्रोस्कोप चालू करें। माइक्रोस्कोप की सर्वोत्तम ऑप्टिकल स्थिरता के लिए, माइक्रोस्कोप कक्ष को स्थायी रूप से गर्म रखने की सिफारिश की जाती है।- टीआई: नीलम लेजर बॉक्स, इलेक्ट्रॉनिक इंटरफेस बॉक्स, इनक्यूबेशन कक्ष की हीटिंग इकाई, फ्लोरोसेंट लैंप और कंप्यूटर (चित्रा 2 डी, ई) की कुंजी चालू करें।
- अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (निरीक्षक सॉफ्टवेयर) लॉन्च करें। तरंगदैर्ध्य को 800 एनएम पर सेट करें और माइक्रोस्कोप शटर खोलें (चित्रा 3 ए ii)।
- मापन विज़ार्ड संवाद में, उपकरण मोड (एकल बीम) और मापन मोड (3D-स्कैन टाइम लैप्स) (चित्रा 3A i) में चुनें.
- एनेस्थेटाइज्ड माउस को माइक्रोस्कोप के पूर्व-गर्म इनक्यूबेशन कक्ष में स्थानांतरित करें। अल्ट्रासोनिक जेल (चरण 2.2.8) के साथ क्षेत्र को सीधे उद्देश्य फ्रंट लेंस (चित्रा 2 एफ) के संपर्क में रखें।
- एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप शटर खोलें, एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के तहत रक्त प्रवाह का पालन करके रुचि के क्षेत्र को खोजने के लिए एफआईटीसी विज़ुअलाइज़ेशन (4) के लिए पर्याप्त फ़िल्टर / डिक्रोइक सेटिंग चुनें। रुचि के क्षेत्र को दृश्य के केंद्र क्षेत्र में लाने के बाद, एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप शटर को बंद करें।
- xy-स्कैनर संवाद में, निम्न पैरामीटर सेट करें: छवि आकार (554x554), पिक्सेल (512x512), आवृत्ति (400), लाइन औसत (1) (चित्रा 3A iii). लेजर शक्ति (5%) समायोजित करें (चित्रा 3 ए iv), और चैनल हरे (66), लाल (66), और नीले (63) (चित्रा 3 ए वी) के लिए फोटोमल्टीप्लायर (पीएमटी) लाभ सेट करें।
- इंट्रावाइटल इमेजिंग और बहाव सुधार सेटिंग्स के लिए पर्याप्त उद्देश्य का चयन करें (3.2.11 में विवरण देखें)।
नोट: यहां, चयनित उद्देश्य Nikon LWD 16x (चित्रा 3A vi) था। - मापन विज़ार्ड संवाद विंडो (चित्रा 3A i) के ऊपरी दाएँ कोने पर लाल बटन दबाकर पूर्वावलोकन अधिग्रहण मोड प्रारंभ करके छवि स्टैक श्रेणी परिभाषित करें.
- एक अच्छी छवि प्राप्त करने के लिए ध्यान केंद्रित करके रुचि के क्षेत्र और संरचना को परिभाषित करें। फिर, स्क्रीन का अवलोकन करते समय, छवि गायब होने तक उद्देश्य को आगे बढ़ाकर फ़ोकस बदलें, और इसे शून्य (पहला = 0) के रूप में सेट करें। ऑब्जेक्टिव को नीचे ले जाकर विपरीत दिशा में फ़ोकस बदलें जब तक कि छवि फिर से स्क्रीन से गायब न हो जाए, और इसे अक्षीय दिशा में अंतिम (अंत = 40 μm) स्थिति के रूप में सेट करें (चित्रा 3A vii)।
- चरण आकार 2 μm पर सेट करें। पूर्वावलोकन स्कैनिंग को रोकने के लिए मापन विज़ार्ड संवाद के ऊपरी दाएँ कोने पर लाल बटन क्लिक करें.
नोट: छवियों की संख्या की गणना की जाएगी और स्वचालित रूप से सेट की जाएगी (21 छवियां), जैसा कि चित्रा 3 ए vii में दर्शाया गया है। - यदि माइक्रोस्कोप लाइव-ड्रिफ्ट सुधार9 से लैस है, तो बहाव सुधार सॉफ़्टवेयर (जैसे, VivoFollow) शुरू करें और नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
- मापन विज़ार्ड संवाद में, पहले अक्ष डिवाइस के रूप में पायथन अक्ष (पायथन Ax) (चित्रा 3A viii) चुनें; ऑटो सेव मोड को सक्रिय न करें। ऑटो सेव (एएस) बॉक्स को केवल समय अक्ष (समय समय) पर चेक करें। पायथन संवाद विंडो खोलने के लिए उपलब्ध डिवाइस विंडो (चित्रा 3A ix) पर पायथन आइकन दबाएँ।
- पायथन संवाद एक्सिस सेटिंग्स में, (0 शून्य) और प्रति (-40) दर्ज करें। चित्र 3A x में दर्शाए अनुसार चरणों की संख्या (21) दर्ज करें।
- xyz स्टेज Z संवाद विंडो पर जाएं और स्कैन रेंज को दोनों सिरों पर 200 μm तक बढ़ाएं: प्रारंभ में, दर्ज करें (200 μm) और अंत में, दर्ज करें (-240 μm), सीमा स्वचालित रूप से सेट हो जाएगी (-440 μm)। चरण आकार (2 μm) रखें जैसा कि चित्रा 3A xi में दिखाया गया है।
- VivoFollow Frontend संवाद खोलें और मोशन प्रोफ़ाइल बॉक्स (चित्रा 3A xii) क्लिक करें।
- निरीक्षक सॉफ़्टवेयर के मापन विज़ार्ड संवाद के ऊपरी बाएँ कोने में हरे रंग का तीर दबाकर छवि अधिग्रहण प्रारंभ करें (चित्र 3A i).
- यदि लाइव-ड्रिफ्ट सुधार का उपयोग किया जाता है, तो बहाव सुधार कॉन्फ़िगरेशन के लिए एक संवाद देखें जैसा कि चित्र 3A xiii में दिखाया गया है। अधिग्रहण चैनल सेट करें जिसे एक स्थिर लैंडमार्क संदर्भ के रूप में उपयोग किया जाएगा (इस प्रोटोकॉल के लिए, चैनल 2 चुनें, जहां संवहनी ट्रेसर सिग्नल रिकॉर्ड किया जाना है)। पहले और अंतिम z पदों (यहां, 200 μm) में जोड़े गए μm में अधिकतम सुधार ऑफसेट दर्ज करें और OK पर क्लिक करें।
- VivoFollow फ्रंटेड डायलॉग विंडो चित्रा 3A xiv में छवि अधिग्रहण के दौरान वास्तविक समय में x, y और z में वर्तमान बहाव ऑफसेट की निगरानी करें।
- ~ 35 मिनट के बाद इमेजिंग अधिग्रहण बंद करें जब संज्ञाहरण पुन: इंजेक्शन के एक और चक्र की आवश्यकता होती है। एमएमएफ-मिक्स (50 μl s.c) की आधी खुराक इंजेक्ट करें और हरे तीर को फिर से दबाकर इमेजिंग अधिग्रहण को फिर से शुरू करें (चरण 3.2.11.5)।
- प्रयोग समाप्त होने तक इस प्रक्रिया को दोहराएं।
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Representative Results
मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी ल्यूकोसाइट ट्रैकिंग के लिए एक उच्च स्थानिक-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है, जिसमें सेल माइग्रेशन चरणों और गति को ट्रैक और मॉनिटर किया जा सकता है (चित्रा 4 ए, बी)। हालांकि, नमूने की शारीरिक गति एक चुनौती है, खासकर दीर्घकालिक इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी छवि अधिग्रहण के लिए। इसलिए, ऊतक और उपकरणों को ठीक करने के लिए एक अच्छी ऊतक तैयारी और धारक, जैसे ऊतक बहाव के लिए वास्तविक समय इमेजिंग सुधार, सफल और स्थिर इमेजिंग अधिग्रहण के लिए आवश्यक हैं। यहां, एक लाइव-ड्रिफ्ट टूल, वीवोफॉलो, दीर्घकालिक इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान उत्पन्न ऊतक बहाव को सही करने के लिए नियोजित किया गया था।
इस उपकरण का आवेदन दीर्घकालिक छवि अधिग्रहण की अनुमति देता है और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा के संग्रह को सक्षम बनाता है, जो गति माप के लिए कोशिकाओं की ट्रैकिंग के लिए उपयुक्त है। जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, बहाव सुधार के बिना, रुचि का क्षेत्र धीरे-धीरे रिकॉर्डिंग दृश्य से दूर चला जाता है, जिससे गति विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को ट्रैक करने की क्षमता प्रभावित होती है। हालांकि, जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है, बहाव सुधार सॉफ्टवेयर के साथ, स्थिर फिल्मों को रिकॉर्ड किया जा सकता है, और लंबी अवधि में अधिक कोशिकाओं को ट्रैक किया जा सकता है। बहाव सुधार सॉफ्टवेयर समय के साथ एक्स, वाई और जेड ऑफसेट का विज़ुअलाइज़ेशन भी प्रदान कर सकता है जिसे सिस्टम ने ठीक किया है, जैसा कि चित्रा 3 डी में दिखाया गया है।
चित्रा 1: लेजर डॉपलर इमेजिंग सेटअप और इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए ऊरु धमनी बंधाव और ऊतक तैयारी के लिए तैयारी। (ए) एलडीआई इमेजिंग सेटअप। (बी) माउस छवि अधिग्रहण के लिए एलडीआई वार्मिंग कक्ष के अंदर रखा गया है। (सी) बंधाव के बाद हिंदलिंब छिड़काव की जांच करने के लिए एफएएल (निचले पैनल) से पहले और बाद में दाएं और बाएं पैरों की एलडीआई छवियां। दाईं ऊरु धमनी को बंद कर दिया गया था, जबकि बाईं ऊरु धमनी को शाम-संचालित (शाम) किया गया था और आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य किया गया था। रंग पट्टी में, नीला कम रक्त छिड़काव को इंगित करता है, और लाल उच्च छिड़काव को इंगित करता है। (D-K) छवियां ऊरु धमनी बंधाव के सर्जरी चरणों का प्रतिनिधित्व करती हैं। स्केल बार = 10 मिमी (एल-एस) एफएएल के बाद इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए ऊतक की तैयारी। छवि किए जाने वाले क्षेत्र को काले घेरे द्वारा इंगित किया जाता है, जहां संपार्श्विक वाहिकाएं स्थित हैं। स्केल बार = 5 मिमी। संक्षेप: एलडीआई = लेजर डॉपलर इमेजिंग; एफएएल = ऊरु धमनी बंधाव; ओसीसी = रोड़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: मल्टीफोटॉन इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए सेटअप। (ए) नस कैथेटर तैयारी; 1-10 सेमी, 2: 2 x 30 ग्राम सुई की बारीक पॉलीथीन टयूबिंग; 3: माउंटेड कैथेटर 1 एमएल सिरिंज से जुड़ा हुआ है; 4: ऊतक हिस्टोक्रिल गोंद; 5: सुई धारक। (बी) माउस को इमेजिंग के लिए तैयार काले मॉडलिंग मिट्टी (लाल तीर) के टुकड़ों पर रखे गए दोनों पिछले अंगों के साथ लापरवाह स्थिति में रखा गया है। (सी) ओक्लुडेड (ओसीसी) दाएं हिंदलिम्ब और बाएं, शाम-संचालित हिंदलिम्ब इमेजिंग के लिए तैयार हैं। (डी) मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप सेटअप जो इनक्यूबेटर कक्ष को गर्म करने के लिए लेजर बॉक्स, फ्लोरेसेंस लैंप बॉक्स, ट्यूब दिखाता है। (ई) मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप का इनक्यूबेटर कक्ष। (एफ) अल्ट्रासोनिक जेल से ढके ऊतक को छूने वाले 16x उद्देश्य के साथ माइक्रोस्कोप कक्ष के अंदर माउस रखा गया। एंटीबॉडी इंजेक्शन के लिए पूंछ की नस पर तय नस कैथेटर को दिखाने वाला विवरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: VivoFollow बहाव सुधार सॉफ्टवेयर सेटअप. (A) (i-xiv) प्रोटोकॉल चरण 3.2.2-3.2.11.9 में वर्णित सॉफ़्टवेयर सेटअप चरण. (बी) प्रतिनिधि समय श्रृंखला छवियां जो बहाव सुधार सॉफ्टवेयर को चालू किए बिना इमेजिंग बहती हुई दिखाती हैं। संपार्श्विक धमनी को सफेद बंद लाइनों (वीडियो 1 और वीडियो 2) द्वारा सीमांकित किया जाता है। (सी) इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान लाइव बहाव सुधार लागू होने पर स्थिर समय श्रृंखला दिखाने वाली प्रतिनिधि समय श्रृंखला छवियां। ल्यूकोसाइट्स को सीडी 45-पीई एंटीबॉडी (लाल) के साथ लेबल किया गया था, प्लेटलेट्स को सीडी 41-एफआईटीसी एंटीबॉडी (हरा) और एसजीएच (नीले) के साथ कोलेजन टाइप 1 द्वारा लेबल किया गया था। संपार्श्विक धमनी को सफेद बंद लाइनों द्वारा सीमांकित किया जाता है। (D) x, y और z दिशाओं के साथ लाइव सुधार दिखाने वाला रेखा चार्ट। संक्षेप: पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; एसजीएच = दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: प्रतिनिधि परिणाम । (ए) ल्यूकोसाइट गति को शाम-संचालित (शाम) और ऊरु धमनी-लिगेटेड हिंदलिम्ब्स की संपार्श्विक धमनियों में मापा जाता है। (बी) प्रतिनिधि छवियां पटरियों को रंग-कोडित के साथ ट्रैक (मैजेंटा) दिखाती हैं। रंग कोड बार नीले ट्रैक द्वारा दिखाए गए धीमी कोशिकाओं और लाल पटरियों के साथ तेज कोशिकाओं के साथ सेल की गति का प्रतिनिधित्व करता है। ल्यूकोसाइट्स को इंजेक्शन सीडी 45-पीई एंटीबॉडी (लाल) के साथ लेबल किया गया था, प्लेटलेट्स को इंजेक्शन सीडी 41-एफआईटीसी एंटीबॉडी (हरा), और कोलेजन टाइप 1 को एसजीएच (नीला) के साथ लेबल किया गया था। तीन अलग-अलग प्रयोगों के परिणाम। स्केल बार = 20 μm। वीडियो 3 और वीडियो 4 देखें। संक्षेप: ओसीसी = ऑक्लुडेड / फेमोरल धमनी-लिगेटेड; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; एसजीएच = दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वीडियो 1: बहाव सुधार के बिना संपार्श्विक धमनी की मल्टीफोटॉन इंट्रावाइटल इमेजिंग। चार-आयामी छवियों को 554 x 554 μm के पिक्सेल आकार, आवृत्ति 600 हर्ट्ज, 1100 ms / frame, 2 μm के चरण आकार और 40 μm की सीमा के साथ दर्ज किया गया था। वीडियो में वीवोफॉलो ड्रिफ्ट करेक्शन सॉफ्टवेयर के एप्लिकेशन के बिना छवि को बहते हुए दिखाया गया है। संपार्श्विक धमनी को वीडियो के निचले हिस्से में दिखाया गया है, और संपार्श्विक नस फिल्म के ऊपरी हिस्से में 3 मिनट के बाद दिखाई देती है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 2: लागू बहाव सुधार के साथ एक संपार्श्विक धमनी की मल्टीफोटॉन इंट्रावाइटल इमेजिंग। चार-आयामी छवियों को 554 x 554 μm के पिक्सेल आकार, आवृत्ति 600 हर्ट्ज, 1100 ms / frame, 2 μm के चरण आकार और 40 μm की सीमा के साथ लिया गया था। वीडियो को लाइव ड्रिफ्ट करेक्शन सॉफ्टवेयर, वीवोफॉलो के साथ रिकॉर्ड किया गया था, और ड्रिफ्ट करेक्शन सॉफ्टवेयर को लागू करके प्रचारित इमेजिंग स्थिरता को दर्शाता है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 3: शाम ऑपरेशन के बाद एक संपार्श्विक धमनी में सेल-ट्रैकिंग इमेजिंग। इंजेक्शन एंटी-सीडी 45-पीई एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए ल्यूकोसाइट्स को शाम-संचालित पैर की एक आराम करने वाली संपार्श्विक धमनी में चित्रित किया गया था और कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए प्लगइन के साथ इमरिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ट्रैक किया गया था। ट्रैक की गई कोशिकाओं का चयन किया गया और मैजेंटा डॉट्स द्वारा दर्शाया गया। ट्रैक सेल की गति के अनुसार रंग-कोडित थे। धीमी कोशिकाओं को नीले ट्रैक द्वारा और तेज कोशिकाओं को लाल पटरियों द्वारा दर्शाया जाता है। स्केल बार = 50 μm। संक्षिप्त नाम = पीई = फाइकोएरिथ्रिन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
वीडियो 4: एफएएल के बाद एक संपार्श्विक धमनी में सेल-ट्रैकिंग इमेजिंग। एंटी-सीडी 45-पीई एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए ल्यूकोसाइट्स को एफएएल द्वारा धमनीजनन के प्रेरण के 24 घंटे बाद एक बढ़ती संपार्श्विक धमनी में चित्रित किया गया था और कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए प्लगइन के साथ इमरिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ट्रैक किया गया था। ट्रैक की गई कोशिकाओं का चयन किया गया और मैजेंटा डॉट्स द्वारा दर्शाया गया। ट्रैक सेल की गति के अनुसार रंग-कोडित थे। धीमी कोशिकाओं को नीले ट्रैक द्वारा और तेज कोशिकाओं को लाल पटरियों द्वारा दर्शाया जाता है। स्केल बार = 50 μm। संक्षेप: एफएएल = ऊरु धमनी बंधाव; पीई = फाइकोएरिथ्रिन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
| तकनीकी समस्याएं | प्रस्तावित समाधान | |
| यदि कैथेटर पेश करने के लिए पूंछ वाहिकाएं दिखाई नहीं दे रही हैं | • स्थानीय वासोडिलेशन को बढ़ावा देने के लिए 3-5 मिनट के लिए माउस पूंछ के आसपास एक गर्म संपीड़न का उपयोग करें। यह नस को दृश्यमान बनाने में मदद करेगा। | |
| यदि एंटीबॉडी इंजेक्शन के लिए पूंछ कैथेटर तय नहीं किया जा सकता है। | • नस में पेश करने के लिए 30 ग्राम सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें और इमेजिंग से पहले सीधे एंटीबॉडी और रंजक इंजेक्ट करें। | |
| • कुछ मामलों में (एंटीबॉडी के आधार पर) इंजेक्शन को इमेजिंग से 1 घंटे पहले लागू किया जा सकता है। | ||
| जब ऊतक की गति इमेजिंग स्थिरता में बाधा डालती है | • शारीरिक पेट के आंदोलनों से बचने के लिए माउस के ऊपरी संकेत पैर को फिर से स्थापित करने और फिर से ठीक करने का प्रयास करें। | |
| • जांचें कि क्या माइक्रोस्कोप तालिका में कंपन को रद्द करने के लिए पर्याप्त हवा है। | ||
| • सुनिश्चित करें कि माउस गहरी संज्ञाहरण में है और जागता नहीं है। | ||
| • माउस की श्वास की निगरानी करें। जब माउस बहुत तेजी से सांस ले रहा है, तो यह इमेजिंग गति पर प्रभाव डाल सकता है। | ||
| जब छवि की गुणवत्ता कम होने लगती है | • सुनिश्चित करें कि अल्ट्रासोनिक जेल सूख न जाए। | |
| • अल्ट्रासोनिक जेल को फिर से भरें। | ||
| • सुनिश्चित करें कि उद्देश्य साफ है (जब भी एक नया पुन: भरने किया जाता है तो उद्देश्य पर सूखे अल्ट्रासोनिक जेल को साफ करें)। | ||
| जब इमेजिंग की तैयारी के दौरान धमनियां क्षतिग्रस्त हो जाती हैं | • इस मामले में, छवियों को प्राप्त करना संभव नहीं होगा। प्रयोग चलाना संभव नहीं है। | |
तालिका 1: समस्या निवारण.
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Discussion
ल्यूकोसाइट भर्ती के विवो विश्लेषण में मल्टीफोटॉन की वर्णित विधि ल्यूकोसाइट भर्ती अध्ययन जैसे (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल या एफएसीएस विश्लेषण के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के अतिरिक्त का प्रतिनिधित्व करती है। इस इमेजिंग विधि के साथ, धमनीजनन10 के दौरान ल्यूकोसाइट पालन और बहिर्वाह में गतिशील प्रक्रियाओं को अधिक विस्तार से कल्पना करना संभव है। इस विधि के अतिरिक्त मूल्य के बावजूद, प्रस्तावित प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम और सीमाएं शामिल हैं। अधिक समस्या निवारण युक्तियों के लिए तालिका 1 देखें। संपार्श्विक धमनियों पर सतही मांसपेशियों की परत को हटाने के दौरान, ये धमनियां क्षतिग्रस्त हो सकती हैं और इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए उपयोगी नहीं होंगी। एंटीबॉडी इंजेक्शन के लिए कैथेटर को अच्छी तरह से तय किया जाना चाहिए; अन्यथा, पूंछ की नस कैथेटर के फिसलने से पूंछ के पेरिवास्कुलर स्पेस में एंटीबॉडी का बहिर्वाह हो सकता है, जो एंटीबॉडी के इंजेक्शन के लिए प्रतिस्थापन और अतिरिक्त सुधार को एक चुनौतीपूर्ण कार्य बनाता है। इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी के दौरान संपार्श्विक धमनी और संपार्श्विक नस की सही पहचान इस प्रोटोकॉल के एक और महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करती है।
यह देखते हुए कि इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी के दौरान माउस यांत्रिक रूप से हवादार नहीं होता है, अत्यधिक लंबे संज्ञाहरण के परिणामस्वरूप माउस को शारीरिक चोट से बचने के लिए गतिशील इमेजिंग समय सीमित होता है। इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी की कमियों में से एक माउस फिजियोलॉजिकल गति है, जो श्वसन, दिल की धड़कन और पेरिस्टाल्टिक आंदोलनों से उत्पन्न होती है, जो छवि अधिग्रहण को प्रभावित कर सकती है और इसलिए, डेटा विश्लेषण की गुणवत्ता। ऊतक धारकों में सुधार, माउंटिंग और निर्धारण ऐसे कदम हैं जो गति के प्रभाव को और कम करते हैं। शारीरिक गति के अलावा, दीर्घकालिक इमेजिंग इमेजिंग के दौरान बहने वाले ऊतक में योगदान कर सकती है। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, एक वास्तविक समय ऊतक बहाव सुधार सॉफ्टवेयर, VivoFollow, बाद में सेल ट्रैकिंग और सेल गति विश्लेषण के लिए उपयुक्त इमेजिंग डेटा प्राप्त करने के लिए नियोजित किया गया था। यह VivoFollow सॉफ्टवेयर छवि अधिग्रहण के दौरान सीधे x, y और z में नमूना विस्थापन के लिए सही करता है। यह स्थिर शारीरिक संरचना पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, जब वाहिकाओं को संवहनी ट्रेसर के साथ देखा जाता है जो सुधार प्रक्रिया के लिए संदर्भ स्थलों के रूप में काम करते हैं।
यद्यपि अन्य पोस्ट-अधिग्रहण बहाव सुधार उपकरण उपलब्ध हैं, जैसे कि बिटप्लेन इमारिस या इमेजजे के लिए प्लगइन्स, वे सुधार के लिए अपनी क्षमता में बहुत सीमित हैं क्योंकि वे रुचि के क्षेत्र की बहाली की अनुमति नहीं देते हैं। सिद्धांत रूप में, वे गंभीर ऑफसेट के लिए सही नहीं कर सकते हैं जब हित का क्षेत्र दृश्य के क्षेत्र से बाहर चला जाता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को तब भी लागू किया जा सकता है जब लाइव-ड्रिफ्ट सुधार अनुपलब्ध हो, और अधिग्रहण के बाद सुधार आवश्यक हो जाता है। हालांकि, इसके लिए ऊतक चढ़ाने और निर्धारण में कर्मियों के लगातार प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। निष्कर्ष में, मल्टीफोटॉन इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी एक उपयोगी गतिशील विधि है जिसे ल्यूकोसाइट भर्ती के गतिशील घटकों की अधिक विस्तृत तस्वीर प्राप्त करने के लिए (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण जैसे स्थिर स्थापित तरीकों के समानांतर लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
अध्ययन को डॉयचे फोर्सचुंगस्जेमिनशाफ्ट एसएफबी 914 (एचआई-ए / एसएम, प्रोजेक्ट जेड 01) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ सुज़ैन स्टट को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
