Summary
Рекрутирование лейкоцитов и тромбоцитов является важным компонентом, необходимым для эффективного роста коллатеральных артерий во время артериогенеза. Многофотонная микроскопия является эффективным инструментом для отслеживания клеточной динамики с высоким пространственно-временным разрешением in vivo и меньшей фототоксичностью для изучения рекрутирования и экстравазации лейкоцитов во время артериогенеза.
Abstract
Артериогенез сильно зависит от рекрутирования лейкоцитов и тромбоцитов в периваскулярное пространство растущих коллатеральных сосудов. Стандартным подходом к анализу коллатеральных артерий и лейкоцитов в артериогенезе является ex vivo (иммуно-) гистологическая методология. Однако этот метод не позволяет измерять динамические процессы, такие как кровоток, напряжение сдвига, межклеточные взаимодействия и скорость частиц. В данной работе представлен протокол мониторинга процессов in vivo в растущих коллатеральных артериях во время артериогенеза с использованием прижизненной визуализации. Описанный здесь метод является надежным инструментом для измерения динамики и предлагает высококонтрастный анализ с минимальной фотоцитотоксичностью, обеспечиваемый многофотонной возбуждающей микроскопией. До анализа растущих коллатеральных артерий артериогенез индуцировался в приводящей мышце мышей односторонней перевязкой бедренной артерии.
После перевязки ранее существовавшие коллатеральные артерии начали расти из-за повышенного напряжения сдвига. Через двадцать четыре часа после операции кожа и подкожно-жировая клетчатка над коллатеральными артериями были удалены, образовав карман для дальнейших анализов. Чтобы визуализировать кровоток и иммунные клетки во время визуализации in vivo , антитела CD41-флуоресцеина изотиоцианата (FITC) (тромбоциты) и CD45-фикоэритрин (ПЭ) (лейкоциты) вводили внутривенно (в/в) через катетер, помещенный в хвостовую вену мыши. В этой статье представлена прижизненная многофотонная визуализация в качестве альтернативы или дополнения in vivo к обычно используемым статическим (иммуно-) гистологическим анализам ex vivo для изучения процессов, имеющих отношение к артериогенезу. Таким образом, в этой статье описывается новый и динамичный метод in vivo для исследования трафика иммунных клеток, кровотока и напряжения сдвига в модели артериогенеза задних конечностей, что значительно расширяет возможности оценки.
Introduction
Несмотря на интенсивный исследовательский интерес в последние годы, сердечно-сосудистые заболевания, например, ишемическая болезнь сердца и инсульт, по-прежнему являются ведущей глобальной причиной смерти1. Современные методы лечения этих заболеваний представляют собой высокоинвазивные методы лечения, такие как чрескожная транслюминальная ангиопластика, чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика или шунтирование2. Поэтому срочно необходима разработка альтернативных, неинвазивных терапевтических вариантов. Организм может создавать естественные обходы вокруг стенозированного или закупоренного сосуда, чтобы перенаправить прерванный кровоток в дистальную часть стеноза. Этот процесс называется артериогенезом2. Многие недавние исследования показали, что повышенный сдвиг жидкости влияет на рекрутирование лейкоцитов, что играет важную роль во время артериогенеза3. Основными современными вариантами анализа рекрутирования лейкоцитов во время артериогенеза являются гистологические анализы ex vivo (иммуно-) или методология сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS)4. Для оценки динамики лейкоцитов во время артериогенеза в данной работе представлен протокол прижизненной визуализации с многофотонной микроскопией.
Лейкоциты являются основными клетками крови, набираемыми в процессе артериогенеза3. В этом протоколе используется многофотонная визуализация, чтобы показать ползание адгезивных лейкоцитов, меченных инъецированными антителами против CD45-PE, в коллатеральных артериях через 24 часа после индукции артериогенеза с помощью перевязки бедренной артерии (FAL) с использованием моделиишемии задних конечностей мыши 5,6. В качестве альтернативы, иммунные клетки могут быть помечены ex vivo и осторожно введены мышам, как показано в исследованиях ангиогенеза с использованием прижизненной микроскопии7. Кровоток внутри сосудов и артерий может быть визуализирован с помощью CD41-FITC (для маркировки тромбоцитов), декстрана-FITC (плазма) или с помощью генерации второй гармоники (SHG), которая визуализирует коллаген типа 1, присутствующий в базальной мембране некоторой части сосудистого дерева. ГСП – это уникальный свободный меченый эффект многофотонного возбуждения. Многофотонная визуализация позволяет осуществлять долгосрочное отслеживание клеток, не повреждая ткани и не активируя клетки путем возбуждения лазерной энергии. Многофотонная микроскопия является предпочтительным методом визуализации для визуализации флуоресцентно меченных клеток и структур у живых животных из-за ее способности возбуждать флуорофоры глубже в ткани/органы с минимальной фототоксичностью8.
Использование настроенных инфракрасных лазеров с импульсами, доставляемыми в фемтосекундных интервалах, возбуждает флуорохром только в фокальной плоскости, без возбуждения выше и ниже фокальной плоскости8. Таким образом, многофотонная микроскопия обеспечивает высокое пространственно-временное разрешение, меньшее количество фотоповреждений и увеличенную визуализацию проникновения в ткани для изучения динамических биологических событий внутри органов. Это идеальный инструмент микроскопии для визуализации живых животных. Однако многофотонная и любая другая техника прижизненной микроскопии ограничена движением тканей из-за сердцебиения, дыхания, перистальтических движений, тонуса мышц и других физиологических функций, что нарушает получение и анализ изображений. Поскольку эти перемещения ухудшают временное и пространственное разрешение, а иногда даже препятствуют последующему анализу, они должны быть надлежащим образом устранены, чтобы обеспечить точный анализ и интерпретацию данных. Было разработано несколько стратегий для снижения или предотвращения артефактов от движения тканей. Этот протокол применяет программное обеспечение для коррекции дрейфа in situ под названием VivoFollow9 для коррекции дрейфа тканей во время получения изображения. Такой подход обеспечивает необходимую стабилизацию изображения, позволяя проводить долгосрочную визуализацию и анализ отслеживания клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено Баварским комитетом по уходу за животными и их использованию (одобрено этическим кодексом: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); эти эксперименты проводились в строгом соответствии с руководящими принципами немецкого законодательства о животных.
1. Животные и перевязка бедренной артерии (FAL)
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вызвать стерильное воспаление и артериогенез, использовали 8-10-недельных мышей-самцов C57BL / 6J. Ни одна из мышей не умерла и не пострадала от раневой инфекции или нарушения заживления ран во время или после FAL или фиктивной операции, соответственно.
- Анестезия
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением ММФ-микс анестезии рекомендуется сначала обезболить 5% изофлураном, пока мышь не уснет.- Взвесьте мышь и приготовьте смесь ММФ с дозой мидазолама 5,0 мг/кг, медетомидина 0,5 мг/кг и фентанила 0,05 мг/кг.
- Наполните шприц объемом 1 мл смесью ММФ и введите конечный объем 100 мкл.к. с помощью иглы 30 г (после анестезии 5% изофлураном).
- Положите мышь на теплую подушечку и подождите, пока мышь полностью обезболиется. Установите таймер на 35 минут. По истечении этого времени вводят/к половину дозы (50 мкл) ММФ-смеси.
- Проверьте глубину анестезии, проверив педальные и межпальцевые рефлексы (путем сильного защемления пальца ноги) мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие ответа указывает на адекватную глубину обезболивания.
- Перевязка бедренной артерии (FAL)
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные хирургические инструменты и швы. Продезинфицируйте кожу дезинфицирующим средством перед открытием и после закрытия.- Поместите мышь, находящуюся под наркозом, на нагревательную пластину (35-37 °C) для поддержания физиологической температуры тела. Нанесите крем для глаз (декспантенол) на каждый глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз под наркозом.
- Переведите анестезированную мышь в камеру лазерной допплерографии (LDI) до и после FAL, чтобы проверить кровоток и перфузию (рис. 1A-C).
- Удалите волосы, продезинфицируйте кожу и сделайте разрез для доступа к бедренной артерии. Под хирургическим микроскопом перевязать правую бедренную артерию задней конечности мыши с помощью плетеного шелкового шва (7-0) и выполнить фиктивную операцию на левой бедренной артерии, которая будет служить внутренним контролем, как описаноранее 6 (рис. 1D-K).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез на коже был сделан маленькими ножницами, чтобы избежать прямого повреждения кровеносных сосудов, близких к коже. - Закройте кожу с помощью плетеного шелкового шва (6-0). Вводят бупренорфин (0,1 мг/кг)/к каждые 12 ч, начиная с 10 мин, до антагонизма анестезии для облегчения боли. Наблюдайте за животным на предмет признаков боли, т. е. снижения активности груминга, нежелания двигаться или сгорбленной осанки в течение 24 часов после операции.
- Вводят (/к) комбинацию налоксона (1,2 мг/кг), флумазенила (0,5 мг/кг) и атипамезола (2,5 мг/кг), чтобы противодействовать анестезии после завершения FAL и закрытия кожи.
- После операции держите мышь на теплой подушке и постоянно следите за животным, пока оно не сможет сохранять вертикальное положение и не начнет нормально ходить по клетке.
- Когда мышь полностью проснулась, поместите ее обратно в клетку вместе с другими мышами и верните клетку в комнату для содержания животных.
2. Подготовка тканей к многофотонной прижизненной визуализации
- Инъекция в хвостовую вену
ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно находиться под наркозом перед началом подготовки к прижизненной визуализации. Перед введением иглы венозного катетера рекомендуется нанести на хвост дезинфицирующее средство для кожи. Это также поможет визуализировать сосуды.- Подготовьте катетер для инъекции в хвостовую вену, используя иглу 2 x 30 G, 10 см полиэтиленовой трубки с тонким отверстием (внутренний диаметр 0,28 мм и внешний диаметр 0,61 мм), шприц объемом 1 мл и гистоакриловый клей для фиксации катетера на хвосте мыши для дальнейших внутривенных инъекций во время визуализации (рис. 2A, B и рис. 2F).
- Приготовьте раствор антител для внутривенной инъекции: CD45-PE и CD41-FITC (20 мкг/мышь) в конечном объеме 100 мкл.
- Проверьте хвост на наличие боковых хвостовых вен и запрудите вену, чтобы определить хвостовую вену. Продезинфицируйте хвост, вставьте венозный катетер и зафиксируйте его с помощью тканевого гистоакрилового клея (рис. 2B).
- Вводите антитела до визуализации (не менее чем за 15 минут) и после завершения подготовки тканей.
- Подготовка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте теплую подушечку и вводите каплю крема для глаз (декспантенола) в каждый глаз перед подготовкой тканей. Используйте стерильные хирургические инструменты и швы. Продезинфицируйте кожу дезинфицирующим средством перед открытием и после закрытия.- Поместите анестезированную мышь на устойчивую и портативную подушечку. Зафиксируйте мышь в положении лежа на спине с 4-точечной фиксацией на подушечке с помощью скотча (рис. 2Б).
- Сформируйте два кусочка пластилина и поместите кусочки под верхнюю заднюю конечность мыши, чтобы обеспечить ровное положение приводящей мышцы (рис. 2B, обозначен красными стрелками).
- Чтобы обеспечить стабильную температуру тела мыши 37 °C, поместите подушечку с мышью на нагревательную пластину под хирургическим микроскопом с 0,64-4,0-кратным зумом (рис. 1L).
- Удалите волосы с обеих ног, продезинфицируйте кожу и разрежьте кожу по кругу вокруг рубца от более ранней перевязки бедренной артерии правой задней конечности (рис. 1M).
- Удалите кожу и жировой слой с верхней части ноги (рис. 1N, O) и оттяните оставшуюся кожу с помощью швов, чтобы создать карман вокруг приводящей мышцы (рис. 1P, Q).
- Удалите подкожный жир, чтобы получить четкое представление о приводящей мышце и глубокой артерии/вене, а также о коллатеральных сосудах (рис. 1Q, R).
- Осторожно начните удаление поверхностного мышечного слоя поверх коллатеральных сосудов, осторожно рассекая его тонкими щипцами (рис. 1R).
ПРИМЕЧАНИЕ: Коллатеральная артерия и коллатеральная вена хорошо видны и готовы к визуализации (рис. 1S). - Наполните подготовленный карман физиологическим раствором, чтобы избежать высыхания ткани, и продолжите ту же процедуру для фиктивно прооперированной левой задней конечности. Перед визуализацией добавьте ультразвуковой гель в оба кармана, который предотвращает высыхание и служит иммерсионной средой для оптического соединения с объективом (рис. 2C и рис. 2F).
3. Прижизненная многофотонная микроскопия
- Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите шприц с ультразвуковым гелем внутри камеры инкубатора микроскопа, чтобы поддерживать теплую температуру для наполнения карманов во время длительной визуализации.- Извлеките физиологический раствор из двух подготовленных карманов и замените его ультразвуковым гелем, чтобы покрыть коллатеральные сосуды (рис. 2C).
- Вводят раствор антител через катетер хвостовой вены. Через 15 минут после инъекции антитела перенесите подушечку с неподвижной мышью в нагретую многофотонную камеру визуализации (рис. 2F).
- После завершения получения изображения усыпьте мышь вывихом шейки матки под глубоким наркозом.
- Получение изображений с помощью многофотонной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Включите микроскоп за 30 минут до получения изображения, чтобы обеспечить лазерную стабилизацию. Для достижения наилучшей оптической стабильности микроскопа рекомендуется постоянно нагревать камеру микроскопа.- Включите ключ лазерной коробки Ti:Sapphire, блоки электронных интерфейсов, нагревательный блок инкубационной камеры, люминесцентную лампу и компьютер (рис. 2D, E).
- Запустите программное обеспечение для сбора данных (программное обеспечение Inspector). Установите длину волны на 800 нм и откройте затвор микроскопа (рис. 3A ii).
- В диалоговом окне Measurement Wizard (Мастер измерений) выберите Instrument Mode (Single beam) и ( Measurement Mode (3D-scan Timelapse) (рисунок 3A i).
- Перенесите анестезированную мышь в предварительно подогретую инкубационную камеру микроскопа. Расположите область с ультразвуковым гелем (этап 2.2.8) непосредственно в контакте с передней линзой объектива (рис. 2F).
- Откройте затвор эпифлуоресцентного микроскопа, выберите адекватную настройку фильтра/дихроичности для визуализации FITC (4), чтобы найти интересующую область, проследив за кровотоком при эпифлуоресцентном освещении. После того, как область интереса окажется в центре поля зрения, закройте затвор эпифлуоресцентного микроскопа.
- В диалоговом окне xy-Scanner задайте следующие параметры: Размер изображения (554x554), Пиксель (512x512), Частота (400), Среднее значение строки (1) (рис. 3A iii). Отрегулируйте мощность лазера (5%) (рис. 3A iv) и установите коэффициент усиления фотоумножителя (ФЭУ) для зеленых (66), красных (66) и синих (63) каналов (рис. 3A v).
- Выберите адекватный объектив для прижизненной визуализации и настройки коррекции дрейфа (см. подробности в 3.2.11).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь выбран объектив Nikon LWD 16x (рис. 3A vi). - Определите диапазон стека изображений, запустив режим предварительного просмотра , нажав красную кнопку в правом верхнем углу диалогового окна Measurement Wizard (рисунок 3A i).
- Определите интересующую область и структуру, сфокусировавшись, чтобы получить хорошее изображение. Затем, наблюдая за экраном, измените фокус, перемещая объектив вверх, пока изображение не исчезнет, и установите его равным нулю (первый = 0). Измените фокус в противоположном направлении, перемещая объектив вниз до тех пор, пока изображение снова не исчезнет с экрана, и установите его в качестве последнего (конец = 40 мкм) положения в осевом направлении (рис. 3A vii).
- Установите размер шага 2 мкм. Нажмите красную кнопку в правом верхнем углу диалогового окна «Мастер измерений », чтобы остановить предварительный просмотр сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество изображений будет рассчитано и установлено автоматически (21 изображение), как показано на рисунке 3A vii. - Если микроскоп оснащен функцией коррекции дрейфа в реальном времени9, запустите программное обеспечение для коррекции дрейфа (например, VivoFollow) и выполните шаги, описанные ниже.
- В диалоговом окне «Мастер измерений» выберите ось Python (Python Ax) (рис. 3A viii) в качестве устройства первой оси; НЕ активируйте режим автосохранения. Установите флажок автосохранения (AS) только на оси времени (Time Time). Нажмите на иконку Python в окне Available Devices (рисунок 3A ix), чтобы открыть диалоговое окно Python.
- В диалоговом окне Python «Настройки оси» введите «От» (0 ноль) и «До» (-40). Введите количество шагов (21), как показано на рисунке 3A x.
- Перейдите в диалоговое окно xyz Stage Z и увеличьте диапазон сканирования на 200 мкм на обоих концах: в поле « Пуск» введите (200 мкм) и в поле «Конец» введите (-240 мкм), диапазон будет установлен автоматически (-440 мкм). Сохраняйте размер шага (2 мкм), как показано на рисунке 3A xi.
- Откройте диалог VivoFollow Frontend и нажмите на поле Motion Profile (рисунок 3A xii).
- Начните получение изображения, нажав зеленую стрелку в верхнем левом углу диалогового окна Measurement Wizard программного обеспечения Inspector (рисунок 3A i).
- Если используется коррекция дрейфа в реальном времени, найдите диалоговое окно для конфигурации коррекции дрейфа, как показано на рисунке 3A xiii. Установите канал сбора, который будет использоваться в качестве неподвижного ориентира (для этого протокола выберите канал 2, по которому будет записываться сигнал сосудистого индикатора). Введите максимальное смещение коррекции в мкм, которое было добавлено к первой и последней позициям z (здесь 200 мкм), и нажмите кнопку «ОК».
- Отслеживайте смещение смещения тока в x, y и z в режиме реального времени во время получения изображения в диалоговом окне VivoFollow Рисунок 3A xiv.
- Прекратите получение изображений через ~ 35 минут, когда требуется еще один цикл повторной инъекции анестезии. Введите половину дозы смеси MMF (50 мкл s.c.) и снова начните получение изображения, снова нажав на зеленую стрелку (этап 3.2.11.5).
- Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока эксперимент не будет завершен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Многофотонная микроскопия обеспечивает высокое пространственно-временное разрешение для отслеживания лейкоцитов, при этом можно отслеживать и контролировать этапы и скорость миграции клеток (рис. 4A, B). Тем не менее, физиологическое движение образца представляет собой проблему, особенно для долгосрочного получения изображений с помощью прижизненной микроскопии. Таким образом, для успешного и стабильного получения изображений требуется хорошая подготовка тканей и держатели для фиксации ткани, а также инструменты, такие как коррекция изображения в реальном времени для дрейфа тканей. Здесь был использован инструмент живого дрейфа VivoFollow для коррекции дрейфа тканей, возникающего во время долгосрочного получения изображений.
Применение этого инструмента позволяет получать изображения в течение длительного времени и позволяет собирать высококачественные данные, подходящие для отслеживания ячеек для измерения скорости. Как показано на рисунке 3B, без коррекции дрейфа интересующая область постепенно отдаляется от вида записи, влияя на способность отслеживать ячейки для анализа скорости. Однако, как показано на рисунке 3C, с помощью программного обеспечения для коррекции дрейфа можно записывать стабильные видеоролики и отслеживать больше ячеек в течение длительного периода времени. Программное обеспечение для коррекции дрейфа также может обеспечить визуализацию смещений x, y и z с течением времени, которые система скорректировала, как показано на рисунке 3D.
Рисунок 1: Настройка лазерной допплерографии и подготовка к перевязке бедренной артерии и подготовка тканей к прижизненной визуализации. (A) Установка визуализации LDI. (B) Мышь помещается в нагревательную камеру LDI для получения изображения. (C) Изображения LDI правой и левой ног до (верхняя панель) и после FAL (нижняя панель) для проверки перфузии задних конечностей после перевязки. Правая бедренная артерия была перевязана/закупорена, в то время как левая бедренная артерия была фиктивно прооперирована (фиктивная) и служила внутренним контролем. На цветовой шкале синий цвет указывает на низкую перфузию крови, а красный - на более высокую перфузию. (Д-К) На снимках представлены этапы операции перевязки бедренной артерии. Масштабная линейка = 10 мм. (L-S) Подготовка тканей для прижизненной визуализации после FAL. Область, подлежащая изображению, обозначена черным кругом, где расположены коллатеральные сосуды. Масштабная линейка = 5 мм. Сокращения: LDI = лазерная допплеровская визуализация; FAL = перевязка бедренной артерии; ОКК = окклюзия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Установка для многофотонной прижизненной визуализации. а) подготовка венозного катетера; 1-Тонкая полиэтиленовая трубка 10 см, 2: 2x игла 30 г; 3: установленный катетер, соединенный со шприцем объемом 1 мл; 4: тканевый гистоакриловый клей; 5: иглодержатель. (B) Мышь, расположенная в положении лежа на спине с обеими задними конечностями, помещенными на куски черной пластилина (красные стрелки), подготовленные для визуализации. (C) Окклюзированная (Occ) правая задняя конечность и левая фиктивная задняя конечность, готовая к визуализации. (D) Установка многофотонного микроскопа, показывающая лазерные коробки, коробку флуоресцентной лампы, трубки для нагрева камеры инкубатора. (E) Инкубаторная камера многофотонного микроскопа. (F) Мышь, помещенная в камеру микроскопа с 16-кратным объективом, касающимся ткани, покрытой ультразвуковым гелем. Деталь, показывающая венозный катетер, закрепленный на хвостовой вене для инъекции антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Настройка программного обеспечения для коррекции дрейфа VivoFollow. (A) (i-xiv) Этапы настройки программного обеспечения, описанные в шаге протокола 3.2.2-3.2.11.9. (B) Репрезентативные изображения временных рядов, показывающие дрейф изображения без включенного программного обеспечения для коррекции дрейфа. Коллатеральная артерия ограничена белыми прекращенными линиями (Видео 1 и Видео 2). (C) Репрезентативные изображения временных рядов, показывающие стабильные временные ряды, когда во время получения изображений применяется коррекция дрейфа в реальном времени. Лейкоциты были помечены антителами CD45-PE (красный), тромбоциты были помечены антителами CD41-FITC (зеленый) и коллаген типа 1 с SGH (синий). Коллатеральная артерия ограничена белыми прекращенными линиями. (D) Линейный график, показывающий коррекцию в реальном времени по направлениям x, y и z. Сокращения: ПЭ = фикоэритрин; FITC = изотиоцианат флуоресцеина; SGH = генерация второй гармоники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты . (A) Скорости лейкоцитов, измеренные в коллатеральных артериях фиктивно оперированных (фиктивных) и перевязанных бедренных артерий задних конечностей. (B) Репрезентативные изображения показывают отслеживаемые клетки (пурпурные) с дорожками с цветовой кодировкой. Строка цветового кода представляет скорость ячейки, при этом более медленные ячейки показаны синими дорожками, а более быстрые ячейки - красными. Лейкоциты были помечены введенными антителами CD45-PE (красный), тромбоциты были помечены введенными антителами CD41-FITC (зеленый), а коллаген типа 1 - SGH (синий). Результаты трех отдельных экспериментов. Масштабная линейка = 20 мкм. Смотрите Видео 3 и Видео 4. Сокращения: Occ = окклюзированная / перевязанная бедренная артерия; ПЭ = фикоэритрин; FITC = изотиоцианат флуоресцеина; SGH = генерация второй гармоники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Многофотонная прижизненная визуализация коллатеральной артерии без коррекции дрейфа. Четырехмерные изображения были записаны с размером пикселя 554 x 554 мкм, частотой 600 Гц, интервалом 1100 мс/кадр, размером шага 2 мкм и диапазоном 40 мкм. На видео показано, как изображение дрейфует без применения программного обеспечения для коррекции дрейфа VivoFollow. Коллатеральная артерия показана в нижней части видео, а коллатеральная вена появляется через 3 минуты в верхней части фильма. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Многофотонная прижизненная визуализация коллатеральной артерии с применением коррекции дрейфа. Четырехмерные изображения были сделаны с размером пикселя 554 x 554 мкм, частотой 600 Гц, интервалом 1100 мс/кадр, размером шага 2 мкм и диапазоном 40 мкм. Видео было записано с помощью программного обеспечения для коррекции дрейфа в реальном времени VivoFollow и демонстрирует стабильность изображения, обеспечиваемую применением программного обеспечения для коррекции дрейфа. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 3: Визуализация отслеживания клеток в коллатеральной артерии после фиктивной операции. Лейкоциты, меченные инъецированными антителами против CD45-PE, были визуализированы в покоящейся коллатеральной артерии фиктивно оперированной ноги и отслеживались с помощью программного обеспечения Imaris с плагином для отслеживания клеток. Отслеживаемые ячейки были выбраны и представлены пурпурными точками. Треки были окрашены цветом в соответствии со скоростью ячейки. Более медленные ячейки представлены синими дорожками, а более быстрые — красными. Масштабная линейка = 50 мкм. Аббревиатура = ПЭ = фикоэритрин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 4: Визуализация отслеживания клеток в коллатеральной артерии после FAL. Лейкоциты, меченные антителами против CD45-PE, визуализировали в растущей коллатеральной артерии через 24 ч после индукции артериогенеза с помощью FAL и отслеживали с помощью программного обеспечения Imaris с плагином для отслеживания клеток. Отслеживаемые ячейки были выбраны и представлены пурпурными точками. Треки были окрашены цветом в соответствии со скоростью ячейки. Более медленные ячейки представлены синими дорожками, а более быстрые — красными. Масштабная линейка = 50 мкм. Сокращения: FAL = перевязка бедренной артерии; ПЭ = фикоэритрин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
| Технические неполадки | Предлагаемые решения | |
| В случае, если хвостовые сосуды не видны для введения катетера | • Используйте теплый компресс вокруг хвоста мыши в течение 3-5 минут, чтобы способствовать местному расширению сосудов. Это поможет сделать вену видимой. | |
| В случае, если хвостовой катетер не может быть зафиксирован для инъекции антител | • Используйте шприц объемом 1 мл с иглой 30 г для введения в вену и непосредственно вводите антитела и красители перед визуализацией. | |
| • В некоторых случаях (в зависимости от антител) инъекция может быть применена внутривенно за 1 ч до визуализации. | ||
| Когда движение ткани препятствует стабильности изображения | • Попробуйте изменить положение и заново зафиксировать верхнюю часть ноги мыши, чтобы избежать физиологических движений живота. | |
| • Проверьте, достаточно ли воздуха на столе микроскопа для подавления вибрации. | ||
| • Убедитесь, что мышь находится под глубоким наркозом и не просыпается. | ||
| • Следите за дыханием мыши. Когда мышь дышит слишком быстро, это может повлиять на движение изображения. | ||
| Когда качество изображения начинает снижаться | • Следите за тем, чтобы ультразвуковой гель не высыхал. | |
| • Повторно залейте ультразвуковой гель. | ||
| • Убедитесь, что объектив чистый (очищайте высохший ультразвуковой гель на объективе всякий раз, когда делается новое повторное заполнение). | ||
| Когда артерии повреждены во время подготовки к визуализации | • В этом случае получить изображения будет невозможно. Запустить эксперимент невозможно. | |
Таблица 1: Устранение неполадок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный метод многофотонного анализа рекрутирования лейкоцитов in vivo представляет собой дополнение к широко используемым инструментам для исследований рекрутирования лейкоцитов, таким как (иммуно-) гистологический анализ или анализ FACS. С помощью этого метода визуализации можно более детально визуализировать динамические процессы в адгезии лейкоцитов и экстравазации во время артериогенеза10. Несмотря на добавленную стоимость этого метода, предлагаемый протокол включает в себя некоторые важные шаги и ограничения. Дополнительные советы по устранению неполадок см. в таблице 1 . Во время удаления поверхностного мышечного слоя на коллатеральных артериях эти артерии могут быть повреждены и не будут полезны для прижизненной визуализации. Катетер должен быть хорошо закреплен для инъекции антител; В противном случае соскальзывание катетера хвостовой вены может привести к экстравазации антител в периваскулярное пространство хвоста, что затрудняет замену и дополнительную коррекцию для инъекции антител. Правильная идентификация коллатеральной артерии и коллатеральной вены во время прижизненной микроскопии представляет собой еще один важный шаг этого протокола.
Учитывая, что мышь не вентилируется механически во время прижизненной микроскопии, время динамической визуализации ограничено, чтобы избежать физических травм мыши в результате чрезмерно длительной анестезии. Одним из недостатков прижизненной микроскопии является физиологическое движение мыши, генерируемое дыханием, сердцебиением и перистальтическими движениями, которые могут влиять на получение изображения и, следовательно, на качество анализа данных. Улучшение держателей тканей, крепление и фиксация — это шаги, которые еще больше уменьшают эффекты движения. В дополнение к физиологическому движению, долгосрочная визуализация может способствовать дрейфу тканей во время визуализации. Как описано в этом протоколе, программное обеспечение для коррекции дрейфа тканей в режиме реального времени, VivoFollow, было использовано для получения данных визуализации, пригодных для последующего отслеживания клеток и анализа скорости клеток. Это программное обеспечение VivoFollow корректирует смещение образца в x, y и z непосредственно во время получения изображения. Он опирается на неподвижную анатомическую структуру, например, когда сосуды визуализируются с помощью сосудистых индикаторов, которые служат ориентирами для процедуры коррекции.
Несмотря на то, что существуют и другие инструменты коррекции дрейфа после приобретения, такие как инструменты Bitplane Imaris или плагины для ImageJ, они очень ограничены в своих возможностях коррекции, поскольку не позволяют восстановить интересующую область. В принципе, они не могут корректировать серьезные смещения, когда область интереса выходит из поля зрения. Тем не менее, этот протокол может быть применен даже тогда, когда коррекция дрейфа в реальном времени недоступна, и коррекция после получения становится необходимой. Однако это требует частого обучения персонала монтажу и фиксации тканей. В заключение, многофотонная прижизненная микроскопия является полезным динамическим методом, который может применяться параллельно со статическими установленными методами, такими как (иммуно-) гистологический анализ, чтобы получить более подробную картину динамических компонентов рекрутирования лейкоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Исследование финансировалось Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, проект Z01). Мы благодарим доктора Сюзанну Штутте за прочтение рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
