Summary
Rekryteringen av leukocyter och blodplättar utgör en väsentlig komponent som är nödvändig för effektiv tillväxt av kollaterala artärer under arteriogenesen. Multifotonmikroskopi är ett effektivt verktyg för att spåra celldynamik med hög spatio-temporal upplösning in vivo och mindre fototoxicitet för att studera leukocytrekrytering och extravasering under arteriogenesen.
Abstract
Arteriogenes beror starkt på leukocyt- och trombocytrekrytering till det perivaskulära utrymmet hos växande säkerhetskärl. Standardmetoden för analys av kollaterala artärer och leukocyter i arteriogenes är ex vivo (immun-) histologisk metodik. Denna teknik tillåter emellertid inte mätning av dynamiska processer såsom blodflöde, skjuvspänning, cell-cellinteraktioner och partikelhastighet. Detta dokument presenterar ett protokoll för att övervaka in vivo-processer i växande kollaterala artärer under arteriogenes med användning av intravital avbildning. Metoden som beskrivs här är ett tillförlitligt verktyg för dynamisk mätning och erbjuder en högkontrastanalys med minimal fotocytotoxicitet, tillhandahållen genom multifotonexcitationsmikroskopi. Före analys av växande kollateralartärer inducerades arteriogenes i adduktormuskeln hos möss genom ensidig ligering av lårbensartären.
Efter ligeringen började de redan existerande säkerhetsartärerna växa på grund av ökad skjuvspänning. Tjugofyra timmar efter operationen avlägsnades huden och subkutant fett ovanför kollateralartärerna och byggde en ficka för ytterligare analyser. För att visualisera blodflödet och immunceller under in vivo-avbildning injicerades CD41-fluoresceinisotiocyanat (FITC) (trombocyter) och CD45-fykoerytrin (PE) (leukocyter) antikroppar intravenöst (i.v.) via en kateter placerad i svansvenen på en mus. Denna artikel introducerar intravital multifotonavbildning som ett alternativ eller in vivo-komplementering till de vanliga statiska ex vivo (immuno-) histologiska analyserna för att studera processer som är relevanta för arteriogenes. Sammanfattningsvis beskriver denna artikel en ny och dynamisk in vivo-metod för att undersöka immuncellshandel, blodflöde och skjuvspänning i en bakbensmodell av arteriogenes, vilket förbättrar utvärderingsmöjligheterna avsevärt.
Introduction
Trots intensivt forskningsintresse under de senaste åren är hjärt-kärlsjukdomar, t.ex. ischemisk hjärtsjukdom och stroke, fortfarande den ledande globala dödsorsaken1. Nuvarande behandlingar för dessa sjukdomar är mycket invasiva terapier såsom perkutan transluminal angioplastik, perkutan transluminal koronarangioplastik eller bypassoperation2. Därför är det angeläget att utveckla alternativa, icke-invasiva behandlingsalternativ. Kroppen kan skapa naturliga förbikopplingar runt ett stenoserat eller ockluderat kärl för att omdirigera det avbrutna blodflödet till den distala delen av stenosen. Denna process kallas arteriogenes2. Många nya studier har visat att ökad vätskeskjuvning påverkar leukocytrekrytering, vilket spelar en viktig roll under arteriogenes3. De viktigaste nuvarande alternativen för att analysera rekryteringen av leukocyter under arteriogenes är ex vivo (immun-) histologiska analyser eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) metodik4. För att möjliggöra bedömning av leukocytdynamik under arteriogenes presenterar denna artikel ett intravitalt avbildningsprotokoll med multifotonmikroskopi.
Leukocyter är de viktigaste blodkropparna som rekryteras under processen med arteriogenes3. Detta protokoll använder multifotonavbildning för att visa krypning av vidhäftande leukocyter märkta med injicerade anti-CD45-PE-antikroppar i kollaterala artärer, 24 timmar efter induktion av arteriogenes genom lårbensartärligering (FAL) med användning av en murin bakbensischemi modell 5,6. Alternativt kan immunceller märkas ex vivo och försiktigt injiceras i möss, vilket visas i studier på angiogenes med intravital mikroskopi7. Blodflödet inuti kärl och artärer kan visualiseras av CD41-FITC (för att märka blodplättar), dextran-FITC (plasma) eller av den andra harmoniska generationen (SHG), som visualiserar kollagen typ 1 närvarande i basalmembranet i någon del av kärlträdet. SHG är en unik fri märkningseffekt av multifotonexcitationen. Multifotonavbildning möjliggör långsiktig cellspårning utan att skada vävnaden och aktivera cellerna genom lasereffektexcitation. Multifotonmikroskopi är den avbildningsmetod som valts för att visualisera fluorescerande märkta celler och strukturer hos levande djur på grund av dess förmåga att excitera fluoroforerna djupare in i vävnaden / organen med minimal fototoxicitet8.
Användningen av avstämda infraröda lasrar med pulser som levereras inom femtosekundintervall exciterar fluorokromen endast vid fokalplanet, utan excitation över och under fokalplanet8. Således möjliggör multifotonmikroskopi hög spatio-temporal upplösning, mindre fotoskador och ökad vävnadspenetrationsavbildning för att studera dynamiska biologiska händelser inuti organen. Det är ett idealiskt mikroskopiverktyg för avbildning av levande djur. Multifoton och någon annan konst av intravital mikroskopi begränsas emellertid av vävnadsrörelse på grund av hjärtslag, andning, peristaltiska rörelser, muskeltonalitet och andra fysiologiska funktioner, vilket stör bildförvärv och analys. Eftersom dessa rörelser försämrar tids- och rumsupplösningen och ibland till och med förbjuder efterföljande analys, måste de hanteras på lämpligt sätt för att möjliggöra korrekt dataanalys och tolkning. Flera strategier har utvecklats för att sänka eller förhindra artefakter från vävnadsrörelse. Detta protokoll tillämpar en in situ-avdriftskorrigeringsprogramvara som heter VivoFollow9 för att korrigera vävnadsdrift under bildförvärv. Detta tillvägagångssätt ger den nödvändiga bildstabiliseringen, vilket möjliggör långsiktig avbildning och cellspårningsanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av den bayerska djurvårds- och användningskommittén (godkänd av etisk kod: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Dessa försök utfördes i strikt överensstämmelse med de tyska riktlinjerna för djurlagstiftning.
1. Djur och lårbensartärligering (FAL)
OBS: För att inducera steril inflammation och arteriogenes användes 8-10 veckor gamla manliga C57BL / 6J-möss. Ingen av mössen dog eller led av sårinfektion eller sårläkningsstörning under eller efter FAL- eller skenoperation.
- Anestesi
OBS: Före injektion av MMF-blandningsanestesi rekommenderas att först bedöva med 5% isofluran tills musen sover.- Väg musen och förbered MMF-blandningen med en dos midazolam 5,0 mg/kg, medetomidin 0,5 mg/kg och fentanyl 0,05 mg/kg.
- Fyll en 1 ml spruta med MMF-mix och injicera en slutlig volym på 100 μL s.c. med en 30 G nål (efter anestesi med 5% isofluran).
- Placera musen på en varm dyna och vänta tills musen är helt bedövad. Ställ in timern på 35 min. Efter denna tid injiceras s.c. hälften av dosen (50 μl) av MMF-blandningen.
- Kontrollera anestesidjupet genom att testa pedalen och interdigitala reflexer (med fast tånypa) på musen.
OBS: Frånvaro av respons indikerar ett tillräckligt djup av analgesi.
- Lårbensartärligering (FAL)
OBS: Använd sterila kirurgiska instrument och suturer. Desinficera huden med desinfektionsmedel före öppning och efter stängning.- Placera den bedövade musen på en värmeplatta (35-37 °C) för att bibehålla fysiologisk kroppstemperatur. Applicera ögonkräm (dexpanthenol) på varje öga för att förhindra torkning av ögonen under anestesi.
- Överför den bedövade musen till en laserdopplerkammare (LDI) före och efter FAL för att kontrollera blodflöde och perfusion (figur 1A-C).
- Ta bort hår, desinficera huden och gör ett snitt för att komma åt lårbensartären. Under ett kirurgiskt mikroskop, ligera den högra lårbensartären i musens bakben med hjälp av en flätad silkesutur (7-0) och utför en skenoperation på vänster lårbensartär för att fungera som en intern kontroll som tidigare beskrivits6 (Figur 1D-K).
OBS: Snittet i huden gjordes med en liten sax för att undvika direkt skada på blodkärlen nära huden. - Stäng huden med en flätad sidensutur (6-0). Administrera buprenorfin (0,1 mg/kg) s.c. var 12:e timme, med start 10 min innan anestesin motarbetas för smärtlindring. Observera djuret för signaler om smärta, dvs minskad groomingaktivitet, ovilja att röra sig eller böjd hållning i 24 timmar efter operationen.
- Injicera (s.c.) en kombination av naloxon (1,2 mg/kg), flumazenil (0,5 mg/kg) och atipamezol (2,5 mg/kg) för att motverka anestesin efter avslutad FAL och stängning av huden.
- Efter operationen, håll musen på den varma dynan och övervaka djuret kontinuerligt tills det kan upprätthålla en upprätt hållning och börja gå normalt runt buret.
- När musen är helt vaken, placera den tillbaka i buren tillsammans med de andra mössen och återför buren till djurhuset.
2. Vävnadsberedning för multifoton, intravital avbildning
- Injektion av svansven
OBS: Djuret måste vara under anestesi innan förberedelserna för intravital avbildning påbörjas. Innan du introducerar venkateterns nål rekommenderas att du applicerar ett desinfektionsmedel på svansen. Detta kommer också att bidra till att visualisera fartygen.- Förbered en injektionskateter med svansvenen med en 2 x 30 G nål, 10 cm av en finborrad polyetenslang (0,28 mm innerdiameter och 0,61 mm ytterdiameter), en 1 ml spruta och ett histoakryllim för att fixera katetern på mussvansen för ytterligare intraveninjektioner under avbildning (figur 2A, B och figur 2F).
- Bered antikroppslösningen för intravenös injektion: CD45-PE och CD41-FITC (20 μg/mus) vid en slutlig volym på 100 μl.
- Kontrollera svansen för de lateralt placerade svansvenerna och damma venen för att identifiera svansvenen. Desinficera svansen, sätt in venkatetern och fixera den med vävnadshistoakryllim (figur 2B).
- Injicera antikropparna före avbildning (minst 15 min före) och efter avslutad vävnadsberedning.
- Vävnad förberedelse
OBS: Använd alltid en varm dyna och administrera en droppe ögonkräm (dexpantenol) i varje öga före vävnadsberedning. Använd sterila kirurgiska instrument och suturer. Desinficera huden med desinfektionsmedel före öppning och efter stängning.- Placera den bedövade musen på en stabil och bärbar dyna. Fäst musen i ryggläge med en 4-punktsfixering på dynan med tejp (figur 2B).
- Forma två bitar modelleringslera och placera bitarna under musens övre bakben för att säkerställa en plan position för adduktormuskeln (figur 2B, indikerad med röda pilar).
- För att säkerställa en stabil kroppstemperatur på 37 °C hos musen, placera dynan med musen på en värmeplatta under ett kirurgiskt mikroskop med en 0,64-4,0-faldig zoom (bild 1L).
- Ta bort håret från båda benen, desinficera huden och skär huden i en cirkel runt ärret från den tidigare lårbensartärligeringen i höger bakben (figur 1M).
- Ta bort huden och fettlagret från toppen av benet (figur 1N,O) och dra åt sidan den återstående huden med suturer för att skapa en ficka runt adduktormuskeln (figur 1P,Q).
- Ta bort subkutant fett för att få en tydlig bild av adduktormuskeln och den djupa artären / venen samt kollaterala kärl (figur 1Q, R).
- Börja försiktigt ta bort det ytliga muskelskiktet ovanpå kollateralkärlen genom att försiktigt dissekera det med fina pincett (figur 1R).
OBS: Kollateralartären och kollateralvenen är tydligt synliga och redo för avbildning (figur 1S). - Fyll den förberedda fickan med saltlösning för att undvika torkning av vävnaden och fortsätt med samma procedur för den falska vänstra bakbenet. Innan du avbildar dig, tillsätt ultraljudsgel i båda fickorna, vilket förhindrar torkning och fungerar som ett nedsänkningsmedium för optisk koppling med målet (figur 2C och figur 2F).
3. Intravital multifotonmikroskopi
- Förberedelse
OBS: Håll en spruta med ultraljudsgel inuti mikroskopets inkubatorkammare för att bibehålla en varm temperatur för påfyllning av fickorna under långvarig bildbehandling.- Ta bort saltlösningen från de två förberedda fickorna och ersätt den med ultraljudsgel för att täcka säkerhetskärlen (figur 2C).
- Injicera antikroppslösningen genom svansvenkatetern. 15 min efter antikroppsinjektion, överför dynan med den fasta musen till den uppvärmda multifotonbildningskammaren (figur 2F).
- Efter avslutad bildförvärv, avliva musen genom cervikal dislokation under djup narkos.
- Bildinsamling med multifotonmikroskopi
OBS: Slå på mikroskopet 30 min före avbildning för att möjliggöra laserstabilisering. För bästa optiska stabilitet i mikroskopet rekommenderas att mikroskopkammaren hålls permanent uppvärmd.- Slå på nyckeln till Ti:Safirlaserboxen, de elektroniska gränssnittsboxarna, inkubationskammarens värmeenhet, lysröret och datorn (figur 2D,E).
- Starta förvärvsprogramvaran (Inspector-programvaran). Ställ in våglängden på 800 nm och öppna mikroskopslutaren (figur 3A ii).
- I dialogrutan Mätguiden väljer du Instrumentläge (enkelstråle) och i Mätläge (3D-skanningstidsfördröjning) (bild 3A i).
- Överför den bedövade musen till mikroskopets förvärmda inkubationskammare. Placera området med ultraljudsgelen (steg 2.2.8) direkt i kontakt med objektivets främre lins (figur 2F).
- Öppna epifluorescensmikroskopslutaren, välj en lämplig filter/dikroisk inställning för FITC-visualisering (4) för att hitta intresseområdet genom att följa blodflödet under epifluorescensbelysning. När du har tagit intresseområdet in i mittfältet, stäng epifluorescensmikroskopslutaren.
- I dialogrutan xy-Scanner ställer du in följande parametrar: Bildstorlek (554x554), Pixel (512x512), Frekvens (400), Radgenomsnitt (1) (Figur 3A iii). Justera lasereffekten (5 %) (figur 3A iv) och ställ in fotomultiplikatorförstärkningen (PMT) för kanalerna grön (66), röd (66) och blå (63) (figur 3A v).
- Välj ett lämpligt mål för inställningar för intravital avbildning och driftkorrigering (se detaljer i 3.2.11).
OBS: Här var det valda målet Nikon LWD 16x (figur 3A vi). - Definiera bildstapelns intervall genom att starta förhandsgranskningshämtningsläget genom att trycka på den röda knappen i det övre högra hörnet av dialogrutan Mätguiden (bild 3A i).
- Definiera intresseområde och struktur genom att fokusera för att få en bra bild. Sedan, medan du observerar skärmen, ändra fokus genom att flytta målet uppåt tills bilden försvinner och ställ in det som noll (första = 0). Ändra fokus i motsatt riktning genom att flytta målet nedåt tills bilden försvinner från skärmen igen och ställ in det som den sista (end = 40 μm) positionen i axiell riktning (figur 3A vii).
- Ställ in stegstorleken på 2 μm. Klicka på den röda knappen längst upp till höger i dialogrutan Mätguiden för att stoppa förhandsgranskningsskanningen.
OBS: Antalet bilder beräknas och ställs in automatiskt (21 bilder), såsom visas i figur 3A vii. - Om mikroskopet är utrustat med levande driftkorrigering9, starta avdriftskorrigeringsprogramvaran (t.ex. VivoFollow) och följ stegen som beskrivs nedan.
- I dialogrutan Mätguiden väljer du Python-axeln (Python Ax) (figur 3A viii) som den första axelenheten. Aktivera INTE autosparläget. Markera rutan för automatisk sparning (AS) endast på tidsaxeln (Tid, tid). Tryck på Python-ikonen i fönstret Tillgängliga enheter (bild 3A ix) för att öppna Python-dialogfönstret .
- I Python-dialogrutan Axelinställningar anger du Från (0 noll) och Till (-40). Ange Antal steg (21) enligt figur 3A x.
- Gå till dialogrutan xyz steg Z och förstora skanningsområdet med 200 μm i båda ändar: i Start anger du (200 μm) och i Slut anger du (-240 μm) ställs intervallet automatiskt in (-440 μm). Behåll stegstorleken (2 μm) enligt figur 3A xi.
- Öppna dialogrutan VivoFollow Frontend och klicka på rutan Rörelseprofil (bild 3A xii).
- Starta bildinsamlingen genom att trycka på den gröna pilspetsen i det övre vänstra hörnet i dialogrutan Mätguiden i granskarprogrammet (bild 3A i).
- Om korrigering av levande drift används, leta efter en dialogruta för avdriftskorrigeringskonfigurationen som ska visas enligt figur 3A xiii. Ställ in den förvärvskanal som ska användas som en orörlig landmärkereferens (för detta protokoll, välj kanal 2, där vaskulär spårsignal ska registreras). Ange den maximala korrigeringsförskjutningen i μm som lades till i den första och sista z-positionen (här 200 μm) och klicka på OK.
- Övervaka strömförskjutningen i x, y och z i realtid under bildinsamlingen i dialogrutan VivoFollow fronted Figur 3A xiv.
- Stoppa bildförvärv efter ~ 35 min när en annan cykel av anestesiinjektion krävs. Injicera en halv dos av MMF-mixen (50 μl s.c) och starta om bildtagningen genom att trycka på den gröna pilspetsen igen (steg 3.2.11.5).
- Upprepa proceduren tills experimentet är klart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multifotonmikroskopi erbjuder en hög spatio-temporal upplösning för leukocytspårning, där cellmigrationssteg och hastighet kan spåras och övervakas (figur 4A, B). Provets fysiologiska rörelse utgör emellertid en utmaning, särskilt för långsiktiga intravitala mikroskopibildförvärv. Därför krävs en bra vävnadsberedning och hållare för att fixera vävnaden och verktygen, såsom realtidsbildkorrigering för vävnadsdrift, för framgångsrik och stabil bildinsamling. Här användes ett live-driftverktyg, VivoFollow, för att korrigera för vävnadsdrift som genererades under långvarig bildförvärv.
Tillämpningen av detta verktyg möjliggör långsiktig bildförvärv och möjliggör insamling av högkvalitativa data, lämpliga för spårning av celler för hastighetsmätningar. Som visas i figur 3B, utan avdriftskorrigering, driver intresseområdet gradvis bort från inspelningsvyn, vilket påverkar möjligheten att spåra celler för hastighetsanalys. Men som visas i figur 3C, med driftkorrigeringsprogramvaran, kan stabila filmer spelas in och fler celler kan spåras under en lång period. Driftkorrigeringsprogramvaran kan också ge en visualisering av x-, y- och z-förskjutningarna över tid som systemet korrigerade för, som visas i figur 3D.
Figur 1: Installation och förberedelse av laserdoppleravbildning för lårbensartärligering och vävnadsberedning för intravital avbildning. (A) Inställning av LDI-avbildning. (B) Musen placeras inuti LDI-värmekammaren för bildinsamling. (C) LDI-bilder av höger och vänster ben före (övre panelen) och efter FAL (nedre panelen) för att kontrollera bakbenets perfusion efter ligering. Den högra lårbensartären ligerades/ockluderades, medan den vänstra lårbensartären var skenopererad (Sham) och fungerade som en intern kontroll. I färgfältet indikerar blått lågt blodperfusion och rött indikerar högre perfusion. (D-K) Bilder representerar operationsstegen i den femorala arteriella ligeringen. Skalstång = 10 mm. (L-S) Vävnadsberedning för intravital avbildning efter FAL. Området som ska avbildas indikeras av den svarta cirkeln, där säkerhetsfartygen är belägna. Skalstång = 5 mm. Förkortningar: LDI = Laser Doppler imaging; FAL = lårbensartärligering; Occ = ocklusion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Inställning för multifotonintravital avbildning . (A) Beredning av venkateter. 1-Fin polyetenslang på 10 cm, 2: 2x 30 G nål; 3: monterad kateter ansluten med 1 ml spruta; 4: vävnadshistoakryllim; 5: nålhållare. (B) Musen placerad i ryggläge med båda bakbenen placerade på bitar av svart modelleringslera (röda pilar) förberedda för avbildning. c) Höger bakben och vänster skenbar bakben klar för avbildning. (D) Multifotonmikroskopinställning som visar laserlådor, fluorescenslampbox, rör för uppvärmning av inkubatorkammaren. (E) Inkubatorkammaren i multifotonmikroskopet. (F) Musen placerad inuti mikroskopkammaren med 16x målet vidrör vävnaden täckt med ultraljudsgel. Detalj som visar venkatetern fixerad på svansvenen för antikroppsinjektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Programvaruinstallation för VivoFollow avdriftkorrigering. (A) (i-xiv) Steg för programvaruinstallation enligt beskrivningen i protokollsteg 3.2.2-3.2.11.9. (B) Representativa tidsseriebilder som visar bildavdriften utan avdriftskorrigeringsprogram aktiverat. Säkerhetsartären avgränsas av de vita utgångna linjerna (Video 1 och Video 2). (C) Representativa tidsseriebilder som visar den stabila tidsserien när korrigeringen för levande drift tillämpas under bildinsamlingen. Leukocyter märktes med CD45-PE-antikroppar (röd), blodplättar märktes av CD41-FITC-antikroppar (grön) och kollagen typ 1 med SGH (blå). Säkerhetsartären avgränsas av de vita avvecklade linjerna. (D) Linjediagram som visar realtidskorrigeringen längs x-, y- och z-riktningarna. Förkortningar: PE = phycoerythrin; FITC = fluoresceinisotiocyanat, SGH = andra harmoniska generationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat. (A) Leukocythastigheter uppmätta i kollaterala artärer av bluffdrivna (Sham) och lårbensartärligerade bakben. (B) Representativa bilder visar cellerna spårade (magenta) med spåren färgkodade. Färgkodfältet representerar cellhastigheten med långsammare celler som visas av blå spår och snabbare celler med röda spår. Leukocyter märktes med injicerade CD45-PE-antikroppar (röd), blodplättar märktes med injicerade CD41-FITC-antikroppar (grön) och kollagen typ 1 med SGH (blå). Resultat från tre enskilda experiment. Skalstång = 20 μm. Se video 3 och video 4. Förkortningar: Occ= ockluderad/lårbensartärligerad; PE = fykoerytrin; FITC = fluoresceinisotiocyanat, SGH = andra harmoniska generationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Multifotonen intravital avbildning av en kollateralartär utan driftkorrigering. Fyrdimensionella bilder togs med en pixelstorlek på 554 x 554 μm, frekvens 600 Hz, ett intervall på 1100 ms / ram, stegstorlek på 2 μm och intervall på 40 μm. Videon visar bilden som driver utan tillämpning av VivoFollow driftkorrigeringsprogramvara. Säkerhetsartären visas i den nedre delen av videon, och säkerhetsvenen visas efter 3 minuter i den övre delen av filmen. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Multifotonintravital avbildning av en kollateralartär med applicerad driftkorrigering. Fyrdimensionella bilder togs med en pixelstorlek på 554 x 554 μm, frekvens 600 Hz, ett intervall på 1100 ms / ram, stegstorlek på 2 μm och intervall på 40 μm. Videon spelades in med programvaran för korrigering av levande drift, VivoFollow, och visar bildstabiliteten som främjas genom att använda programvaran för driftkorrigering. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Cellspårningsavbildning i en kollateralartär efter skenoperation. Leukocyter märkta med injicerade anti-CD45-PE-antikroppar avbildades i en vilande säkerhetsartär i det skendrivna benet och spårades med hjälp av Imaris-programvara med plugin för spårning av celler. Spårade celler valdes och representerades av de magenta prickarna. Spåren färgkodades enligt cellhastigheten. Långsammare celler representeras av blå spår och snabbare celler av röda spår. Skalstapel = 50 μm. Förkortning = PE = fykoerytrin. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 4: Cellspårningsavbildning i en kollateralartär efter FAL. Leukocyter märkta med anti-CD45-PE-antikroppar avbildades i en växande säkerhetsartär 24 timmar efter induktion av arteriogenes av FAL och spårades med hjälp av Imaris-programvara med plugin för spårning av celler. Spårade celler valdes och representerades av de magenta prickarna. Spåren färgkodades enligt cellhastigheten. Långsammare celler representeras av blå spår och snabbare celler av röda spår. Skalstapel = 50 μm. Förkortningar: FAL = lårbensartärligering; PE = fykoerytrin. Klicka här för att ladda ner den här videon.
| Tekniska problem | Föreslagna lösningar | |
| Om svanskärlen inte är synliga för införande av katetern | • Använd en varm kompress som omger mussvansen i 3-5 minuter för att främja lokal vasodilatation. Det hjälper till att göra venen synlig. | |
| Om svanskatetern inte kan fixeras för antikroppsinjektion | • Använd en 1 ml spruta med 30 G nål för att införa antikroppar och färgämnen direkt i venen före avbildning. | |
| • I vissa fall (beroende på antikroppar) kan injektionen appliceras i.p. 1 h före avbildning. | ||
| När vävnadens rörelse hindrar bildstabilitet | • Försök att flytta om och fixa musens övre ledtrådsben för att undvika fysiologiska magrörelser. | |
| • Kontrollera om mikroskopbordet har tillräckligt med luft för att avbryta vibrationer. | ||
| • Se till att musen är i djup anestesi och inte vaknar. | ||
| • Övervaka musens andning. När musen andas för snabbt kan det påverka bildrörelsen. | ||
| När bildkvaliteten börjar försämras | • Se till att ultraljudsgelen inte torkar ut. | |
| • Fyll på ultraljudsgelen. | ||
| • Se till att målet är rent (rengör den torkade ultraljudsgelen på målet när en ny påfyllning görs). | ||
| När artärerna skadas under förberedelse för avbildning | • I det här fallet är det inte möjligt att skaffa bilder. Det är inte möjligt att köra experimentet. | |
Tabell 1: Felsökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna metoden för multifotonanalys in vivo av leukocytrekrytering representerar ett tillägg till vanliga verktyg för leukocytrekryteringsstudier såsom (immun-) histologiska eller FACS-analyser. Med denna avbildningsmetod är det möjligt att visualisera mer detaljerat de dynamiska processerna vid leukocytvidhäftning och extravasering under arteriogenes10. Trots mervärdet av denna metod innehåller det erbjudna protokollet några kritiska steg och begränsningar. Se tabell 1 för fler felsökningstips. Under avlägsnandet av det ytliga muskelskiktet på kollaterala artärer kan dessa artärer skadas och kommer inte att vara användbara för intravital avbildning. Katetern måste vara väl fixerad för antikroppsinjektion; Annars kan glidning av svansvenkatetern orsaka extravasering av antikropparna i svansens perivaskulära utrymme, vilket gör ersättning och ytterligare korrigering för injektion av antikropparna till en utmanande uppgift. Den korrekta identifieringen av kollateralartären och kollateralvenen under intravital mikroskopi representerar ett annat kritiskt steg i detta protokoll.
Med tanke på att musen inte ventileras mekaniskt under intravital mikroskopi är den dynamiska avbildningstiden begränsad för att undvika fysisk skada på musen till följd av alltför lång anestesi. En av bristerna i intravital mikroskopi är musens fysiologiska rörelse, genererad av andning, hjärtslag och peristaltiska rörelser, som kan påverka bildförvärv och därmed kvaliteten på dataanalyser. Förbättring av vävnadshållare, montering och fixering är steg som ytterligare minskar effekterna av rörelse. Förutom den fysiologiska rörelsen kan långvarig avbildning bidra till vävnadsdrift under avbildning. Som beskrivs i detta protokoll användes en programvara för korrigering av vävnadsdrift i realtid, VivoFollow, för att erhålla bilddata som är lämpliga för efterföljande cellspårning och cellhastighetsanalys. Denna VivoFollow-programvara korrigerar för provförskjutningen i x, y och z direkt under bildförvärv. Det bygger på orörlig anatomisk struktur, till exempel när kärl visualiseras med vaskulära spårämnen som fungerar som referensmärken för korrigeringsproceduren.
Även om det finns andra driftkorrigeringsverktyg tillgängliga efter förvärvet, till exempel de inom Bitplane Imaris eller plugins för ImageJ, är de mycket begränsade i sin kapacitet för korrigering eftersom de inte tillåter återställning av regionen av intresse. I princip kan de inte korrigera för allvarliga förskjutningar när intresseområdet rör sig ur synfältet. Detta protokoll kan dock tillämpas även när korrigeringen av levande drift inte är tillgänglig och korrigering efter förvärvet blir nödvändig. Detta kräver dock frekvent utbildning av personal i vävnadsmontering och fixering. Sammanfattningsvis är multifotonisk intravital mikroskopi en användbar dynamisk metod som kan tillämpas parallellt med statiska etablerade metoder såsom (immun-) histologiska analyser för att få en mer detaljerad bild av de dynamiska komponenterna i leukocytrekrytering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Studien finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, projekt Z01). Vi tackar Dr. Susanne Stutte för att ha läst manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
