Summary
El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.
Abstract
La arteriogénesis depende en gran medida del reclutamiento de leucocitos y plaquetas en el espacio perivascular de los vasos colaterales en crecimiento. El enfoque estándar para analizar arterias colaterales y leucocitos en arteriogénesis es la metodología histológica ( inmuno) ex vivo. Sin embargo, esta técnica no permite la medición de procesos dinámicos como el flujo sanguíneo, el esfuerzo cortante, las interacciones célula-célula y la velocidad de las partículas. Este artículo presenta un protocolo para monitorear los procesos in vivo en el crecimiento de arterias colaterales durante la arteriogénesis utilizando imágenes intravitales. El método descrito aquí es una herramienta confiable para la medición dinámica y ofrece un análisis de alto contraste con fotocitotoxicidad mínima, proporcionada por microscopía de excitación multifotónica. Antes de analizar las arterias colaterales en crecimiento, se indujo arteriogénesis en el músculo aductor de ratones mediante ligadura unilateral de la arteria femoral.
Después de la ligadura, las arterias colaterales preexistentes comenzaron a crecer debido al aumento del esfuerzo cortante. Veinticuatro horas después de la cirugía, se eliminó la piel y la grasa subcutánea por encima de las arterias colaterales, construyendo un bolsillo para análisis adicionales. Para visualizar el flujo sanguíneo y las células inmunes durante las imágenes in vivo , se inyectaron anticuerpos contra el isotiocianato de fluoresceína CD41 (FITC) (plaquetas) y la CD45-ficoeritrina (PE) (leucocitos) por vía intravenosa (IV) a través de un catéter colocado en la vena de la cola de un ratón. Este artículo presenta la imagen multifotónica intravital como una alternativa o complementación in vivo a los análisis histológicos estáticos ex vivo (inmuno) comúnmente utilizados para estudiar procesos relevantes para la arteriogénesis. En resumen, este artículo describe un método in vivo novedoso y dinámico para investigar el tráfico de células inmunes, el flujo sanguíneo y el estrés de cizallamiento en un modelo de arteriogénesis de las extremidades posteriores, lo que mejora notablemente las posibilidades de evaluación.
Introduction
A pesar del intenso interés de la investigación durante los últimos años, las enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, la cardiopatía isquémica y el accidente cerebrovascular, siguen siendo la principal causa mundial de muerte1. Los tratamientos actuales para estas enfermedades son terapias altamente invasivas como la angioplastia transluminal percutánea, la angioplastia coronaria transluminal percutánea o la cirugía de derivación2. Por lo tanto, se necesita urgentemente el desarrollo de opciones terapéuticas alternativas y no invasivas. El cuerpo puede crear derivaciones naturales alrededor de un vaso estenosado u ocluido para redirigir el flujo sanguíneo interrumpido a la parte distal de la estenosis. Este proceso se llama arteriogénesis2. Muchos estudios recientes han demostrado que el aumento del cizallamiento del líquido afecta el reclutamiento de leucocitos, que desempeña un papel importante durante la arteriogénesis3. Las principales opciones actuales para analizar el reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis son los análisis (inmuno) histológicos ex vivo o la metodología de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)4. Para permitir la evaluación de la dinámica de los leucocitos durante la arteriogénesis, este artículo presenta un protocolo de imagen intravital con microscopía multifotónica.
Los leucocitos son las principales células sanguíneas reclutadas durante el proceso de arteriogénesis3. Este protocolo utiliza imágenes multifotónicas para mostrar el rastreo de leucocitos adherentes marcados con anticuerpos anti-CD45-PE inyectados en arterias colaterales, 24 h después de la inducción de la arteriogénesis por ligadura de la arteria femoral (FAL) empleando un modelo de isquemia murina de las extremidades posteriores 5,6. Alternativamente, las células inmunes pueden etiquetarse ex vivo e inyectarse cuidadosamente en ratones, como se muestra en estudios sobre angiogénesis utilizando microscopía intravital7. El flujo sanguíneo dentro de los vasos y arterias puede ser visualizado por CD41-FITC (para etiquetar plaquetas), dextrano-FITC (plasma), o por la segunda generación armónica (SHG), que visualiza el colágeno tipo 1 presente en la membrana basal de alguna parte del árbol vascular. SHG es un efecto único de etiquetado libre de la excitación multifotónica. Las imágenes multifotónicas permiten el seguimiento celular a largo plazo sin dañar el tejido y activar las células mediante la excitación de potencia láser. La microscopía multifotónica es el método de imagen de elección para visualizar células y estructuras marcadas con fluorescencia en animales vivos debido a su capacidad para excitar los fluoróforos más profundamente en el tejido / órganos con una fototoxicidad mínima8.
El uso de láseres infrarrojos sintonizados con pulsos entregados dentro de intervalos de femtosegundos excita el fluorocromo solo en el plano focal, sin excitación por encima y por debajo del plano focal8. Por lo tanto, la microscopía multifotónica permite una alta resolución espacio-temporal, menos fotodaño y una mayor penetración de imágenes de tejido para estudiar eventos biológicos dinámicos dentro de los órganos. Es una herramienta de microscopía ideal para imágenes de animales vivos. Sin embargo, el multifotón y cualquier otro arte de la microscopía intravital está limitado por el movimiento del tejido debido a los latidos del corazón, la respiración, los movimientos peristálticos, la tonalidad muscular y otras funciones fisiológicas, lo que perturba la adquisición y el análisis de imágenes. Como estos movimientos perjudican la resolución temporal y espacial y, a veces, incluso prohíben el análisis posterior, deben abordarse adecuadamente para permitir un análisis e interpretación precisos de los datos. Se han desarrollado varias estrategias para reducir o prevenir el movimiento de los artefactos del tejido. Este protocolo aplica un software de corrección de deriva in situ llamado VivoFollow9 para corregir la deriva del tejido durante la adquisición de imágenes. Este enfoque proporciona la estabilización de imagen requerida, lo que permite el análisis de imágenes y seguimiento celular a largo plazo.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Baviera (aprobado por el código ético: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); estos experimentos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices de la legislación animal alemana.
1. Los animales y la ligadura de la arteria femoral (FAL)
NOTA: Para inducir inflamación estéril y arteriogénesis, se utilizaron ratones machos C57BL / 6J de 8-10 semanas de edad. Ninguno de los ratones murió o sufrió de infección de la herida o alteración de la cicatrización de la herida durante o después de la cirugía FAL o simulada, respectivamente.
- Anestesia
NOTA: Antes de la inyección de la anestesia MMF-mix, se recomienda anestesiar primero con isoflurano al 5% hasta que el ratón esté durmiendo.- Pesar el ratón y preparar la mezcla de MMF con una dosis de midazolam 5,0 mg/kg, medetomidina 0,5 mg/kg y fentanilo 0,05 mg/kg.
- Llene una jeringa de 1 ml con MMF-mix e inyecte un volumen final de 100 μL s.c. usando una aguja de 30 G (después de la anestesia con isoflurano al 5%).
- Coloque el mouse en una almohadilla caliente y espere hasta que el mouse esté completamente anestesiado. Ajuste el temporizador a 35 min. Después de este tiempo, inyecte s.c. la mitad de la dosis (50 μL) de la mezcla MMF.
- Verifique la profundidad de la anestesia probando el pedal y los reflejos interdigitales (pellizcando el dedo firme del pie) del mouse.
NOTA: La ausencia de respuesta indica una profundidad adecuada de analgesia.
- Ligadura de la arteria femoral (FAL)
NOTA: Use instrumentos quirúrgicos y suturas estériles. Desinfecte la piel con desinfectante antes de abrir y después de cerrar.- Coloque el ratón anestesiado en una placa calefactora (35-37 °C) para mantener la temperatura corporal fisiológica. Aplique crema para los ojos (dexpantenol) en cada ojo para evitar la sequedad de los ojos bajo anestesia.
- Transfiera el ratón anestesiado a una cámara de imágenes Doppler láser (LDI) antes y después de FAL para verificar el flujo sanguíneo y la perfusión (Figura 1A-C).
- Retire el vello, desinfecte la piel y haga un corte para acceder a la arteria femoral. Bajo un microscopio quirúrgico, ligar la arteria femoral derecha de la extremidad posterior del ratón utilizando una sutura de seda trenzada (7-0) y realizar una operación simulada en la arteria femoral izquierda para que sirva como control interno como se describió anteriormente6 (Figura 1D-K).
NOTA: La incisión en la piel se hizo con tijeras pequeñas para evitar lesiones directas a los vasos sanguíneos cercanos a la piel. - Cerrar la piel con una sutura de seda trenzada (6-0). Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) s.c. cada 12 h, comenzando 10 min antes de antagonizar la anestesia para aliviar el dolor. Observe al animal en busca de señales de dolor, es decir, actividad de aseo reducida, renuencia a moverse o postura encorvada durante 24 horas después de la cirugía.
- Inyecte (s.c.) una combinación de naloxona (1.2 mg/kg), flumazenil (0.5 mg/kg) y atipamezol (2.5 mg/kg) para antagonizar la anestesia después de terminar el FAL y cerrar la piel.
- Después de la cirugía, mantenga al ratón en la almohadilla caliente y monitoree continuamente al animal hasta que pueda mantener una postura erguida y comience a caminar normalmente alrededor de la jaula.
- Cuando el ratón esté completamente despierto, colóquelo de nuevo en la jaula junto con los otros ratones y devuelva la jaula a la habitación de alojamiento de animales.
2. Preparación tisular para imágenes intravitales multifotónicas
- Inyección de venas de la cola
NOTA: El animal debe estar bajo anestesia antes de comenzar la preparación para la imagen intravital. Antes de introducir la aguja del catéter venoso, se recomienda aplicar un desinfectante para la piel en la cola. Esto también ayudará a visualizar los vasos.- Prepare un catéter de inyección de vena de la cola con una aguja de 2 x 30 G, 10 cm de un tubo de polietileno de diámetro fino (0,28 mm de diámetro interno y 0,61 mm de diámetro exterior), una jeringa de 1 ml y un pegamento de histoacrilo para fijar el catéter en la cola del ratón para inyecciones intravenosas adicionales durante las imágenes (Figura 2A, B y Figura 2F).
- Preparar la solución de anticuerpos para inyección intravenosa: CD45-PE y CD41-FITC (20 μg/ratón) a un volumen final de 100 μL.
- Revise la cola en busca de venas de la cola ubicadas lateralmente y represa la vena para identificar la vena de la cola. Desinfecte la cola, inserte el catéter venoso y fíjelo con pegamento de histoacrilo tisular (Figura 2B).
- Inyecte los anticuerpos antes de la obtención de imágenes (al menos 15 minutos antes) y después de terminar la preparación del tejido.
- Preparación de tejidos
NOTA: Siempre use una almohadilla caliente y administre una gota de crema para los ojos (dexpantenol) en cada ojo antes de preparar el tejido. Use instrumentos quirúrgicos estériles y suturas. Desinfecte la piel con desinfectante antes de abrir y después de cerrar.- Coloque el ratón anestesiado en una almohadilla estable y portátil. Fije el ratón en posición supina con una fijación de 4 puntos en la almohadilla con cinta adhesiva (Figura 2B).
- Moldee dos piezas de arcilla para modelar y coloque las piezas debajo de la extremidad posterior superior del ratón para asegurar una posición plana del músculo aductor (Figura 2B, indicada por flechas rojas).
- Para garantizar una temperatura corporal estable de 37 °C del ratón, coloque la almohadilla con el ratón en una placa calefactora bajo un microscopio quirúrgico con un zoom de 0,64-4,0 veces (Figura 1L).
- Retire el vello de ambas piernas, desinfecte la piel y corte la piel en un círculo alrededor de la cicatriz de la ligadura anterior de la arteria femoral de la extremidad posterior derecha (Figura 1M).
- Retire la piel y la capa de grasa de la parte superior de la pierna (Figura 1N, O) y retire la piel restante con suturas para crear un bolsillo alrededor del músculo aductor (Figura 1P, Q).
- Retire la grasa subcutánea para obtener una visión clara del músculo aductor y la arteria / vena profunda, así como los vasos colaterales (Figura 1Q, R).
- Comience a retirar cuidadosamente la capa muscular superficial en la parte superior de los vasos colaterales diseccionándola cuidadosamente con pinzas finas (Figura 1R).
NOTA: La arteria colateral y la vena colateral son claramente visibles y están listas para obtener imágenes (Figura 1S). - Llene el bolsillo preparado con solución salina para evitar el secado del tejido y continúe con el mismo procedimiento para la extremidad posterior izquierda operada de forma simulada. Antes de la obtención de imágenes, agregue gel ultrasónico en ambos bolsillos, lo que evita el secado y sirve como medio de inmersión para el acoplamiento óptico con el objetivo (Figura 2C y Figura 2F).
3. Microscopía multifotónica intravital
- Preparación
NOTA: Mantenga una jeringa con gel ultrasónico dentro de la cámara de la incubadora del microscopio para mantener una temperatura cálida para rellenar las bolsas durante las imágenes a largo plazo.- Retire la solución salina de los dos bolsillos preparados y reemplácela con gel ultrasónico para cubrir los vasos colaterales (Figura 2C).
- Inyecte la solución de anticuerpos a través del catéter de la vena de la cola. 15 min después de la inyección de anticuerpos, transfiera la almohadilla con el ratón fijo a la cámara de imágenes multifotónica calentada (Figura 2F).
- Después de completar la adquisición de la imagen, eutanasia al ratón por dislocación cervical bajo narcosis profunda.
- Adquisición de imágenes por microscopía multifotónica
NOTA: Encienda el microscopio 30 minutos antes de obtener imágenes para permitir la estabilización láser. Para obtener la mejor estabilidad óptica del microscopio, se recomienda mantener la cámara del microscopio permanentemente calentada.- Encienda la llave de la caja láser Ti:Sapphire, las cajas de interfaces electrónicas, la unidad de calentamiento de la cámara de incubación, la lámpara fluorescente y el ordenador (Figura 2D,E).
- Inicie el software de adquisición (software Inspector). Ajuste la longitud de onda a 800 nm y abra el obturador del microscopio (Figura 3A ii).
- En el cuadro de diálogo Asistente de medición, elija el Modo de instrumento (haz único) y en Modo de medición (lapso de tiempo de escaneo 3D) (Figura 3A i).
- Transfiera el ratón anestesiado a la cámara de incubación precalentada del microscopio. Coloque el área con el gel ultrasónico (paso 2.2.8) directamente en contacto con la lente frontal del objetivo (Figura 2F).
- Abra el obturador del microscopio de epifluorescencia, elija un filtro / ajuste dicroico adecuado para la visualización FITC (4) para encontrar el área de interés siguiendo el flujo sanguíneo bajo iluminación de epifluorescencia. Después de llevar el área de interés al campo de visión central, cierre el obturador del microscopio de epifluorescencia.
- En el cuadro de diálogo xy-Scanner, defina los siguientes parámetros: Tamaño de imagen (554x554), Pixel (512x512), Frecuencia (400), Promedio de línea (1) (Figura 3A iii). Ajuste la potencia del láser (5%) (Figura 3A iv) y ajuste la ganancia del fotomultiplicador (PMT) para los canales verde (66), rojo (66) y azul (63) (Figura 3A v).
- Seleccione un objetivo adecuado para los ajustes de imagen intravital y corrección de deriva (ver detalles en 3.2.11).
NOTA: Aquí, el objetivo seleccionado fue la Nikon LWD 16x (Figura 3A vi). - Defina el rango de la pila de imágenes iniciando el modo de adquisición de vista previa presionando el botón rojo en la esquina superior derecha de la ventana de diálogo del Asistente de medición (Figura 3A i).
- Definir el área y estructura de interés enfocando para obtener una buena imagen. Luego, mientras observa la pantalla, cambie el enfoque moviendo el objetivo hacia arriba hasta que la imagen desaparezca y configúrelo como cero (primero = 0). Cambie el enfoque en la dirección opuesta moviendo el objetivo hacia abajo hasta que la imagen desaparezca de la pantalla nuevamente, y configúrelo como la última posición (final = 40 μm) en la dirección axial (Figura 3A vii).
- Establezca el tamaño del paso en 2 μm. Haga clic en el botón rojo de la esquina superior derecha del cuadro de diálogo Asistente de medición para detener la vista previa del escaneo.
NOTA: El número de imágenes se calculará y establecerá automáticamente (21 imágenes), como se indica en la Figura 3A vii. - Si el microscopio está equipado con corrección de deriva viva9, inicie el software de corrección de deriva (por ejemplo, VivoFollow) y siga los pasos que se describen a continuación.
- En el cuadro de diálogo Asistente de medición, elija el eje Python (Python Ax) (Figura 3A viii) como primer dispositivo de eje; NO active el modo de guardado automático. Marque la casilla de guardado automático (AS) solo en el eje de tiempo ( Time Time). Presione el icono de Python en la ventana Dispositivos disponibles (Figura 3A ix) para abrir la ventana de diálogo de Python .
- En la configuración del eje del cuadro de diálogo de Python , escriba Desde (0 cero) y Hasta (-40). Introduzca Número de pasos (21) como se indica en la figura 3A x.
- Vaya a la ventana de diálogo xyz Stage Z y amplíe el rango de escaneo en 200 μm en ambos extremos: en Inicio, enter (200 μm) y en End, enter (-240 μm), el rango se establecerá automáticamente (-440 μm). Mantenga el tamaño del paso (2 μm) como se muestra en la Figura 3A xi.
- Abra el cuadro de diálogo VivoFollow Frontend y haga clic en el cuadro Perfil de movimiento (Figura 3A xii).
- Inicie la adquisición de imágenes pulsando la punta de flecha verde situada en la esquina superior izquierda del cuadro de diálogo Asistente de medición del software Inspector (Figura 3A i).
- Si se utiliza la corrección de deriva viva, busque un cuadro de diálogo para que aparezca la configuración de corrección de deriva como se muestra en la Figura 3A xiii. Establezca el canal de adquisición que se utilizará como referencia de punto de referencia inmóvil (para este protocolo, elija el canal 2, donde se registrará la señal del trazador vascular). Introduzca el desplazamiento de corrección máximo en μm que se agregó a la primera y última posición z (aquí, 200 μm) y haga clic en Aceptar.
- Supervise el desplazamiento de la deriva actual en x, y y z en tiempo real durante la adquisición de imágenes en la ventana de diálogo frontal de VivoFollow Figura 3A xiv.
- Detenga la adquisición de imágenes después de ~ 35 minutos cuando se requiere otro ciclo de reinyección de anestesia. Inyectar media dosis de la mezcla MMF (50 μl s.c) y reiniciar la adquisición de imágenes presionando de nuevo la punta de flecha verde (paso 3.2.11.5).
- Repita este procedimiento hasta que finalice el experimento.
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Representative Results
La microscopía multifotónica ofrece una alta resolución espacio-temporal para el seguimiento de leucocitos, en la que los pasos y la velocidad de la migración celular pueden ser rastreados y monitoreados (Figura 4A, B). Sin embargo, el movimiento fisiológico de la muestra plantea un desafío, especialmente para las adquisiciones de imágenes de microscopía intravital a largo plazo. Por lo tanto, se requiere una buena preparación de tejido y soportes para fijar el tejido y herramientas, como la corrección de imágenes en tiempo real para la deriva del tejido, para una adquisición de imágenes exitosa y estable. Aquí, se empleó una herramienta de deriva en vivo, VivoFollow, para corregir la deriva del tejido generada durante la adquisición de imágenes a largo plazo.
La aplicación de esta herramienta permite la adquisición de imágenes a largo plazo y permite la recopilación de datos de alta calidad, adecuados para el seguimiento de celdas para mediciones de velocidad. Como se muestra en la Figura 3B, sin corrección de deriva, la región de interés se aleja progresivamente de la vista de grabación, lo que afecta la capacidad de rastrear celdas para el análisis de velocidad. Sin embargo, como se muestra en la Figura 3C, con el software de corrección de deriva, se pueden grabar películas estables y se puede rastrear más celdas durante un largo período. El software de corrección de deriva también puede proporcionar una visualización de los desplazamientos x, y y z a lo largo del tiempo que el sistema corrigió, como se muestra en la Figura 3D.
Figura 1: Configuración de imágenes Doppler láser y preparación para la ligadura de la arteria femoral y preparación de tejidos para imágenes intravitales. (A) Configuración de imágenes LDI. (B) El ratón se coloca dentro de la cámara de calentamiento LDI para la adquisición de imágenes. (C) Imágenes LDI de las piernas derecha e izquierda antes (panel superior) y después de FAL (panel inferior) para verificar la perfusión de las extremidades posteriores después de la ligadura. La arteria femoral derecha fue ligada/ocluida, mientras que la arteria femoral izquierda fue operada de forma simulada (Sham) y sirvió como control interno. En la barra de color, el azul indica una baja perfusión sanguínea y el rojo indica una mayor perfusión. (D-K) Las imágenes representan los pasos de la cirugía de la ligadura arterial femoral. Barra de escala = 10 mm. (L-S) Preparación tisular para imágenes intravitales después de FAL. El área a fotografiar está indicada por el círculo negro, donde se encuentran los vasos colaterales. Barra de escala = 5 mm. Abreviaturas: LDI = Laser Doppler imaging; FAL = ligadura de la arteria femoral; Occ = oclusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración para imágenes intravitales multifotónicas. (A) Preparación del catéter venoso; 1-Tubo fino de polietileno de 10 cm, aguja 2: 2x 30 G; 3: catéter montado conectado con jeringa de 1 ml; 4: pegamento histoacrílico tisular; 5: soporte de aguja. (B) El ratón colocado en posición supina con ambas extremidades posteriores colocadas sobre trozos de arcilla negra para modelar (flechas rojas) preparados para la obtención de imágenes. (C) Miembro posterior derecho e izquierdo ocluidos (Occ), extremidad posterior operada de forma simulada lista para la obtención de imágenes. (D) Configuración del microscopio multifotón que muestra cajas láser, caja de lámpara de fluorescencia, tubos para calentar la cámara de la incubadora. (E) Cámara de incubación del microscopio multifotónico. (F) Ratón colocado dentro de la cámara del microscopio con el objetivo 16x tocando el tejido cubierto con gel ultrasónico. Detalle que muestra el catéter venoso fijado en la vena de la cola para inyección de anticuerpos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración del software de corrección de deriva VivoFollow. (A) (i-xiv) Pasos de configuración del software como se describe en el paso de protocolo 3.2.2-3.2.11.9. (B) Imágenes representativas de series temporales que muestran la deriva de imágenes sin el software de corrección de deriva activado. La arteria colateral está delimitada por las líneas blancas discontinuadas (Video 1 y Video 2). (C) Imágenes representativas de series temporales que muestran la serie temporal estable cuando se aplica la corrección de deriva en vivo durante la adquisición de imágenes. Los leucocitos se marcaron con anticuerpos CD45-PE (rojo), las plaquetas se marcaron con anticuerpos CD41-FITC (verde) y el colágeno tipo 1 con el SGH (azul). La arteria colateral está delimitada por las líneas blancas discontinuadas. (D) Gráfico de líneas que muestra la corrección en vivo a lo largo de las direcciones x, y y z. Abreviaturas: PE = ficoeritrina; FITC = isotiocianato de fluoresceína; SGH = segunda generación armónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos . (A) Velocidades leucocitarias medidas en arterias colaterales de extremidades posteriores operadas con simulacro (Sham) y ligadas a la arteria femoral. (B) Las imágenes representativas muestran las celdas rastreadas (magenta) con las pistas codificadas por colores. La barra de códigos de color representa la velocidad de la celda con las celdas más lentas mostradas por pistas azules y las celdas más rápidas con pistas rojas. Los leucocitos se marcaron con anticuerpos CD45-PE inyectados (rojo), las plaquetas se marcaron con anticuerpos CD41-FITC inyectados (verde) y el colágeno tipo 1 con el SGH (azul). Resultados de tres experimentos individuales. Barra de escala = 20 μm. Ver Video 3 y Video 4. Abreviaturas: Occ= ocluido/ligado a la arteria femoral; PE = ficoeritrina; FITC = isotiocianato de fluoresceína; SGH = segunda generación armónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Imágenes intravitales multifotónicas de una arteria colateral sin corrección de deriva. Las imágenes cuatridimensionales se grabaron con un tamaño de píxel de 554 x 554 μm, frecuencia de 600 Hz, un intervalo de 1100 ms/cuadro, tamaño de paso de 2 μm y rango de 40 μm. El video muestra la imagen a la deriva sin la aplicación del software de corrección de deriva VivoFollow. La arteria colateral se muestra en la parte inferior del video, y la vena colateral aparece después de 3 minutos en la parte superior de la película. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Imágenes intravitales multifotónicas de una arteria colateral con corrección de deriva aplicada. Se tomaron imágenes cuatridimensionales con un tamaño de píxel de 554 x 554 μm, frecuencia de 600 Hz, un intervalo de 1100 ms/fotograma, tamaño de paso de 2 μm y rango de 40 μm. El video fue grabado con el software de corrección de deriva en vivo, VivoFollow, y muestra la estabilidad de imagen promovida al aplicar el software de corrección de deriva. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 3: Imágenes de seguimiento celular en una arteria colateral después de una operación simulada. Los leucocitos marcados con anticuerpos anti-CD45-PE inyectados se obtuvieron imágenes en una arteria colateral en reposo de la pierna operada de forma simulada y se rastrearon utilizando el software Imaris con el complemento para rastrear células. Las celdas rastreadas fueron seleccionadas y representadas por los puntos magenta. Las pistas estaban codificadas por colores de acuerdo con la velocidad de la celda. Las celdas más lentas están representadas por pistas azules y las celdas más rápidas por pistas rojas. Barra de escala = 50 μm. Abreviatura = PE = ficoeritrina. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 4: Imágenes de seguimiento celular en una arteria colateral después de FAL. Los leucocitos marcados con anticuerpos anti-CD45-PE se obtuvieron imágenes en una arteria colateral en crecimiento 24 h después de la inducción de la arteriogénesis por FAL y se rastrearon mediante el uso del software Imaris con el complemento para rastrear células. Las celdas rastreadas fueron seleccionadas y representadas por los puntos magenta. Las pistas estaban codificadas por colores de acuerdo con la velocidad de la celda. Las celdas más lentas están representadas por pistas azules y las celdas más rápidas por pistas rojas. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: FAL = ligadura de la arteria femoral; PE = ficoeritrina. Haga clic aquí para descargar este video.
| Problemas técnicos | Soluciones propuestas | |
| En caso de que los vasos de la cola no sean visibles para introducir el catéter | • Use una compresa tibia que rodea la cola del ratón durante 3-5 minutos para promover la vasodilatación local. Ayudará a hacer visible la vena. | |
| En caso de que el catéter de cola no se pueda fijar para la inyección de anticuerpos | • Utilice una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 g para introducir en la vena e inyectar directamente los anticuerpos y colorantes antes de la obtención de imágenes. | |
| • En algunos casos (dependiendo de los anticuerpos) la inyección se puede aplicar i.p. 1 h antes de la imagen. | ||
| Cuando el movimiento del tejido impide la estabilidad de la imagen | • Trate de volver a colocar y volver a fijar la pata superior del ratón para evitar los movimientos abdominales fisiológicos. | |
| • Compruebe si la mesa del microscopio tiene suficiente aire para cancelar la vibración. | ||
| • Asegúrese de que el ratón esté en anestesia profunda y no se despierte. | ||
| • Monitorizar la respiración del ratón. Cuando el ratón respira demasiado rápido, puede tener un impacto en el movimiento de la imagen. | ||
| Cuando la calidad de la imagen comienza a disminuir | • Asegúrese de que el gel ultrasónico no se seque. | |
| • Vuelva a llenar el gel ultrasónico. | ||
| • Asegúrese de que el objetivo esté limpio (limpie el gel ultrasónico seco en el objetivo cada vez que se realice un nuevo relleno). | ||
| Cuando las arterias se dañan durante la preparación para la obtención de imágenes | • En este caso, no será posible adquirir imágenes. No es posible ejecutar el experimento. | |
Tabla 1: Solución de problemas.
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Discussion
El método descrito de análisis multifotón in vivo del reclutamiento de leucocitos representa una adición a las herramientas comúnmente utilizadas para los estudios de reclutamiento de leucocitos, como los análisis (inmuno) histológicos o FACS. Con este método de imagen, es posible visualizar con mayor detalle los procesos dinámicos en la adhesión leucocitaria y extravasación durante la arteriogénesis10. A pesar del valor agregado de este método, el protocolo ofrecido incluye algunos pasos críticos y limitaciones. Consulte la Tabla 1 para obtener más sugerencias para la solución de problemas. Durante la eliminación de la capa muscular superficial en las arterias colaterales, estas arterias podrían dañarse y no serán útiles para las imágenes intravitales. El catéter debe estar bien fijado para la inyección de anticuerpos; De lo contrario, el deslizamiento del catéter de la vena de la cola puede causar la extravasación de los anticuerpos en el espacio perivascular de la cola, lo que hace que el reemplazo y la corrección adicional para la inyección de los anticuerpos sea una tarea difícil. La correcta identificación de la arteria colateral y la vena colateral durante la microscopía intravital representa otro paso crítico de este protocolo.
Dado que el ratón no se ventila mecánicamente durante la microscopía intravital, el tiempo de imagen dinámica es limitado para evitar lesiones físicas al ratón como resultado de una anestesia excesivamente larga. Una de las deficiencias de la microscopía intravital es el movimiento fisiológico del ratón, generado por la respiración, los latidos del corazón y los movimientos peristálticos, que puede afectar la adquisición de imágenes y, por lo tanto, la calidad de los análisis de datos. Mejorar los soportes de tejido, el montaje y la fijación son pasos que reducen aún más los efectos del movimiento. Además del movimiento fisiológico, las imágenes a largo plazo pueden contribuir a la deriva del tejido durante la obtención de imágenes. Como se describe en este protocolo, se empleó un software de corrección de deriva tisular en tiempo real, VivoFollow, para obtener datos de imágenes adecuados para el seguimiento celular posterior y el análisis de la velocidad celular. Este software VivoFollow corrige el desplazamiento de la muestra en x, y y z directamente durante la adquisición de imágenes. Se basa en la estructura anatómica inmóvil, por ejemplo, cuando los vasos se visualizan con trazadores vasculares que sirven como puntos de referencia para el procedimiento de corrección.
Aunque hay otras herramientas de corrección de deriva posteriores a la adquisición disponibles, como las de Bitplane Imaris o los complementos para ImageJ, son muy limitadas en su capacidad de corrección, ya que no permiten la restauración de la región de interés. En principio, no pueden corregir las compensaciones severas cuando la región de interés se mueve fuera del campo de visión. Sin embargo, este protocolo se puede aplicar incluso cuando la corrección de deriva en vivo no está disponible, y la corrección posterior a la adquisición se hace necesaria. Sin embargo, esto requiere capacitación frecuente del personal en el montaje y fijación de tejidos. En conclusión, la microscopía intravital multifotónica es un método dinámico útil que se puede aplicar en paralelo a los métodos estáticos establecidos, como los análisis (inmuno) histológicos para obtener una imagen más detallada de los componentes dinámicos del reclutamiento de leucocitos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
El estudio fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, proyecto Z01). Agradecemos a la Dra. Susanne Stutte por leer el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
