Summary
Rekruttering af leukocytter og blodplader udgør en væsentlig komponent, der er nødvendig for effektiv vækst af sikkerhedsarterier under arteriogenese. Multifotonmikroskopi er et effektivt værktøj til sporing af celledynamik med høj rumlig-tidsmæssig opløsning in vivo og mindre fototoksicitet til undersøgelse af leukocytrekruttering og ekstravasation under arteriogenese.
Abstract
Arteriogenese afhænger stærkt af leukocyt og blodpladerekruttering til det perivaskulære rum af voksende sikkerhedsfartøjer. Standardmetoden til analyse af sikkerhedsarterier og leukocytter i arteriogenese er ex vivo (immuno-) histologisk metode. Denne teknik tillader imidlertid ikke måling af dynamiske processer såsom blodgennemstrømning, forskydningsspænding, celle-celle-interaktioner og partikelhastighed. Dette papir præsenterer en protokol til overvågning af in vivo-processer i voksende sikkerhedsarterier under arteriogenese ved hjælp af intravital billeddannelse. Metoden beskrevet her er et pålideligt værktøj til dynamikmåling og tilbyder en højkontrastanalyse med minimal fotocytotoksicitet, tilvejebragt ved multifoton excitationsmikroskopi. Før analyse af voksende sikkerhedsarterier blev arteriogenese induceret i adduktormusklen hos mus ved ensidig ligering af lårbensarterien.
Efter ligeringen begyndte de allerede eksisterende sikkerhedsarterier at vokse på grund af øget forskydningsstress. Fireogtyve timer efter operationen blev huden og subkutant fedt over sikkerhedsarterierne fjernet, hvilket konstruerede en lomme til yderligere analyser. For at visualisere blodgennemstrømning og immunceller under in vivo-billeddannelse blev CD41-fluoresceinisothiocyanat (FITC) (blodplader) og CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytter) antistoffer injiceret intravenøst (i.v.) via et kateter placeret i halevenen på en mus. Denne artikel introducerer intravital multifotonbilleddannelse som et alternativ eller in vivo-komplementation til de almindeligt anvendte statiske ex vivo (immuno-) histologiske analyser til undersøgelse af processer, der er relevante for arteriogenese. Sammenfattende beskriver dette papir en ny og dynamisk in vivo-metode til at undersøge immuncellehandel, blodgennemstrømning og forskydningsstress i en bagbensmodel af arteriogenese, hvilket især forbedrer evalueringsmulighederne.
Introduction
På trods af intensiv forskningsinteresse i de senere år er hjerte-kar-sygdomme, fx iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde, stadig den førende globale dødsårsag1. Nuværende behandlinger for disse sygdomme er meget invasive terapier såsom perkutan transluminal angioplastik, perkutan transluminal koronar angioplastik eller bypassoperation2. Derfor er der et presserende behov for udvikling af alternative, ikke-invasive terapeutiske muligheder. Kroppen kan skabe naturlige bypass omkring et stenoseret eller okkluderet kar for at omdirigere den afbrudte blodgennemstrømning til den distale del af stenosen. Denne proces kaldes arteriogenese2. Mange nylige undersøgelser har vist, at øget væskeforskydning påvirker leukocytrekruttering, som spiller en vigtig rolle under arteriogenese3. De vigtigste nuværende muligheder for at analysere rekrutteringen af leukocytter under arteriogenese er ex vivo (immuno-) histologiske analyser eller fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) metode4. For at muliggøre vurdering af leukocytdynamik under arteriogenese præsenterer dette papir en intravital billeddannelsesprotokol med multifotonmikroskopi.
Leukocytter er de vigtigste blodlegemer, der rekrutteres under processen med arteriogenese3. Denne protokol bruger multifotonbilleddannelse til at vise gennemsøgning af klæbende leukocytter mærket med injicerede anti-CD45-PE-antistoffer i sikkerhedsarterier, 24 timer efter induktion af arteriogenese ved lårbensarterieligering (FAL) ved anvendelse af en murin bagbensiskæmi model 5,6. Alternativt kan immunceller mærkes ex vivo og omhyggeligt injiceres i mus, som vist i undersøgelser af angiogenese ved hjælp af intravital mikroskopi7. Blodgennemstrømningen inde i kar og arterier kan visualiseres af CD41-FITC (til mærkning af blodplader), dextran-FITC (plasma) eller af den anden harmoniske generation (SHG), som visualiserer kollagen type 1 til stede i kældermembranen i en del af vaskulærtræet. SHG er en unik gratis mærkningseffekt af multifotonexcitationen. Multifotonbilleddannelse tillader langsigtet cellesporing uden at skade vævet og aktivere cellerne ved laserkraftexcitation. Multifotonmikroskopi er den valgte billeddannelsesmetode til visualisering af fluorescerende mærkede celler og strukturer i levende dyr på grund af dets evne til at excitere fluoroforerne dybere ind i vævet / organerne med minimal fototoksicitet8.
Brugen af tunede infrarøde lasere med impulser leveret inden for femtosekundintervaller ophidser kun fluorokromen på brændplanet uden excitation over og under brændplanet8. Således tillader multifotonmikroskopi høj rumlig-tidsmæssig opløsning, mindre fotoskader og øget vævspenetrationsbilleddannelse til undersøgelse af dynamiske biologiske begivenheder inde i organerne. Det er et ideelt mikroskopiværktøj til billeddannelse af levende dyr. Imidlertid er multifoton og enhver anden kunst af intravital mikroskopi begrænset af vævsbevægelse på grund af hjerteslag, åndedræt, peristaltiske bevægelser, muskeltonalitet og andre fysiologiske funktioner, hvilket forstyrrer billeddannelse erhvervelse og analyse. Da disse bevægelser forringer den tidsmæssige og rumlige opløsning og undertiden endda forbyder efterfølgende analyse, skal de behandles hensigtsmæssigt for at muliggøre nøjagtig dataanalyse og fortolkning. Flere strategier er blevet udviklet til at sænke eller forhindre artefakter fra vævsbevægelse. Denne protokol anvender en in situ drift korrektion software kaldet VivoFollow9 til at korrigere vævsdrift under billedoptagelse. Denne fremgangsmåde giver den nødvendige billedstabilisering, hvilket muliggør langsigtet billeddannelse og cellesporingsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af den bayerske dyrepleje- og brugskomité (godkendt af etisk kode: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Disse forsøg blev udført i nøje overensstemmelse med de tyske retningslinjer for dyrelovgivningen.
1. Dyr og lårbensarterieligering (FAL)
BEMÆRK: For at fremkalde steril inflammation og arteriogenese blev 8-10 uger gamle C57BL/6J-hanmus anvendt. Ingen af musene døde eller led af sårinfektion eller sårhelingsforstyrrelser under eller efter henholdsvis FAL- eller skinoperation.
- Anæstesi
BEMÆRK: Før injektion af MMF-mix-anæstesien anbefales det først at bedøve med 5% isofluran, indtil musen sover.- Vej musen, og forbered MMF-blandingen med en dosis midazolam 5,0 mg/kg, medetomidin 0,5 mg/kg og fentanyl 0,05 mg/kg.
- Fyld en 1 ml sprøjte med MMF-mix og injicer et slutvolumen på 100 μL s.c. med en 30 G kanyle (efter anæstesi med 5% isofluran).
- Placer musen på en varm pude og vent, indtil musen er helt bedøvet. Indstil timeren til 35 min. Efter dette tidspunkt injiceres s.c. halvdelen af dosis (50 μL) af MMF-blandingen.
- Kontroller dybden af anæstesi ved at teste musens pedal og interdigitale reflekser (ved fast tåklemme).
BEMÆRK: Manglende respons indikerer en tilstrækkelig dybde af analgesi.
- Femoral arterie ligation (FAL)
BEMÆRK: Brug sterile kirurgiske instrumenter og suturer. Desinficer huden med desinfektionsmiddel før åbning og efter lukning.- Anbring den bedøvede mus på en varmeplade (35-37 °C) for at opretholde fysiologisk kropstemperatur. Påfør øjencreme (dexpanthenol) på hvert øje for at forhindre tørring af øjnene under anæstesi.
- Overfør den bedøvede mus til et LDI-kammer (Laser Doppler-billeddannelse) før og efter FAL for at kontrollere blodgennemstrømning og perfusion (figur 1A-C).
- Fjern hår, desinficer huden, og lav et snit for at få adgang til lårbensarterien. Under et kirurgisk mikroskop ligeres højre lårbensarterie i musens bagben ved hjælp af en flettet silkesutur (7-0) og udfører en skinoperation på venstre lårbensarterie for at tjene som en intern kontrol som tidligere beskrevet6 (figur 1D-K).
BEMÆRK: Snittet i huden blev lavet med en lille saks for at undgå direkte skade på blodkarrene tæt på huden. - Luk huden ved hjælp af en flettet silkesutur (6-0). Administrer buprenorphin (0,1 mg / kg) s.c. hver 12. time, startende 10 minutter før antagonisering af anæstesi til smertelindring. Overhold dyret for signaler om smerte, dvs. nedsat plejeaktivitet, modvilje mod at bevæge sig eller krumbøjet kropsholdning i 24 timer efter operationen.
- Injicer (s.c.) en kombination af naloxon (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) og atipamezol (2,5 mg / kg) for at modvirke anæstesien efter afslutning af FAL og lukning af huden.
- Efter operationen skal du holde musen på den varme pude og løbende overvåge dyret, indtil det kan opretholde en opretstående kropsholdning og begynde at gå normalt rundt i buret.
- Når musen er helt vågen, skal du placere den tilbage i buret sammen med de andre mus og returnere buret til dyrestaldrummet.
2. Vævsforberedelse til multifoton intravital billeddannelse
- Hale vene injektion
BEMÆRK: Dyret skal være under anæstesi, inden præparatet til intravital billeddannelse påbegyndes. Før du indfører nålen i venekateteret, anbefales det at anvende et huddesinfektionsmiddel på halen. Dette vil også hjælpe med at visualisere fartøjerne.- Forbered et haleveneinjektionskateter ved hjælp af en 2 x 30 G nål, 10 cm af en polyethylenslange med fin boring (0,28 mm indvendig diameter og 0,61 mm ydre diameter), en 1 ml sprøjte og en histoacryllim til at fastgøre kateteret på musehalen til yderligere iv-injektioner under billeddannelse (figur 2A, B og figur 2F).
- Forbered antistofopløsningen til i.v. injektion: CD45-PE og CD41-FITC (20 μg/mus) ved et slutvolumen på 100 μL.
- Kontroller halen for de sideværts placerede halevener og dæmning venen for at identificere halevenen. Desinficer halen, indsæt venekateteret, og fastgør det ved hjælp af vævshistoacryllim (figur 2B).
- Injicer antistofferne før billeddannelse (mindst 15 minutter før) og efter afslutning af vævspræparatet.
- Vævsforberedelse
BEMÆRK: Brug altid en varm pude og administrer en dråbe øjencreme (dexpanthenol) i hvert øje før vævsforberedelse. Brug sterile kirurgiske instrumenter og suturer. Desinficer huden med desinfektionsmiddel før åbning og efter lukning.- Placer den bedøvede mus på en stabil og bærbar pude. Fastgør musen i liggende stilling med en 4-punkts fiksering på puden ved hjælp af tape (figur 2B).
- Form to stykker modellervoks og læg stykkerne under musens øverste bagben for at sikre en plan position af adduktormusklen (figur 2B, angivet med røde pile).
- For at sikre en stabil kropstemperatur på 37 °C i musen skal du placere puden med musen på en varmeplade under et kirurgisk mikroskop med en 0,64-4,0 gange zoom (figur 1L).
- Fjern håret fra begge ben, desinficer huden og skær huden i en cirkel omkring arret fra den tidligere lårbensarterieligering af højre bagben (figur 1M).
- Fjern huden og fedtlaget fra toppen af benet (figur 1N, O), og træk den resterende hud til side ved hjælp af suturer for at skabe en lomme omkring adduktormusklen (figur 1P, Q).
- Fjern subkutant fedt for at få et klart syn på adduktormusklen og den dybe arterie / vene samt sikkerhedsbeholderne (figur 1Q, R).
- Start forsigtigt med at fjerne det overfladiske muskellag oven på sikkerhedsbeholderne ved forsigtigt at dissekere det ud med fine pincet (figur 1R).
BEMÆRK: Sikkerhedsarterien og sikkerhedsvenen er tydeligt synlige og klar til billeddannelse (figur 1S). - Fyld den forberedte lomme med saltvand for at undgå tørring af vævet, og fortsæt med samme procedure for det skamopererede venstre bagben. Før billeddannelse tilsættes ultralydsgel i begge lommer, hvilket forhindrer tørring og fungerer som et nedsænkningsmedium til optisk kobling med målet (figur 2C og figur 2F).
3. Intravital multifotonmikroskopi
- Præparation
BEMÆRK: Opbevar en sprøjte med ultralydsgel inde i mikroskopets inkubatorkammer for at opretholde en varm temperatur til genopfyldning af lommerne under langvarig billeddannelse.- Fjern saltvand fra de to forberedte lommer og erstat det med ultralydgel for at dække sikkerhedsbeholderne (figur 2C).
- Injicer antistofopløsningen gennem halevenekateteret. 15 minutter efter antistofinjektion overføres puden med den faste mus til det opvarmede multifotonbilleddannelseskammer (figur 2F).
- Efter afslutningen af billedoptagelsen skal du aflive musen ved cervikal dislokation under dyb narkose.
- Optagelse af multifotonmikroskopibillede
BEMÆRK: Tænd mikroskopet 30 minutter før billedbehandling for at muliggøre laserstabilisering. For mikroskopets bedste optiske stabilitet anbefales det at holde mikroskopkammeret permanent opvarmet.- Tænd nøglen til Ti:Safir-laserboksen, de elektroniske grænsefladebokse, inkubationskammerets varmeenhed, lysstofrøret og computeren (figur 2D, E).
- Start anskaffelsessoftwaren (Inspector-software). Indstil bølgelængden til 800 nm, og åbn mikroskoplukkeren (figur 3A ii).
- I dialogboksen Guiden Måling skal du vælge Instrumenttilstand (Enkeltstråle) og i Måletilstand (3D-scanningstidsforløb) (Figur 3A i).
- Overfør den bedøvede mus ind i mikroskopets forvarmede inkubationskammer. Placer området med ultralydsgelen (trin 2.2.8) direkte i kontakt med objektivfrontlinsen (figur 2F).
- Åbn epifluorescensmikroskoplukkeren, vælg en passende filter/dikroisk indstilling til FITC-visualisering (4) for at finde interesseområdet ved at følge blodgennemstrømningen under epifluorescensbelysning. Når du har bragt interesseområdet ind i midterfeltet, skal du lukke epifluorescensmikroskoplukkeren.
- I dialogboksen xy-Scanner skal du indstille følgende parametre: Billedstørrelse (554x554), Pixel (512x512), Frekvens (400), Linjegennemsnit (1) (Figur 3A iii). Juster lasereffekten (5%) (figur 3A iv), og indstil fotomultiplikatorforstærkningen (PMT) for kanalerne grøn (66), rød (66) og blå (63) (figur 3A v).
- Vælg et passende mål for intravital billeddannelse og afdriftkorrektionsindstillinger (se nærmere i 3.2.11).
BEMÆRK: Her var det valgte mål Nikon LWD 16x (figur 3A vi). - Definer billedstakområdet ved at starte hentningstilstanden for forhåndsvisning ved at trykke på den røde knap i øverste højre hjørne af dialogboksen Måling (figur 3A i).
- Definer området og strukturen af interesse ved at fokusere for at opnå et godt billede. Mens du observerer skærmen, skal du derefter ændre fokus ved at flytte målet op, indtil billedet forsvinder, og indstille det til nul (first = 0). Skift fokus i modsat retning ved at flytte målet ned, indtil billedet forsvinder fra skærmen igen, og indstil det som den sidste (end= 40 μm) position i aksial retning (figur 3A vii).
- Indstil trinstørrelsen til 2 μm. Klik på den røde knap i øverste højre hjørne af dialogboksen Guiden Måling for at stoppe scanningen af forhåndsvisningen.
BEMÆRK: Antallet af billeder beregnes og indstilles automatisk (21 billeder), som angivet i figur 3A vii. - Hvis mikroskopet er udstyret med live-drift korrektion9, skal du starte driftskorrektionssoftwaren (f.eks. VivoFollow) og følge nedenstående trin.
- I dialogboksen Guiden Måling skal du vælge Python-aksen (Python Ax) (figur 3A viii) som den første akseenhed; Aktivér IKKE automatisk lagringstilstand. Markér kun feltet automatisk lagring (AS) på tidsaksen (Tid, Tid). Tryk på Python-ikonet i vinduet Tilgængelige enheder (figur 3A ix) for at åbne Python-dialogvinduet .
- I dialogboksen Python-akseindstillinger skal du indtaste Fra (0 nul) og Til (-40). Indtast Antal trin (21) som angivet i figur 3A x.
- Gå til dialogboksen xyz Stage Z , og forstør scanningsområdet med 200 μm i begge ender: Indtast (200 μm) i Start, og indtast (-240 μm) i End, indstilles området automatisk (-440 μm). Bevar trinstørrelsen (2 μm) som vist i figur 3A xi.
- Åbn VivoFollow Frontend-dialogen , og klik på feltet Bevægelsesprofil (figur 3A xii).
- Start billedhentning ved at trykke på den grønne pilespids i øverste venstre hjørne af dialogboksen Guiden Måling i infosoftwaren (figur 3A i).
- Hvis der anvendes korrektion af live-drift, skal du se efter en dialogboks, hvor konfigurationen af afvigelseskorrektion vises som vist i figur 3A xiii. Indstil den anskaffelseskanal, der skal bruges som reference for et immobilt vartegn (for denne protokol skal du vælge kanal 2, hvor det vaskulære sporsignal skal optages). Indtast den maksimale korrektionsforskydning i μm, der blev føjet til den første og sidste z-position (her 200 μm), og klik på OK.
- Overvåg den aktuelle forskydning i x, y og z i realtid under billedoptagelsen i VivoFollow fronted dialogvinduet Figur 3A xiv.
- Stop billeddannelse erhvervelse efter ~ 35 min, når en anden cyklus af anæstesi re-injektion er påkrævet. Injicer en halv dosis af MMF-blandingen (50 μl s.c), og genoptag billedoptagelsen ved at trykke på den grønne pilespids igen (trin 3.2.11.5).
- Gentag denne procedure, indtil eksperimentet er færdigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multifotonmikroskopi tilbyder en høj rumlig-tidsmæssig opløsning til leukocytsporing, hvor cellemigrationstrin og hastighed kan spores og overvåges (figur 4A, B). Imidlertid udgør prøvens fysiologiske bevægelse en udfordring, især for langsigtede intravitale mikroskopi-billedoptagelser. Derfor kræves et godt vævspræparat og holdere til at fiksere væv og værktøjer, såsom billeddannelseskorrektion i realtid for vævsdrift, for vellykket og stabil billeddannelseserhvervelse. Her blev et live-drift-værktøj, VivoFollow, anvendt til at korrigere for vævsdrift, der genereres under langvarig billeddannelseserhvervelse.
Anvendelsen af dette værktøj muliggør langsigtet billedoptagelse og muliggør indsamling af data af høj kvalitet, der er egnet til sporing af celler til hastighedsmålinger. Som vist i figur 3B glider interesseområdet gradvist væk fra optagelsesvisningen uden afvigelseskorrektion, hvilket påvirker evnen til at spore celler til hastighedsanalyse. Men som vist i figur 3C kan der med driftskorrektionssoftwaren optages stabile film, og flere celler kan spores over en lang periode. Driftskorrektionssoftwaren kan også give en visualisering af x-, y- og z-forskydningerne over tid, som systemet korrigerede for, som vist i figur 3D.
Figur 1: Laser Doppler Imaging opsætning og forberedelse til lårbensarterieligering og vævsforberedelse til intravital billeddannelse. (A) LDI-billeddannelsesopsætning. (B) Musen placeres inde i LDI-opvarmningskammeret til billedoptagelse. (C) LDI-billeder af højre og venstre ben før (øverste panel) og efter FAL (nederste panel) for at kontrollere bagbenets perfusion efter ligering. Den højre lårbensarterie blev ligeret / okkluderet, mens venstre lårbensarterie blev skamopereret (Sham) og fungerede som en intern kontrol. I farvebjælken indikerer blå lav blodperfusion, og rød indikerer højere perfusion. (D-K) Billeder repræsenterer kirurgiske trin i lårbenets arterielle ligering. Skalastang = 10 mm. (L-S) Vævsforberedelse til intravital billeddannelse efter FAL. Det område, der skal afbildes, er angivet med den sorte cirkel, hvor sikkerhedsskibene er placeret. Skalabjælke = 5 mm. Forkortelser: LDI = Laser Doppler billeddannelse; FAL = lårbensarterieligering; Occ = okklusion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opsætning til multifoton intravital billeddannelse. A) tilberedning af venekateter 1-Fin polyethylenslange på 10 cm, 2: 2x 30 G nål; 3: monteret kateter forbundet med 1 ml sprøjte; 4: vævshistoacryllim; 5: Kanyleholder. (B) Musen placeret i liggende stilling med begge bagben placeret på stykker sort modellervoks (røde pile) forberedt til billeddannelse. (C) Okkluderet (Occ) højre bagben og venstre, skambetjent bagben klar til billeddannelse. D) Multifotonmikroskopopsætning, der viser laserbokse, fluorescenslampeboks, rør til opvarmning af inkubatorkammeret. E) Multifotonmikroskopets inkubatorkammer. (F) Mus placeret inde i mikroskopkammeret med 16x objektivet, der berører vævet dækket med ultralydgel. Detalje, der viser venekateteret fastgjort på halevenen til antistofinjektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opsætning af VivoFollow drift correction software. (A) (i-xiv) Trin til opsætning af software som beskrevet i protokoltrin 3.2.2-3.2.11.9. (B) Repræsentative tidsseriebilleder, der viser billeddriften, uden at afdriftkorrektionssoftware er slået til. Sikkerhedsarterien er afgrænset af de hvide afbrudte linjer (video 1 og video 2). (C) Repræsentative tidsseriebilleder, der viser de stabile tidsserier, når korrektionen for livedrift anvendes under billeddannelsesoptagelse. Leukocytter blev mærket med CD45-PE-antistoffer (rød), blodplader blev mærket med CD41-FITC-antistoffer (grøn) og kollagen type 1 med SGH (blå). Sikkerhedsarterien er afgrænset af de hvide afbrudte linjer. (D) Kurvediagram, der viser den strømførende korrektion i x-, y- og z-retningen. Forkortelser: PE = phycoerythrin; FITC = fluoresceinisothiocyanat; SGH = anden harmonisk generation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater . (A) Leukocythastigheder målt i sidearterier i skamopererede (Sham) og lårbensarterieligerede bagben. (B) Repræsentative billeder viser cellerne sporet (magenta) med sporene farvekodede. Farvekodelinjen repræsenterer cellehastigheden med de langsommere celler vist med blå spor og hurtigere celler med røde spor. Leukocytter blev mærket med injicerede CD45-PE-antistoffer (rød), blodplader blev mærket med injicerede CD41-FITC-antistoffer (grøn) og kollagen type 1 med SGH (blå). Resultater fra tre individuelle eksperimenter. Skalabjælke = 20 μm. Se video 3 og video 4. Forkortelser: Occ= okkluderet/lårbensarterie-ligeret; PE = phycoerythrin; FITC = fluoresceinisothiocyanat; SGH = anden harmonisk generation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Multifoton intravital billeddannelse af en sikkerhedsarterie uden driftkorrektion. Firedimensionelle billeder blev optaget med en pixelstørrelse på 554 x 554 μm, frekvens 600 Hz, et interval på 1100 ms / ramme, trinstørrelse på 2 μm og rækkevidde på 40 μm. Videoen viser billedet drivende uden anvendelse af VivoFollow drift korrektion software. Sikkerhedsarterien vises i den nederste del af videoen, og sikkerhedsvenen vises efter 3 minutter i den øverste del af filmen. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Multifoton intravital billeddannelse af en sikkerhedsarterie med anvendt driftkorrektion. Firedimensionelle billeder blev taget med en pixelstørrelse på 554 x 554 μm, frekvens 600 Hz, et interval på 1100 ms / ramme, trinstørrelse på 2 μm og rækkevidde på 40 μm. Videoen blev optaget med live drift korrektion software, VivoFollow, og viser billeddannelsen stabilitet fremmes ved at anvende drift korrektion software. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Cellesporingsbilleddannelse i en sikkerhedsarterie efter skinoperation. Leukocytter mærket med injicerede anti-CD45-PE-antistoffer blev afbildet i en hvilende sikkerhedsarterie i det skamopererede ben og spores ved hjælp af Imaris-software med plugin til sporing af celler. Sporede celler blev valgt og repræsenteret af de magenta prikker. Sporene var farvekodede i henhold til cellehastigheden. Langsommere celler repræsenteres af blå spor og hurtigere celler af røde spor. Skalabjælke = 50 μm. Forkortelse = PE = phycoerythrin. Klik her for at downloade denne video.
Video 4: Cellesporingsbilleddannelse i en sikkerhedsarterie efter FAL. Leukocytter mærket med anti-CD45-PE-antistoffer blev afbildet i en voksende sikkerhedsarterie 24 timer efter induktion af arteriogenese af FAL og spores ved hjælp af Imaris-software med plugin til sporing af celler. Sporede celler blev valgt og repræsenteret af de magenta prikker. Sporene var farvekodede i henhold til cellehastigheden. Langsommere celler repræsenteres af blå spor og hurtigere celler af røde spor. Skalabjælke = 50 μm. Forkortelser: FAL = lårbensarterieligering; PE = phycoerythrin. Klik her for at downloade denne video.
| Tekniske problemer | Forslag til løsninger | |
| Hvis halebeholderne ikke er synlige for indførelse af kateteret | • Brug en varm komprimering omkring musehalen i 3-5 minutter for at fremme lokal vasodilatation. Det vil bidrage til at gøre venen synlig. | |
| Hvis halekateteret ikke kan fastgøres til antistofinjektion | • Brug en 1 ml sprøjte med 30 G kanyle til at indføre i venen og injicere antistoffer og farvestoffer direkte før billeddannelse. | |
| • I nogle tilfælde (afhængigt af antistofferne) kan injektionen påføres i.p. 1 time før billeddannelse. | ||
| Når vævets bevægelse hæmmer billeddannelsesstabiliteten | • Prøv at omplacere og fastgøre musens øverste spidsben for at undgå de fysiologiske abdominale bevægelser. | |
| • Kontroller, om mikroskopbordet har luft nok til at annullere vibrationer. | ||
| • Sørg for, at musen er i dyb bedøvelse og ikke vågner op. | ||
| • Overvåg musens vejrtrækning. Når musen trækker vejret for hurtigt, kan det påvirke billeddannelsesbevægelsen. | ||
| Når billedkvaliteten begynder at falde | • Sørg for, at ultralydgelen ikke tørrer ud. | |
| • Genopfyld ultralydsgelen. | ||
| • Sørg for, at målet er rent (rengør den tørrede ultralydgel på målet, når en ny genopfyldning udføres). | ||
| Når arterierne er beskadiget under forberedelse til billeddannelse | • I dette tilfælde vil det ikke være muligt at erhverve billeder. Det er ikke muligt at køre eksperimentet. | |
Tabel 1: Fejlfinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne metode til multifoton in vivo-analyse af leukocytrekruttering repræsenterer et supplement til almindeligt anvendte værktøjer til leukocytrekrutteringsundersøgelser såsom (immun-) histologiske eller FACS-analyser. Med denne billeddannelsesmetode er det muligt at visualisere mere detaljeret de dynamiske processer i leukocytadhærens og ekstravasation under arteriogenese10. På trods af merværdien af denne metode indeholder den tilbudte protokol nogle kritiske trin og begrænsninger. Se tabel 1 for at få flere tip til fejlfinding. Under fjernelsen af det overfladiske muskellag på sikkerhedsarterier kan disse arterier blive beskadiget og vil ikke være nyttige til intravital billeddannelse. Kateteret skal være godt fastgjort til antistofinjektion; Ellers kan glidning af halevenekateteret forårsage ekstravasation af antistofferne i halens perivaskulære rum, hvilket gør udskiftning og yderligere korrektion til injektion af antistofferne en udfordrende opgave. Den korrekte identifikation af sikkerhedsarterien og sikkerhedsvenen under intravital mikroskopi repræsenterer et andet kritisk trin i denne protokol.
Da musen ikke er mekanisk ventileret under intravital mikroskopi, er den dynamiske billeddannelsestid begrænset for at undgå fysisk skade på musen som følge af for lang anæstesi. En af manglerne ved intravital mikroskopi er musens fysiologiske bevægelse, der genereres af åndedræt, hjerteslag og peristaltiske bevægelser, der kan påvirke billedoptagelse og dermed kvaliteten af dataanalyser. Forbedring af vævsholdere, montering og fiksering er trin, der yderligere reducerer virkningerne af bevægelse. Ud over den fysiologiske bevægelse kan langtidsbilleddannelse bidrage til vævsdrift under billeddannelse. Som beskrevet i denne protokol blev en realtids vævsdriftkorrektionssoftware, VivoFollow, anvendt til at opnå billeddata, der var egnede til efterfølgende cellesporing og cellehastighedsanalyse. Denne VivoFollow-software korrigerer for prøveforskydningen i x, y og z direkte under billedoptagelse. Det er afhængig af immobil anatomisk struktur, for eksempel når skibe visualiseres med vaskulære sporstoffer, der tjener som referencemærker for korrektionsproceduren.
Selvom der er andre driftskorrektionsværktøjer efter erhvervelse tilgængelige, såsom dem inden for Bitplane Imaris eller plugins til ImageJ, er de meget begrænsede i deres kapacitet til korrektion, da de ikke tillader gendannelse af interesseområdet. I princippet kan de ikke korrigere for alvorlige udligninger, når interesseregionen bevæger sig ud af synsfeltet. Denne protokol kan dog anvendes, selv når live-drift-korrektionen ikke er tilgængelig, og korrektion efter anskaffelse bliver nødvendig. Dette kræver dog hyppig træning af personale i vævsmontering og fiksering. Afslutningsvis er multifoton intravital mikroskopi en nyttig dynamisk metode, der kan anvendes parallelt med statiske etablerede metoder såsom (immuno-) histologiske analyser for at få et mere detaljeret billede af de dynamiske komponenter i leukocytrekruttering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, projekt Z01). Vi takker Dr. Susanne Stutte for at have læst manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
