Summary
Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.
Abstract
Die Arteriogenese hängt stark von der Rekrutierung von Leukozyten und Thrombozyten in den perivaskulären Raum wachsender Kollateralgefäße ab. Der Standardansatz für die Analyse von Kollateralarterien und Leukozyten in der Arteriogenese ist die ex vivo (immun-)histologische Methodik. Diese Technik erlaubt jedoch nicht die Messung dynamischer Prozesse wie Blutfluss, Scherspannung, Zell-Zell-Wechselwirkungen und Partikelgeschwindigkeit. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Überwachung von In-vivo-Prozessen in wachsenden Kollateralarterien während der Arteriogenese unter Verwendung intravitaler Bildgebung vorgestellt. Die hier beschriebene Methode ist ein zuverlässiges Werkzeug zur Dynamikmessung und bietet eine kontrastreiche Analyse mit minimaler Photozytotoxizität, die durch Multiphotonen-Anregungsmikroskopie ermöglicht wird. Vor der Analyse wachsender Kollateralarterien wurde die Arteriogenese im Adduktorenmuskel von Mäusen durch einseitige Ligatur der Oberschenkelarterie induziert.
Nach der Ligatur begannen die bereits vorhandenen Kollateralarterien aufgrund der erhöhten Scherspannung zu wachsen. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation wurden die Haut und das Unterhautfett über den Seitenarterien entfernt, wodurch eine Tasche für weitere Analysen entstand. Um den Blutfluss und die Immunzellen während der In-vivo-Bildgebung sichtbar zu machen, wurden CD41-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (Thrombozyten) und CD45-Phycoerythrin (PE) (Leukozyten) Antikörper intravenös (i.v.) über einen Katheter injiziert, der in die Schwanzvene einer Maus gelegt wird. In diesem Artikel wird die intravitale Multiphotonenbildgebung als Alternative oder in vivo Ergänzung zu den häufig verwendeten statischen ex vivo (immun-) histologischen Analysen zur Untersuchung von Prozessen vorgestellt, die für die Arteriogenese relevant sind. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine neuartige und dynamische in vivo Methode zur Untersuchung des Immunzelltransports, des Blutflusses und der Scherbelastung in einem Hintergliedmaßenmodell der Arteriogenese, was die Evaluierungsmöglichkeiten erheblich verbessert.
Introduction
Trotz intensivem Forschungsinteresse in den letzten Jahren sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen, z. B. ischämische Herzkrankheit und Schlaganfall, nach wie vor die weltweit häufigste Todesursache1. Gegenwärtig werden diese Erkrankungen mit hochinvasiven Therapien wie der perkutanen transluminalen Angioplastie, der perkutanen transluminalen Koronarangioplastie oder der Bypass-Operationbehandelt 2. Daher ist die Entwicklung alternativer, nicht-invasiver Therapieoptionen dringend erforderlich. Der Körper kann natürliche Bypässe um ein verstumpftes oder verschlossenes Gefäß herum anlegen, um den unterbrochenen Blutfluss in den distalen Teil der Stenose umzuleiten. Dieser Prozess wird als Arteriogenese2 bezeichnet. Viele neuere Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte Flüssigkeitsscherung die Rekrutierung von Leukozyten beeinflusst, die eine wichtige Rolle bei der Arteriogenesespielt 3. Die wichtigsten aktuellen Optionen zur Analyse der Rekrutierung von Leukozyten während der Arteriogenese sind ex vivo (immun-)histologische Analysen oder die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)4. Um die Leukozytendynamik während der Arteriogenese beurteilen zu können, wird in dieser Arbeit ein intravitales Bildgebungsprotokoll mit Multiphotonenmikroskopie vorgestellt.
Leukozyten sind die wichtigsten Blutzellen, die während des Prozesses der Arteriogenese rekrutiertwerden 3. Dieses Protokoll verwendet Multiphotonen-Bildgebung, um das Kriechen von adhärenten Leukozyten, die mit injizierten Anti-CD45-PE-Antikörpern markiert waren, in Kollateralarterien 24 h nach der Induktion der Arteriogenese durch Femoralarterienligatur (FAL) unter Verwendung eines murinen Hintergliedmaßen-Ischämiemodells zu zeigen 5,6. Alternativ können Immunzellen ex vivo markiert und Mäusen schonend injiziert werden, wie Studien zur Angiogenese mittels Intravitalmikroskopiegezeigt haben 7. Der Blutfluss in Gefäßen und Arterien kann durch CD41-FITC (zur Markierung von Blutplättchen), Dextran-FITC (Plasma) oder durch die zweite harmonische Generation (SHG) visualisiert werden, die Kollagen Typ 1 in der Basalmembran eines Teils des Gefäßbaums sichtbar macht. SHG ist ein einzigartiger freier Markierungseffekt der Multiphotonenanregung. Die Multiphotonen-Bildgebung ermöglicht eine langfristige Zellverfolgung, ohne das Gewebe zu schädigen und die Zellen durch Anregung mit Laserleistung zu aktivieren. Die Multiphotonenmikroskopie ist die Bildgebungsmethode der Wahl für die Visualisierung fluoreszenzmarkierter Zellen und Strukturen in lebenden Tieren, da sie die Fluorophore mit minimaler Phototoxizität tiefer in das Gewebe/die Organe anregen kann8.
Die Verwendung von abgestimmten Infrarotlasern mit Pulsen, die in Femtosekundenintervallen abgegeben werden, regt das Fluorochrom nur in der Brennebene an, ohne Anregung oberhalb und unterhalb der Brennebene8. Somit ermöglicht die Multiphotonenmikroskopie eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung, weniger Lichtschäden und eine erhöhte Gewebedurchdringungsbildgebung zur Untersuchung dynamischer biologischer Ereignisse in den Organen. Es ist ein ideales Mikroskopiewerkzeug für die Bildgebung lebender Tiere. Multiphotonen und jede andere Kunst der intravitalen Mikroskopie sind jedoch durch Gewebebewegungen aufgrund von Herzschlag, Atmung, peristaltischen Bewegungen, Muskeltonalität und anderen physiologischen Funktionen begrenzt, was die Bildaufnahme und -analyse stört. Da diese Bewegungen die zeitliche und räumliche Auflösung beeinträchtigen und manchmal sogar eine nachträgliche Analyse verhindern, müssen sie angemessen berücksichtigt werden, um eine genaue Datenanalyse und -interpretation zu ermöglichen. Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, um Artefakte durch Gewebebewegungen zu verringern oder zu verhindern. Dieses Protokoll wendet eine In-situ-Driftkorrektursoftware namens VivoFollow9 an, um die Gewebedrift während der Bildaufnahme zu korrigieren. Dieser Ansatz bietet die erforderliche Bildstabilisierung und ermöglicht eine Langzeitbildgebung und Zellverfolgungsanalyse.
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Protocol
Diese Studie wurde vom Bayerischen Tierschutzausschuss genehmigt (genehmigt durch den Ethikkodex: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Diese Versuche wurden unter strikter Einhaltung der deutschen tierrechtlichen Richtlinien durchgeführt.
1. Tiere und Ligatur der Oberschenkelarterie (FAL)
HINWEIS: Um eine sterile Entzündung und Arteriogenese zu induzieren, wurden 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Keine der Mäuse starb oder litt an einer Wundinfektion oder Wundheilungsstörung während bzw. nach einer FAL- bzw. Scheinoperation.
- Anästhesie
HINWEIS: Vor der Injektion der MMF-Mix-Anästhesie wird empfohlen, zunächst mit 5% Isofluran zu betäuben, bis die Maus schläft.- Wiegen Sie die Maus und bereiten Sie eine MMF-Mischung mit einer Dosis von Midazolam 5,0 mg/kg, Medetomidin 0,5 mg/kg und Fentanyl 0,05 mg/kg zu.
- Füllen Sie eine 1 mL Spritze mit MMF-mix und injizieren Sie ein Endvolumen von 100 μL s.c. mit einer 30 G Nadel (nach Narkose mit 5% Isofluran).
- Legen Sie die Maus auf ein warmes Pad und warten Sie, bis die Maus vollständig betäubt ist. Stellen Sie den Timer auf 35 Minuten. Nach dieser Zeit wird s.c. die Hälfte der Dosis (50 μL) des MMF-Mixes injiziert.
- Überprüfen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Pedal- und Interdigitalreflexe (durch festes Zehendrücken) der Maus testen.
HINWEIS: Ein ausbleibendes Ansprechen deutet auf eine ausreichende Analgesietiefe hin.
- Ligatur der Arteria femoralis (FAL)
Anmerkungen: Verwenden Sie sterile chirurgische Instrumente und Nähte. Desinfizieren Sie die Haut vor dem Öffnen und nach dem Schließen mit Desinfektionsmittel.- Legen Sie die betäubte Maus auf eine Heizplatte (35-37 °C), um die physiologische Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Tragen Sie Augencreme (Dexpanthenol) auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen der Augen unter Narkose zu verhindern.
- Die anästhesierte Maus wird vor und nach der FAL in eine Laser-Doppler-Bildgebungskammer (LDI) gebracht, um den Blutfluss und die Perfusion zu überprüfen (Abbildung 1A-C).
- Entfernen Sie Haare, desinfizieren Sie die Haut und machen Sie einen Schnitt, um Zugang zur Oberschenkelarterie zu erhalten. Unter einem Operationsmikroskop ligieren Sie die rechte Oberschenkelarterie der Maushintergliedmaße mit einer geflochtenen Seidennaht (7-0) und führen Sie eine Scheinoperation an der linken Oberschenkelarterie durch, die als interne Kontrolle dient, wie zuvor beschrieben6 (Abbildung 1D-K).
HINWEIS: Der Hautschnitt wurde mit einer kleinen Schere vorgenommen, um eine direkte Verletzung der hautnahen Blutgefäße zu vermeiden. - Verschließen Sie die Haut mit einer geflochtenen Seidennaht (6-0). Verabreichen Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) s.c. alle 12 Stunden, beginnend 10 Minuten vor Beginn der Anästhesie zur Schmerzlinderung. Beobachten Sie das Tier 24 Stunden nach der Operation auf Schmerzsignale, d. h. verminderte Fellpflege, Bewegungsunlust oder gekrümmte Körperhaltung.
- Injizieren Sie (s.c.) eine Kombination aus Naloxon (1,2 mg/kg), Flumazenil (0,5 mg/kg) und Atipamezol (2,5 mg/kg), um die Anästhesie nach Abschluss der FAL und Verschluss der Haut zu antagonisieren.
- Halten Sie die Maus nach der Operation auf dem warmen Pad und überwachen Sie das Tier kontinuierlich, bis es eine aufrechte Haltung einnehmen und normal um den Käfig herumlaufen kann.
- Wenn die Maus vollständig wach ist, setzen Sie sie zusammen mit den anderen Mäusen wieder in den Käfig und bringen Sie den Käfig in den Stallraum zurück.
2. Gewebepräparation für die Multiphotonen-Intravital-Bildgebung
- Injektion der Schwanzvene
HINWEIS: Das Tier muss unter Narkose stehen, bevor es mit der Vorbereitung für die intravitale Bildgebung beginnt. Vor dem Einführen der Nadel des Venenkatheters wird empfohlen, ein Hautdesinfektionsmittel auf den Schwanz aufzutragen. Dies hilft auch bei der Visualisierung der Gefäße.- Bereiten Sie einen Schwanzvenen-Injektionskatheter mit einer 2 x 30 G-Nadel, 10 cm einem Polyethylenschlauch mit feinem Durchmesser (0,28 mm Innendurchmesser und 0,61 mm Außendurchmesser), einer 1-ml-Spritze und einem Histoacrylkleber vor, um den Katheter am Mausschwanz für weitere intravenöse Injektionen während der Bildgebung zu fixieren (Abbildung 2A, B und Abbildung 2F).
- Bereiten Sie die Antikörperlösung für die intravenöse Injektion vor: CD45-PE und CD41-FITC (20 μg/Maus) mit einem Endvolumen von 100 μl.
- Überprüfen Sie den Schwanz auf die seitlich gelegenen Schwanzadern und stauen Sie die Vene, um die Schwanzvene zu identifizieren. Desinfizieren Sie den Schwanz, führen Sie den Venenkatheter ein und fixieren Sie ihn mit Gewebehistoacrylkleber (Abbildung 2B).
- Injizieren Sie die Antikörper vor der Bildgebung (mindestens 15 Minuten vorher) und nach Abschluss der Gewebepräparation.
- Gewebevorbereitung
Anmerkungen: Verwenden Sie immer ein warmes Pad und verabreichen Sie vor der Gewebevorbereitung einen Tropfen Augencreme (Dexpanthenol) in jedes Auge. Verwenden Sie sterile chirurgische Instrumente und Nähte. Desinfizieren Sie die Haut vor dem Öffnen und nach dem Schließen mit Desinfektionsmittel.- Legen Sie die betäubte Maus auf eine stabile und tragbare Unterlage. Fixieren Sie die Maus in Rückenlage mit einer 4-Punkt-Fixierung auf dem Pad mit Klebeband (Abbildung 2B).
- Formen Sie zwei Stücke Modelliermasse und legen Sie die Stücke unter das obere Hinterbein der Maus, um eine ebene Position des Adduktorenmuskels zu gewährleisten (Abbildung 2B, gekennzeichnet durch rote Pfeile).
- Um eine stabile Körpertemperatur von 37 °C der Maus zu gewährleisten, legen Sie das Pad mit der Maus auf eine Heizplatte unter einem Operationsmikroskop mit einem 0,64-4,0-fachen Zoom (Abbildung 1L).
- Entfernen Sie die Haare von beiden Beinen, desinfizieren Sie die Haut und schneiden Sie die Haut kreisförmig um die Narbe der früheren Oberschenkelarterie der rechten Hintergliedmaße (Abbildung 1M).
- Entfernen Sie die Haut- und Fettschicht von der Oberseite des Beins (Abbildung 1N,O) und ziehen Sie die restliche Haut mit Nähten beiseite, um eine Tasche um den Adduktorenmuskel zu schaffen (Abbildung 1P, Q).
- Entfernen Sie subkutanes Fett, um eine klare Sicht auf den Adduktorenmuskel und die Arterie/Vene tiefgründig sowie die Kollateralgefäße zu erhalten (Abbildung 1Q,R).
- Beginnen Sie vorsichtig mit der Entfernung der oberflächlichen Muskelschicht auf den Kollateralgefäßen, indem Sie sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette präparieren (Abbildung 1R).
HINWEIS: Die Arteria collateralis und die Vena collateralis sind deutlich sichtbar und bereit für die Bildgebung (Abbildung 1S). - Füllen Sie die vorbereitete Tasche mit Kochsalzlösung, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden, und fahren Sie mit dem gleichen Verfahren für das scheinoperierte linke Hinterbein fort. Geben Sie vor der Bildgebung Ultraschallgel in beide Taschen, das ein Austrocknen verhindert und als Immersionsmedium für die optische Kopplung mit dem Objektiv dient (Abbildung 2C und Abbildung 2F).
3. Intravitale Multiphotonenmikroskopie
- Präparat
Anmerkungen: Bewahren Sie eine Spritze mit Ultraschallgel in der Inkubatorkammer des Mikroskops auf, um eine warme Temperatur zum Auffüllen der Taschen während der Langzeitbildgebung aufrechtzuerhalten.- Entfernen Sie die Kochsalzlösung aus den beiden vorbereiteten Taschen und ersetzen Sie sie durch Ultraschallgel, um die Kollateralgefäße abzudecken (Abbildung 2C).
- Injizieren Sie die Antikörperlösung durch den Schwanzvenenkatheter. 15 min nach der Antikörperinjektion wird das Pad mit der fixierten Maus in die erwärmte Multiphotonen-Bildgebungskammer übertragen (Abbildung 2F).
- Nach Abschluss der Bildaufnahme wird die Maus durch zervikale Luxation unter tiefer Narkose eingeschläfert.
- Multiphotonenmikroskopische Bildaufnahme
Anmerkungen: Schalten Sie das Mikroskop 30 Minuten vor der Bildgebung ein, um eine Laserstabilisierung zu ermöglichen. Für die beste optische Stabilität des Mikroskops empfiehlt es sich, die Mikroskopkammer dauerhaft beheizt zu halten.- Schalten Sie den Schlüssel der Ti:Sapphire-Laserbox, der elektronischen Schnittstellenboxen, der Heizeinheit der Inkubationskammer, der Leuchtstofflampe und des Computers ein (Abbildung 2D, E).
- Starten Sie die Erfassungssoftware (Inspector-Software). Stellen Sie die Wellenlänge auf 800 nm ein und öffnen Sie den Mikroskopverschluss (Abbildung 3A ii).
- Wählen Sie im Dialogfeld Messassistent den Gerätemodus (Einzelstrahl) und im Messmodus (3D-Scan-Zeitraffer) (Abbildung 3A i).
- Übertragen Sie die anästhesierte Maus in die vorgewärmte Inkubationskammer des Mikroskops. Positionieren Sie den Bereich mit dem Ultraschallgel (Schritt 2.2.8) direkt in Kontakt mit der Objektiv-Frontlinse (Abbildung 2F).
- Öffnen Sie den Verschluss des Epifluoreszenzmikroskops und wählen Sie eine geeignete Filter-/dichroitische Einstellung für die FITC-Visualisierung (4), um den interessierenden Bereich zu finden, indem Sie den Blutfluss unter Epifluoreszenzbeleuchtung verfolgen. Nachdem Sie den interessierenden Bereich in das mittlere Sichtfeld gebracht haben, schließen Sie den Verschluss des Epifluoreszenzmikroskops.
- Stellen Sie im xy-Scanner-Dialog die folgenden Parameter ein: Bildgröße (554x554), Pixel (512x512), Frequenz (400), Zeilendurchschnitt (1) (Abbildung 3A iii). Stellen Sie die Laserleistung (5 %) ein (Abbildung 3A iv) und stellen Sie die Verstärkung des Photomultipliers (PMT) für die Kanäle Grün (66), Rot (66) und Blau (63) ein (Abbildung 3A v).
- Wählen Sie ein geeignetes Objektiv für die intravitale Bildgebung und die Einstellungen für die Driftkorrektur (siehe Details in 3.2.11).
HINWEIS: Hier wurde das Nikon LWD 16x als Objektiv ausgewählt (Abbildung 3A vi). - Definieren Sie den Bildstapelbereich, indem Sie den Vorschauerfassungsmodus starten , indem Sie auf die rote Schaltfläche in der oberen rechten Ecke des Dialogfensters des Messassistenten klicken (Abbildung 3A i).
- Definieren Sie den Bereich und die Struktur des Interesses, indem Sie fokussieren, um ein gutes Bild zu erhalten. Ändern Sie dann während der Beobachtung des Bildschirms den Fokus, indem Sie das Objektiv nach oben bewegen, bis das Bild verschwindet, und stellen Sie es auf Null (first= 0). Ändern Sie den Fokus in die entgegengesetzte Richtung, indem Sie das Objektiv nach unten bewegen, bis das Bild wieder vom Bildschirm verschwindet, und stellen Sie es als letzte (Ende = 40 μm) Position in axialer Richtung ein (Abbildung 3A vii).
- Stellen Sie die Schrittweite auf 2 μm ein. Klicken Sie auf die rote Schaltfläche in der oberen rechten Ecke des Dialogfelds Messassistent , um den Vorschau-Scan zu stoppen.
HINWEIS: Die Anzahl der Bilder wird automatisch berechnet und eingestellt (21 Bilder), wie in Abbildung 3A vii angegeben. - Wenn das Mikroskop mit der Live-Drift-Korrektur9 ausgestattet ist, starten Sie die Driftkorrektur-Software (z. B. VivoFollow) und befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte.
- Wählen Sie im Dialogfeld Mess-Assistent die Python-Achse (Python Ax) (Abbildung 3A viii) als erstes Achsengerät aus. Aktivieren Sie NICHT den automatischen Speichermodus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatisches Speichern (AS) nur auf der Zeitachse (Zeitzeit). Klicken Sie auf das Python-Symbol im Fenster "Verfügbare Geräte" (Abbildung 3A ix), um das Python-Dialogfenster zu öffnen.
- Geben Sie im Python-Dialogfeld Achseneinstellungen von (0 null) und bis (-40) ein. Geben Sie die Anzahl der Schritte (21) ein, wie in Abbildung 3A x dargestellt.
- Rufen Sie das Dialogfenster xyz Stage Z auf und vergrößern Sie den Scanbereich an beiden Enden um 200 μm: Geben Sie in Start (200 μm) und in Ende (-240 μm) ein, der Bereich wird automatisch eingestellt (-440 μm). Behalten Sie die Schrittweite (2 μm) wie in Abbildung 3A xi gezeigt bei.
- Öffnen Sie das Dialogfeld " VivoFollow-Frontend " und klicken Sie auf das Feld "Bewegungsprofil " (Abbildung 3A xii).
- Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf die grüne Pfeilspitze in der oberen linken Ecke des Dialogfelds Messassistent der Inspektor-Software drücken (Abbildung 3A i).
- Wenn die Live-Drift-Korrektur verwendet wird, suchen Sie nach einem Dialogfeld, in dem die Konfiguration der Driftkorrektur angezeigt wird, wie in Abbildung 3A xiii gezeigt. Legen Sie den Erfassungskanal fest, der als unbewegliche Orientierungspunktreferenz verwendet werden soll (wählen Sie für dieses Protokoll Kanal 2, in dem das vaskuläre Tracersignal aufgezeichnet werden soll). Geben Sie den maximalen Korrekturversatz in μm ein, der an der ersten und letzten z-Position (hier 200 μm) addiert wurde, und klicken Sie auf OK.
- Überwachen Sie den aktuellen Drift-Offset in x, y und z in Echtzeit während der Bildaufnahme im VivoFollow-Frontdialogfenster Abbildung 3A xiv.
- Beenden Sie die Bildaufnahme nach ~35 Minuten, wenn ein weiterer Zyklus der Anästhesie-Reinjektion erforderlich ist. Injizieren Sie eine halbe Dosis des MMF-Mixes (50 μl s.c.) und starten Sie die Bildaufnahme erneut, indem Sie erneut auf die grüne Pfeilspitze drücken (Schritt 3.2.11.5).
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Experiment beendet ist.
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Representative Results
Die Multiphotonenmikroskopie bietet eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung für das Leukozyten-Tracking, wobei Zellmigrationsschritte und -geschwindigkeiten verfolgt und überwacht werden können (Abbildung 4A,B). Die physiologische Bewegung der Probe stellt jedoch eine Herausforderung dar, insbesondere für Langzeitaufnahmen in der Intravitalmikroskopie. Daher sind eine gute Gewebepräparation und Halterungen zur Fixierung des Gewebes sowie Werkzeuge, wie z. B. die Echtzeit-Bildgebungskorrektur für Gewebedrift, für eine erfolgreiche und stabile Bildgebung erforderlich. Hier wurde ein Live-Drift-Tool, VivoFollow, eingesetzt, um die Gewebedrift zu korrigieren, die während der Langzeit-Bildgebung erzeugt wird.
Die Anwendung dieses Tools ermöglicht eine langfristige Bildaufnahme und ermöglicht die Erfassung qualitativ hochwertiger Daten, die für die Verfolgung von Zellen für Geschwindigkeitsmessungen geeignet sind. Wie in Abbildung 3B dargestellt, driftet der interessierende Bereich ohne Driftkorrektur zunehmend von der Aufzeichnungsansicht weg, was sich auf die Fähigkeit auswirkt, Zellen für die Geschwindigkeitsanalyse zu verfolgen. Wie in Abbildung 3C gezeigt, können mit der Driftkorrektursoftware jedoch stabile Filme aufgezeichnet und mehr Zellen über einen langen Zeitraum verfolgt werden. Die Driftkorrektursoftware kann auch eine Visualisierung der x-, y- und z-Offsets im Laufe der Zeit bereitstellen, die das System korrigiert hat, wie in Abbildung 3D dargestellt.
Abbildung 1: Aufbau und Vorbereitung der Laser-Doppler-Bildgebung für die Ligatur der Oberschenkelarterien und Gewebepräparation für die intravitale Bildgebung. (A) LDI-Bildgebungsaufbau. (B) Die Maus wird zur Bildaufnahme in die LDI-Wärmekammer gelegt. (C) LDI-Aufnahmen des rechten und linken Beins vor (oberes Bild) und nach FAL (unteres Bild), um die Perfusion der Hintergliedmaßen nach der Ligatur zu überprüfen. Die rechte Oberschenkelarterie war ligiert/verschlossen, während die linke Oberschenkelarterie scheinoperiert (Sham) war und als interne Kontrolle diente. Im Farbbalken steht Blau für eine geringe Blutdurchblutung und Rot für eine höhere Durchblutung. (D-K) Die Bilder stellen die Operationsschritte der femoralen arteriellen Ligatur dar. Maßstabsbalken = 10 mm. (L-S) Gewebepräparation für die intravitale Bildgebung nach FAL. Der abzubildende Bereich wird durch den schwarzen Kreis angezeigt, in dem sich die Kollateralgefäße befinden. Maßstabsleiste = 5 mm. Abkürzungen: LDI = Laser-Doppler-Bildgebung; FAL = Ligatur der Oberschenkelarterie; Occ = Okklusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Aufbau für die intravitale Multiphotonen-Bildgebung. (A) Venenkathetervorbereitung; 1-Feiner Polyethylenschlauch von 10 cm, 2: 2x 30 g Nadel; 3: montierter Katheter mit 1-ml-Spritze; 4: Gewebe-Histoacryl-Kleber; 5: Nadelhalter. (B) Die Maus in Rückenlage, wobei beide Hinterbeine auf schwarze Modelliermasse (rote Pfeile) gelegt sind, die für die Bildgebung vorbereitet sind. (C) Okkludierte (Occ) rechte Hintergliedmaße und linke, scheinoperierte Hintergliedmaße, bereit für die Bildgebung. (D) Multiphotonen-Mikroskopaufbau mit Laserboxen, Fluoreszenzlampenbox, Röhren zur Beheizung der Inkubatorkammer. (E) Inkubatorkammer des Multiphotonenmikroskops. (F) Maus, die in der Mikroskopkammer platziert wird, wobei das 16-fache Objektiv das mit Ultraschallgel bedeckte Gewebe berührt. Detail zeigt den Venenkatheter, der zur Injektion von Antikörpern an der Schwanzvene befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Einrichtung der VivoFollow-Driftkorrektur-Software. (A) (i-xiv) Software-Setup-Schritte wie in Protokollschritt 3.2.2-3.2.11.9 beschrieben. (B) Repräsentative Zeitreihenbilder, die zeigen, dass die Bildgebung ohne eingeschaltete Driftkorrektursoftware driftet. Die Arteria collateral wird durch die weißen, unterbrochenen Linien begrenzt (Video 1 und Video 2). (C) Repräsentative Zeitreihenbilder, die die stabile Zeitreihe zeigen, wenn die Live-Driftkorrektur während der Bildaufnahme angewendet wird. Leukozyten wurden mit CD45-PE-Antikörpern (rot), Thrombozyten mit CD41-FITC-Antikörpern (grün) und Kollagen Typ 1 mit dem SGH (blau) markiert. Die Kollateralarterie wird durch die weißen, unterbrochenen Linien begrenzt. (D) Liniendiagramm, das die Live-Korrektur entlang der x-, y- und z-Richtungen zeigt. Abkürzungen: PE = phycoerythrin; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; SGH = zweite harmonische Erzeugung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse . (A) Leukozytengeschwindigkeiten, gemessen in Kollateralarterien von scheinoperierten (Sham) und femoralarterienligierten Hintergliedmaßen. (B) Repräsentative Bilder zeigen die verfolgten Zellen (magenta) mit farbkodierten Spuren. Der Farbcodebalken stellt die Zellengeschwindigkeit dar, wobei die langsameren Zellen durch blaue Spuren und die schnelleren Zellen durch rote Spuren dargestellt werden. Die Leukozyten wurden mit injizierten CD45-PE-Antikörpern (rot), die Thrombozyten mit injizierten CD41-FITC-Antikörpern (grün) und das Kollagen Typ 1 mit dem SGH (blau) markiert. Ergebnisse aus drei Einzelexperimenten. Maßstabsleiste = 20 μm. Siehe Video 3 und Video 4. Abkürzungen: Occ= verschlossen/Oberschenkelarterie-ligiert; PE = Phycoerythrin; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; SGH = zweite harmonische Erzeugung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Multiphotonen-intravitale Bildgebung einer Kollateralarterie ohne Driftkorrektur. Es wurden vierdimensionale Bilder mit einer Pixelgröße von 554 x 554 μm, einer Frequenz von 600 Hz, einem Intervall von 1100 ms/Bild, einer Schrittweite von 2 μm und einem Bereich von 40 μm aufgenommen. Das Video zeigt, wie das Bild ohne die Anwendung der VivoFollow-Driftkorrektursoftware driftet. Die Seitenarterie ist im unteren Teil des Videos zu sehen, und die Seitenvene erscheint nach 3 Minuten im oberen Teil des Films. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Multiphotonen-Intravital-Bildgebung einer Kollateralarterie mit applizierter Driftkorrektur. Es wurden vierdimensionale Bilder mit einer Pixelgröße von 554 x 554 μm, einer Frequenz von 600 Hz, einem Intervall von 1100 ms/Bild, einer Schrittweite von 2 μm und einem Bereich von 40 μm aufgenommen. Das Video wurde mit der Live-Driftkorrektursoftware VivoFollow aufgenommen und zeigt die Bildstabilität, die durch die Anwendung der Driftkorrektursoftware gefördert wird. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Zell-Tracking-Bildgebung in einer Kollateralarterie nach Scheinoperation. Leukozyten, die mit injizierten Anti-CD45-PE-Antikörpern markiert waren, wurden in einer ruhenden Kollateralarterie des scheinoperierten Beins abgebildet und mit der Imaris-Software mit dem Plugin für das Tracking von Zellen verfolgt. Verfolgte Zellen wurden ausgewählt und durch die magentafarbenen Punkte dargestellt. Die Spuren wurden entsprechend der Zellengeschwindigkeit farblich gekennzeichnet. Langsamere Zellen werden durch blaue Spuren und schnellere Zellen durch rote Spuren dargestellt. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzung = PE = Phycoerythrin. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 4: Cell-Tracking-Bildgebung in einer Kollateralarterie nach FAL. Leukozyten, die mit Anti-CD45-PE-Antikörpern markiert waren, wurden 24 h nach der Induktion der Arteriogenese durch FAL in einer wachsenden Kollateralarterie abgebildet und mit der Imaris-Software mit dem Plugin für das Tracking von Zellen verfolgt. Verfolgte Zellen wurden ausgewählt und durch die magentafarbenen Punkte dargestellt. Die Spuren wurden entsprechend der Zellengeschwindigkeit farblich gekennzeichnet. Langsamere Zellen werden durch blaue Spuren und schnellere Zellen durch rote Spuren dargestellt. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: FAL = Femoralarterienligatur; PE = Phycoerythrin. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
| Technische Probleme | Lösungsvorschläge | |
| Falls die Schwanzgefäße zum Einführen des Katheters nicht sichtbar sind | • Verwenden Sie eine warme Kompresse, die den Mausschwanz für 3-5 Minuten umgibt, um die lokale Vasodilatation zu fördern. Es wird helfen, die Vene sichtbar zu machen. | |
| Falls der Schwanzkatheter nicht für die Antikörperinjektion fixiert werden kann | • Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 30-g-Nadel, um sie in die Vene einzuführen und die Antikörper und Farbstoffe vor der Bildgebung direkt zu injizieren. | |
| • In einigen Fällen (abhängig von den Antikörpern) kann die Injektion i.p. 1 h vor der Bildgebung verabreicht werden. | ||
| Wenn die Bewegung des Gewebes die Stabilität der Bildgebung beeinträchtigt | • Versuchen Sie, das obere Hinterbein der Maus neu zu positionieren und zu fixieren, um die physiologischen Bauchbewegungen zu vermeiden. | |
| • Prüfen Sie, ob der Mikroskoptisch über genügend Luft verfügt, um Vibrationen zu unterdrücken. | ||
| • Stellen Sie sicher, dass sich die Maus in tiefer Betäubung befindet und nicht aufwacht. | ||
| • Überwachen Sie die Atmung der Maus. Wenn die Maus zu schnell atmet, kann dies Auswirkungen auf die Bildgebungsbewegung haben. | ||
| Wenn die Bildqualität nachlässt | • Stellen Sie sicher, dass das Ultraschallgel nicht austrocknet. | |
| • Füllen Sie das Ultraschallgel nach. | ||
| • Stellen Sie sicher, dass das Objektiv sauber ist (reinigen Sie das getrocknete Ultraschallgel auf dem Objektiv, wenn ein neues Nachfüllen durchgeführt wird). | ||
| Wenn die Arterien während der Vorbereitung auf die Bildgebung geschädigt sind | • In diesem Fall ist es nicht möglich, Bilder zu erfassen. Es ist nicht möglich, das Experiment durchzuführen. | |
Tabelle 1: Fehlerbehebung.
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Discussion
Die beschriebene Methode der Multiphotonen-in-vivo-Analyse der Leukozytenrekrutierung stellt eine Ergänzung zu den üblicherweise verwendeten Werkzeugen für Leukozytenrekrutierungsstudien wie (immun-)histologische oder FACS-Analysen dar. Mit diesem bildgebenden Verfahren ist es möglich, die dynamischen Prozesse der Leukozytenadhärenz und -extravasation während der Arteriogenese detaillierter darzustellen10. Trotz des Mehrwerts dieser Methode enthält das angebotene Protokoll einige kritische Schritte und Einschränkungen. Weitere Tipps zur Fehlerbehebung finden Sie in Tabelle 1 . Bei der Entfernung der oberflächlichen Muskelschicht an den Seitenarterien können diese Arterien geschädigt werden und sind für die intravitale Bildgebung nicht geeignet. Der Katheter muss für die Antikörperinjektion gut fixiert sein. Andernfalls kann ein Verrutschen des Schwanzvenenkatheters zur Extravasation der Antikörper in den perivaskulären Raum des Schwanzes führen, was den Austausch und die zusätzliche Korrektur für die Injektion der Antikörper zu einer herausfordernden Aufgabe macht. Die korrekte Identifizierung der Kollateralarterie und der Kollateralvene während der intravitalen Mikroskopie stellt einen weiteren wichtigen Schritt dieses Protokolls dar.
Da die Maus während der intravitalen Mikroskopie nicht mechanisch beatmet wird, ist die dynamische Bildgebungszeit begrenzt, um körperliche Verletzungen der Maus durch eine zu lange Anästhesie zu vermeiden. Einer der Mängel der intravitalen Mikroskopie ist die physiologische Bewegung der Maus, die durch Atmung, Herzschlag und peristaltische Bewegungen erzeugt wird und die Bildaufnahme und damit die Qualität der Datenanalysen beeinflussen kann. Die Verbesserung der Gewebehalter, der Befestigung und der Fixierung sind Schritte, die die Auswirkungen der Bewegung weiter reduzieren. Zusätzlich zur physiologischen Bewegung kann die Langzeitbildgebung zur Gewebedrift während der Bildgebung beitragen. Wie in diesem Protokoll beschrieben, wurde eine Echtzeit-Software zur Korrektur der Gewebedrift, VivoFollow, eingesetzt, um Bilddaten zu erhalten, die für die anschließende Zellverfolgung und Zellgeschwindigkeitsanalyse geeignet sind. Diese VivoFollow-Software korrigiert die Probenverschiebung in x, y und z direkt während der Bildaufnahme. Sie beruht auf einer unbeweglichen anatomischen Struktur, zum Beispiel wenn Gefäße mit vaskulären Tracern visualisiert werden, die als Referenzorientierungspunkte für den Korrektureingriff dienen.
Obwohl es andere Werkzeuge zur Korrektur der Drift nach der Erfassung gibt, wie z. B. die in Bitplane Imaris oder Plugins für ImageJ, sind sie in ihrer Fähigkeit zur Korrektur sehr begrenzt, da sie keine Wiederherstellung des interessierenden Bereichs ermöglichen. Prinzipiell können sie starke Versätze nicht korrigieren, wenn sich die interessierende Region aus dem Sichtfeld bewegt. Dieses Protokoll kann jedoch auch dann angewendet werden, wenn die Live-Drift-Korrektur nicht verfügbar ist und eine Korrektur nach der Erfassung erforderlich wird. Dies erfordert jedoch eine häufige Schulung des Personals in der Gewebemontage und -fixierung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Multiphotonen-Intravitalmikroskopie eine nützliche dynamische Methode ist, die parallel zu statisch etablierten Methoden wie (immun-)histologischen Analysen angewendet werden kann, um ein detaillierteres Bild der dynamischen Komponenten der Leukozytenrekrutierung zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Die Studie wurde vom SFB 914 der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (HI-A/SM, Projekt Z01). Wir danken Dr. Susanne Stutte für die Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
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