Summary
يشكل تجنيد الكريات البيض والصفائح الدموية مكونا أساسيا ضروريا للنمو الفعال للشرايين الجانبية أثناء تكوين الشرايين. الفحص المجهري متعدد الفوتونات هو أداة فعالة لتتبع ديناميكيات الخلايا ذات الدقة المكانية والزمانية العالية في الجسم الحي وأقل سمية ضوئية لدراسة تجنيد كريات الدم البيضاء وتسربها أثناء تكوين الشرايين.
Abstract
يعتمد تكوين الشرايين بشدة على تجنيد الكريات البيض والصفائح الدموية إلى الفضاء حول الأوعية الدموية للأوعية الجانبية المتنامية. النهج القياسي لتحليل الشرايين الجانبية والكريات البيض في تكوين الشرايين هو المنهجية النسيجية خارج الجسم الحي (المناعي). ومع ذلك ، لا تسمح هذه التقنية بقياس العمليات الديناميكية مثل تدفق الدم ، وإجهاد القص ، والتفاعلات بين الخلايا والخلايا ، وسرعة الجسيمات. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لمراقبة العمليات في الجسم الحي في الشرايين الجانبية المتنامية أثناء تكوين الشرايين باستخدام التصوير داخل الجسم. الطريقة الموصوفة هنا هي أداة موثوقة لقياس الديناميات وتقدم تحليلا عالي التباين مع الحد الأدنى من السمية الخلوية الضوئية ، التي يوفرها الفحص المجهري للإثارة متعدد الفوتونات. قبل تحليل الشرايين الجانبية المتنامية ، تم تحفيز تكوين الشرايين في العضلة المقربة للفئران عن طريق ربط الشريان الفخذي من جانب واحد.
بعد الربط ، بدأت الشرايين الجانبية الموجودة مسبقا في النمو بسبب زيادة إجهاد القص. بعد أربع وعشرين ساعة من الجراحة ، تمت إزالة الجلد والدهون تحت الجلد فوق الشرايين الجانبية ، وبناء جيب لمزيد من التحليلات. لتصور تدفق الدم والخلايا المناعية أثناء التصوير في الجسم الحي ، تم حقن الأجسام المضادة CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (الصفائح الدموية) و CD45-phycoerythrin (PE) (الكريات البيض) عن طريق الوريد (IV) عن طريق قسطرة موضوعة في الوريد الخلفي للفأر. تقدم هذه المقالة التصوير متعدد الفوتونات داخل الجسم كبديل أو مكمل في الجسم الحي للتحليلات النسيجية الثابتة خارج الجسم الحي (المناعية) شائعة الاستخدام لدراسة العمليات ذات الصلة بتكوين الشرايين. باختصار ، تصف هذه الورقة طريقة جديدة وديناميكية في الجسم الحي للتحقيق في الاتجار بالخلايا المناعية ، وتدفق الدم ، وإجهاد القص في نموذج الأطراف الخلفية لتكوين الشرايين ، مما يعزز إمكانيات التقييم بشكل ملحوظ.
Introduction
على الرغم من الاهتمام البحثي المكثف خلال السنوات الأخيرة ، لا تزال أمراض القلب والأوعية الدموية ، مثل أمراض القلب الإقفارية والسكتة الدماغية ، السبب العالمي الرئيسي للوفاة1. العلاجات الحالية لهذه الأمراض هي علاجات شديدة التوغل مثل رأب الأوعية عبر الجلد ، رأب الأوعية التاجية عبر الجلد ، أو جراحةالمجازة 2. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير خيارات علاجية بديلة غير جراحية. يمكن للجسم إنشاء مجازات طبيعية حول وعاء ضيق أو مسدود لإعادة توجيه تدفق الدم المتقطع إلى الجزء البعيد من التضيق. وتسمى هذه العملية تكوين الشرايين2. أظهرت العديد من الدراسات الحديثة أن زيادة قص السوائل تؤثر على تجنيد كريات الدم البيضاء ، والتي تلعب دورا مهما أثناء تكوين الشرايين3. الخيارات الرئيسية الحالية لتحليل تجنيد الكريات البيض أثناء تكوين الشرايين هي التحليلات النسيجية خارج الجسم الحي (المناعي) أو منهجية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS)4. لتمكين تقييم ديناميكيات الكريات البيض أثناء تكوين الشرايين ، تقدم هذه الورقة بروتوكول تصوير داخل الجسم مع الفحص المجهري متعدد الفوتونات.
الكريات البيض هي خلايا الدم الرئيسية التي يتم تجنيدها أثناء عملية تكوين الشرايين3. يستخدم هذا البروتوكول التصوير متعدد الفوتونات لإظهار زحف كريات الدم البيضاء الملتصقة الموسومة بأجسام مضادة لحقن CD45-PE في الشرايين الجانبية ، بعد 24 ساعة من تحريض تكوين الشرايين عن طريق ربط الشريان الفخذي (FAL) باستخدام نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية للفأر 5,6. بدلا من ذلك ، يمكن تسمية الخلايا المناعية خارج الجسم الحي وحقنها بعناية في الفئران ، كما هو موضح في الدراسات حول تكوين الأوعية باستخدام الفحص المجهري داخل الجسم7. يمكن تصور تدفق الدم داخل الأوعية والشرايين بواسطة CD41-FITC (لتسمية الصفائح الدموية) ، أو ديكستران-FITC (البلازما) ، أو عن طريق الجيل التوافقي الثاني (SHG) ، الذي يصور الكولاجين من النوع 1 الموجود في الغشاء القاعدي لجزء من شجرة الأوعية الدموية. SHG هو تأثير فريد لوضع العلامات المجانية لإثارة الفوتونات المتعددة. يسمح التصوير متعدد الفوتونات بتتبع الخلايا على المدى الطويل دون الإضرار بالأنسجة وتنشيط الخلايا عن طريق إثارة طاقة الليزر. الفحص المجهري متعدد الفوتونات هو طريقة التصوير المفضلة لتصور الخلايا والهياكل ذات العلامات الفلورية في الحيوانات الحية نظرا لقدرتها على إثارة الفلوروفورات بشكل أعمق في الأنسجة / الأعضاء بأقل قدر من السمية الضوئية8.
إن استخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء المضبوط مع نبضات يتم توصيلها خلال فترات الفيمتو ثانية يثير الفلوروكروم فقط في المستوى البؤري ، دون أي إثارة أعلى وأسفل المستوىالبؤري 8. وبالتالي ، يسمح الفحص المجهري متعدد الفوتونات بدقة مكانية وزمانية عالية ، وتلف أقل للصور ، وزيادة تصوير اختراق الأنسجة لدراسة الأحداث البيولوجية الديناميكية داخل الأعضاء. إنها أداة مجهرية مثالية لتصوير الحيوانات الحية. ومع ذلك ، فإن الفوتون المتعدد وأي فن آخر للفحص المجهري داخل الجسم محدود بحركة الأنسجة بسبب ضربات القلب والتنفس والحركات التمعجية ونغمة العضلات والوظائف الفسيولوجية الأخرى ، مما يزعج اكتساب التصوير وتحليله. وبما أن هذه الحركات تضعف الاستبانة الزمانية والمكانية بل وتحظر أحيانا التحليل اللاحق، يجب معالجتها بشكل مناسب لتمكين تحليل البيانات وتفسيرها بدقة. تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لخفض أو منع القطع الأثرية من حركة الأنسجة. يطبق هذا البروتوكول برنامج تصحيح الانجراف في الموقع يسمى VivoFollow9 لتصحيح انحراف الأنسجة أثناء التقاط الصورة. يوفر هذا النهج تثبيت الصورة المطلوب ، مما يتيح التصوير طويل المدى وتحليل تتبع الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة البافارية لرعاية واستخدام الحيوان (تمت الموافقة عليها بموجب القانون الأخلاقي: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99) ؛ أجريت هذه التجارب بما يتفق بدقة مع إرشادات التشريعات الحيوانية الألمانية.
1. الحيوانات وربط الشريان الفخذي (FAL)
ملاحظة: للحث على الالتهاب المعقم وتكوين الشرايين ، تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 8-10 أسابيع. لم يمت أي من الفئران أو عانى من عدوى الجرح أو اضطراب التئام الجروح أثناء أو بعد جراحة FAL أو الجراحة الوهمية ، على التوالي.
- تخدير
ملاحظة: قبل حقن التخدير MMF-mix ، يوصى بالتخدير أولا باستخدام 5٪ إيزوفلوران حتى ينام الفأر.- وزن الفأر وإعداد مزيج MMF بجرعة من ميدازولام 5.0 ملغم / كغم ، ميديتوميدين 0.5 ملغم / كغم ، وفنتانيل 0.05 ملغم / كغم.
- املأ حقنة سعة 1 مل بمزيج MMF وحقن حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر s.c. باستخدام إبرة 30 جم (بعد التخدير ب 5٪ إيزوفلوران).
- ضع الماوس على وسادة دافئة وانتظر حتى يتم تخدير الماوس تماما. اضبط المؤقت على 35 دقيقة. بعد هذا الوقت ، حقن s.c. نصف الجرعة (50 ميكرولتر) من مزيج MMF.
- تحقق من عمق التخدير عن طريق اختبار الدواسة وردود الفعل بين الأصابع (عن طريق قرصة إصبع القدم الثابتة) للماوس.
ملاحظة: يشير غياب الاستجابة إلى عمق كاف من التسكين.
- ربط الشريان الفخذي (FAL)
ملاحظة: استخدم الأدوات الجراحية والخيوط الجراحية المعقمة. تطهير الجلد بمطهر قبل الفتح وبعد الإغلاق.- ضع الفأر المخدر على صفيحة تسخين (35-37 درجة مئوية) للحفاظ على درجة حرارة الجسم الفسيولوجية. ضع كريم العين (ديكسبانثينول) على كل عين لمنع جفاف العينين تحت التخدير.
- انقل الفأر المخدر إلى غرفة التصوير بالليزر دوبلر (LDI) قبل وبعد FAL للتحقق من تدفق الدم والتروية (الشكل 1A-C).
- إزالة الشعر وتطهير الجلد وإجراء قطع للوصول إلى الشريان الفخذي. تحت المجهر الجراحي ، قم بربط الشريان الفخذي الأيمن للطرف الخلفي للفأر باستخدام خياطة حريرية مضفرة (7-0) وإجراء عملية وهمية على الشريان الفخذي الأيسر لتكون بمثابة تحكم داخلي كما هو موضح سابقا6 (الشكل 1D-K).
ملاحظة: تم إجراء شق في الجلد بمقص صغير لتجنب الإصابة المباشرة للأوعية الدموية القريبة من الجلد. - أغلق الجلد باستخدام خياطة حريرية مضفرة (6-0). يجب تطبيق البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) كل 12 ساعة، بدءا من 10 دقائق قبل استعداء التخدير لتخفيف الألم. راقب الحيوان بحثا عن إشارات الألم ، أي انخفاض نشاط الاستمالة ، أو الإحجام عن الحركة ، أو وضعية الانحناء لمدة 24 ساعة بعد الجراحة.
- حقن (s.c.) مزيج من النالوكسون (1.2 ملغ / كغ) ، فلومازينيل (0.5 ملغ / كغ) ، وأتيباميزول (2.5 ملغ / كغ) لاستعداء التخدير بعد الانتهاء من FAL وإغلاق الجلد.
- بعد الجراحة ، احتفظ بالماوس على الوسادة الدافئة وراقب الحيوان باستمرار حتى يتمكن من الحفاظ على وضع مستقيم والبدء في المشي بشكل طبيعي حول القفص.
- عندما يكون الماوس مستيقظا تماما ، ضعه مرة أخرى في القفص مع الفئران الأخرى وأعد القفص إلى غرفة سكن الحيوانات.
2. تحضير الأنسجة للتصوير داخل الجسم متعدد الفوتونات
- حقن الوريد الذيل
ملاحظة: يجب أن يكون الحيوان تحت التخدير قبل البدء في التحضير للتصوير داخل الجسم. قبل إدخال إبرة قسطرة الوريد ، يوصى بتطبيق مطهر للجلد على الذيل. هذا سوف يساعد أيضا على تصور الأوعية.- قم بإعداد قسطرة حقن الوريد الخلفي باستخدام إبرة 2 × 30 جم ، و 10 سم من أنابيب البوليثين ذات التجويف الدقيق (القطر الداخلي 0.28 مم والقطر الخارجي 0.61 مم) ، ومحقنة 1 مل ، وغراء هيستواكريل لتثبيت القسطرة على ذيل الفأر لمزيد من الحقن الوريدي أثناء التصوير (الشكل 2 أ ، ب والشكل 2 و).
- تحضير محلول الأجسام المضادة للحقن الوريدي: CD45-PE و CD41-FITC (20 ميكروغرام / فأر) بحجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
- افحص الذيل بحثا عن أوردة الذيل الموجودة جانبيا وقم بسد الوريد لتحديد وريد الذيل. تطهير الذيل ، وإدخال قسطرة الوريد ، وإصلاحه باستخدام غراء الأنسجة histoacryl (الشكل 2B).
- حقن الأجسام المضادة قبل التصوير (قبل 15 دقيقة على الأقل) وبعد الانتهاء من تحضير الأنسجة.
- تحضير الأنسجة
ملاحظة: استخدم دائما ضمادة دافئة وضع قطرة من كريم العين (ديكسبانثينول) في كل عين قبل تحضير الأنسجة. استخدم الأدوات الجراحية والغرزات المعقمة. تطهير الجلد بمطهر قبل الفتح وبعد الإغلاق.- ضع الماوس المخدر على وسادة ثابتة ومحمولة. ثبت الماوس في وضع ضعيف مع تثبيت 4 نقاط على الوسادة باستخدام شريط لاصق (الشكل 2 ب).
- قم بتشكيل قطعتين من طين النمذجة ووضع القطع تحت الطرف الخلفي العلوي للفأر لضمان وضع مستوى العضلة المقربة (الشكل 2 ب ، المشار إليه بالأسهم الحمراء).
- لضمان درجة حرارة جسم ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية من الماوس ، ضع الوسادة بالماوس على صفيحة تسخين تحت مجهر جراحي مع تكبير 0.64-4.0 أضعاف (الشكل 1L).
- قم بإزالة الشعر من كلا الساقين ، وقم بتطهير الجلد ، وقص الجلد في دائرة حول ندبة ربط الشريان الفخذي السابق للطرف الخلفي الأيمن (الشكل 1M).
- قم بإزالة الجلد وطبقة الدهون من أعلى الساق (الشكل 1N ، O) ، واسحب الجلد المتبقي جانبا باستخدام الغرز لإنشاء جيب حول العضلة المقربة (الشكل 1P ، Q).
- قم بإزالة الدهون تحت الجلد للحصول على رؤية واضحة للعضلة المقربة والشريان / الوريد العميق وكذلك الأوعية الجانبية (الشكل 1Q ، R).
- ابدأ بعناية في إزالة طبقة العضلات السطحية الموجودة أعلى الأوعية الجانبية عن طريق تشريحها بعناية باستخدام ملقط دقيق (الشكل 1R).
ملاحظة: الشريان الجانبي والوريد الجانبي مرئيان بوضوح وجاهزان للتصوير (الشكل 1S). - املأ الجيب المحضر بمحلول ملحي لتجنب جفاف الأنسجة واستمر في نفس الإجراء للطرف الخلفي الأيسر الذي يعمل بشكل وهمي. قبل التصوير ، أضف الجل بالموجات فوق الصوتية في كلا الجيبين ، مما يمنع التجفيف ويعمل كوسيط غمر للاقتران البصري بالهدف (الشكل 2C والشكل 2F).
3. المجهر متعدد الفوتونات داخل الجسم
- اعداد
ملاحظة: احتفظ بحقنة مع هلام بالموجات فوق الصوتية داخل غرفة الحاضنة في المجهر للحفاظ على درجة حرارة دافئة لإعادة ملء الجيوب أثناء التصوير على المدى الطويل.- قم بإزالة المحلول الملحي من الجيبين المحضرين واستبدله بهلام بالموجات فوق الصوتية لتغطية الأوعية الجانبية (الشكل 2C).
- حقن محلول الأجسام المضادة من خلال قسطرة الوريد الذيل. بعد 15 دقيقة من حقن الأجسام المضادة ، انقل الوسادة بالماوس الثابت إلى غرفة التصوير متعددة الفوتونات الدافئة (الشكل 2F).
- بعد الانتهاء من الحصول على الصورة ، القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم تحت التخدير العميق.
- الحصول على صورة مجهرية متعددة الفوتونات
ملاحظة: قم بتشغيل المجهر قبل 30 دقيقة من التصوير للسماح بتثبيت الليزر. للحصول على أفضل استقرار بصري للمجهر ، يوصى بالحفاظ على تسخين غرفة المجهر بشكل دائم.- قم بتشغيل مفتاح صندوق الليزر Ti: Sapphire ، وصناديق الواجهات الإلكترونية ، ووحدة التسخين في غرفة الحضانة ، ومصباح الفلورسنت ، والكمبيوتر (الشكل 2D ، E).
- قم بتشغيل برنامج الاستحواذ (برنامج المفتش). اضبط الطول الموجي على 800 نانومتر وافتح مصراع المجهر (الشكل 3A ii).
- في مربع حوار معالج القياس ، اختر وضع الأداة (شعاع واحد) وفي وضع القياس (فاصل زمني ثلاثي الأبعاد) (الشكل 3A i).
- نقل الماوس المخدر إلى غرفة الحضانة قبل التسخين في المجهر. ضع المنطقة باستخدام الجل بالموجات فوق الصوتية (الخطوة 2.2.8) مباشرة على اتصال بالعدسة الأمامية الموضوعية (الشكل 2F).
- افتح مصراع مجهر التألق ، واختر إعدادا مناسبا للمرشح / ثنائي اللون لتصور FITC (4) للعثور على منطقة الاهتمام باتباع تدفق الدم تحت إضاءة التألق. بعد جلب منطقة الاهتمام إلى مجال الرؤية المركزي ، أغلق مصراع المجهر الفلوري.
- في مربع حوار xy-Scanner ، قم بتعيين المعلمات التالية: حجم الصورة (554 × 554) ، بكسل (512 × 512) ، التردد (400) ، متوسط الخط (1) (الشكل 3A iii). اضبط طاقة الليزر (5٪) (الشكل 3A iv) ، واضبط كسب المضاعف الضوئي (PMT) للقنوات باللون الأخضر (66) والأحمر (66) والأزرق (63) (الشكل 3A v).
- حدد هدفا مناسبا للتصوير داخل الجسم وإعدادات تصحيح الانجراف (انظر التفاصيل في 3.2.11).
ملاحظة: هنا ، كان الهدف المحدد هو نيكون LWD 16x (الشكل 3A السادس). - حدد نطاق مكدس الصور عن طريق بدء وضع اكتساب المعاينة بالضغط على الزر الأحمر في الزاوية اليمنى العليا من نافذة حوار معالج القياس (الشكل 3A i).
- حدد منطقة وهيكل الاهتمام من خلال التركيز للحصول على صورة جيدة. ثم ، أثناء مراقبة الشاشة ، قم بتغيير التركيز عن طريق تحريك الهدف لأعلى حتى تختفي الصورة ، وقم بتعيينه على أنه صفر (الأول = 0). قم بتغيير التركيز في الاتجاه المعاكس عن طريق تحريك الهدف لأسفل حتى تختفي الصورة من الشاشة مرة أخرى ، وقم بتعيينه كآخر موضع (النهاية = 40 ميكرومتر) في الاتجاه المحوري (الشكل 3A vii).
- اضبط حجم الخطوة على 2 ميكرومتر. انقر فوق الزر الأحمر في الزاوية العلوية اليسرى من مربع حوار معالج القياس لإيقاف مسح المعاينة.
ملاحظة: سيتم حساب عدد الصور وضبطها تلقائيا (21 صورة) ، كما هو موضح في الشكل 3A vii. - إذا كان المجهر مزودا بتصحيح الانجرافالمباشر 9، فابدأ تشغيل برنامج تصحيح الانجراف (على سبيل المثال، VivoFollow) واتبع الخطوات الموضحة أدناه.
- في مربع حوار معالج القياس ، اختر محور Python (Python Ax) (الشكل 3A الثامن) كجهاز المحور الأول ؛ لا تقم بتنشيط وضع الحفظ التلقائي. حدد مربع الحفظ التلقائي (AS) فقط على محور الوقت (الوقت الزمني). اضغط على أيقونة Python في نافذة الأجهزة المتاحة (الشكل 3A التاسع) لفتح نافذة حوار Python.
- في إعدادات محور حوار Python ، أدخل من (0 صفر) وإلى (-40). أدخل عدد الخطوات (21) كما هو موضح في الشكل 3A x.
- انتقل إلى نافذة حوار xyz Stage Z وقم بتكبير نطاق المسح بمقدار 200 ميكرومتر على كلا الطرفين: في Start ، أدخل (200 μm) وفي End ، أدخل (-240 μm) ، سيتم تعيين النطاق تلقائيا (-440 μm). احتفظ بحجم الخطوة (2 ميكرومتر) كما هو موضح في الشكل 3A xi.
- افتح مربع حوار الواجهة الأمامية VivoFollow وانقر فوق ملف تعريف الحركة مربع (الشكل 3A xii).
- ابدأ الحصول على الصور بالضغط على رأس السهم الأخضر في الزاوية العلوية اليسرى من مربع حوار معالج القياس لبرنامج المفتش (الشكل 3A i).
- إذا تم استخدام تصحيح الانجراف المباشر ، فابحث عن مربع حوار لتكوين تصحيح الانجراف ليظهر كما هو موضح في الشكل 3A xiii. قم بتعيين قناة الاستحواذ التي سيتم استخدامها كمرجع معلم غير متحرك (لهذا البروتوكول ، اختر القناة 2 ، حيث سيتم تسجيل إشارة تتبع الأوعية الدموية). أدخل إزاحة التصحيح القصوى في μm التي تمت إضافتها إلى مواضع z الأولى والأخيرة (هنا ، 200 ميكرومتر) وانقر فوق موافق.
- راقب إزاحة الانجراف الحالية في x و y و z في الوقت الفعلي أثناء الحصول على الصورة في نافذة الحوار الأمامية VivoFollow الشكل 3A xiv.
- توقف عن الحصول على التصوير بعد ~ 35 دقيقة عند الحاجة إلى دورة أخرى من إعادة حقن التخدير. احقن نصف جرعة من مزيج MMF (50 ميكرولتر s.c) وأعد بدء الحصول على التصوير بالضغط على رأس السهم الأخضر مرة أخرى (الخطوة 3.2.11.5).
- كرر هذا الإجراء حتى تنتهي التجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر الفحص المجهري متعدد الفوتونات دقة مكانية وزمانية عالية لتتبع كريات الدم البيضاء ، حيث يمكن تتبع خطوات هجرة الخلايا وسرعتها ومراقبتها (الشكل 4 أ ، ب). ومع ذلك ، فإن الحركة الفسيولوجية للعينة تشكل تحديا ، خاصة بالنسبة لعمليات الحصول على صور الفحص المجهري داخل الجسم على المدى الطويل. لذلك ، يلزم إعداد الأنسجة الجيد وحوامل لإصلاح الأنسجة والأدوات ، مثل تصحيح التصوير في الوقت الفعلي لانجراف الأنسجة ، للحصول على تصوير ناجح ومستقر. هنا ، تم استخدام أداة الانجراف المباشر ، VivoFollow ، لتصحيح انجراف الأنسجة الناتج أثناء الحصول على التصوير على المدى الطويل.
يسمح تطبيق هذه الأداة بالحصول على الصور على المدى الطويل ويتيح جمع بيانات عالية الجودة ، ومناسبة لتتبع الخلايا لقياسات السرعة. كما هو موضح في الشكل 3B ، بدون تصحيح الانجراف ، تنجرف منطقة الاهتمام تدريجيا بعيدا عن عرض التسجيل ، مما يؤثر على القدرة على تتبع الخلايا لتحليل السرعة. ومع ذلك ، كما هو موضح في الشكل 3C ، باستخدام برنامج تصحيح الانجراف ، يمكن تسجيل الأفلام المستقرة ، ويمكن تتبع المزيد من الخلايا على مدى فترة طويلة. يمكن أن يوفر برنامج تصحيح الانجراف أيضا تصورا لإزاحات x و y و z بمرور الوقت التي قام النظام بتصحيحها ، كما هو موضح في الشكل 3D.
الشكل 1: إعداد تصوير دوبلر بالليزر والتحضير لربط الشريان الفخذي وإعداد الأنسجة للتصوير داخل الجسم. (أ) إعداد التصوير LDI. (B) يوضع الماوس داخل حجرة التسخين LDI لالتقاط الصور. (C) صور LDI للساقين اليمنى واليسرى قبل (اللوحة العلوية) وبعد FAL (اللوحة السفلية) للتحقق من نضح الأطراف الخلفية بعد الربط. تم ربط / انسداد الشريان الفخذي الأيمن ، بينما كان الشريان الفخذي الأيسر يعمل بشكل وهمي (الشام) وكان بمثابة تحكم داخلي. في شريط الألوان ، يشير اللون الأزرق إلى انخفاض نضح الدم ، ويشير اللون الأحمر إلى زيادة التروية. (د-ك) تمثل الصور خطوات جراحة ربط الشرايين الفخذية. شريط المقياس = 10 مم. (L-S) تحضير الأنسجة للتصوير داخل الجسم بعد FAL. يشار إلى المنطقة المراد تصويرها بالدائرة السوداء ، حيث توجد الأوعية الجانبية. شريط المقياس = 5 مم. الاختصارات: LDI = تصوير دوبلر بالليزر. FAL = ربط الشريان الفخذي. Occ = انسداد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإعداد للتصوير داخل الجسم متعدد الفوتونات. (أ) تحضير قسطرة الوريد؛ 1-أنابيب البوليثين الدقيقة من 10 سم ، 2: 2x 30 غرام إبرة ؛ 3: قسطرة مثبتة متصلة بحقنة 1 مل ؛ 4: غراء النسيج النسيجي. 5: حامل إبرة. (ب) وضع الفأر في وضع الاستلقاء مع وضع كلا الطرفين الخلفيين على قطع من طين النمذجة الأسود (الأسهم الحمراء) المعدة للتصوير. (ج) الطرف الخلفي الأيمن المسدود (Occ) والطرف الخلفي الأيسر الوهمي الجاهز للتصوير. (د) إعداد مجهر متعدد الفوتونات يظهر صناديق الليزر ، وصندوق مصباح التألق ، وأنابيب لتسخين غرفة الحاضنة. ه: حجرة حاضنة المجهر متعدد الفوتونات. (F) الماوس وضعت داخل غرفة المجهر مع الهدف 16x لمس الأنسجة المغطاة هلام بالموجات فوق الصوتية. تفاصيل توضح قسطرة الوريد المثبتة على الوريد الخلفي لحقن الأجسام المضادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إعداد برنامج تصحيح الانجراف VivoFollow. (أ) (i-xiv) خطوات إعداد البرنامج كما هو موضح في خطوات البروتوكول 3.2.2-3.2.11.9. ( ب) صور متسلسلة زمنية تمثيلية توضح انحراف التصوير دون تشغيل برنامج تصحيح الانجراف. يتم تحديد الشريان الجانبي بالخطوط البيضاء المتوقفة (الفيديو 1 والفيديو 2). (ج) صور السلاسل الزمنية التمثيلية التي توضح السلاسل الزمنية الثابتة عند تطبيق تصحيح الانجراف المباشر أثناء الحصول على التصوير. تم تصنيف الكريات البيض بأجسام مضادة CD45-PE (حمراء) ، وتم تصنيف الصفائح الدموية بواسطة الأجسام المضادة CD41-FITC (الأخضر) والكولاجين من النوع 1 مع SGH (الأزرق). يتم تحديد الشريان الجانبي بواسطة الخطوط البيضاء المتوقفة. (د) مخطط خطي يوضح التصحيح المباشر في اتجاهات x و y و z. الاختصارات: PE = phycoerythrin. FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ SGH = الجيل التوافقي الثاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية. أ: سرعات الكريات البيض المقاسة في الشرايين الجانبية للأطراف الخلفية المختومة (الشام) والشرايين الفخذية. (B) تظهر الصور التمثيلية الخلايا المتعقبة (أرجواني) مع المسارات المرمزة بالألوان. يمثل شريط رمز اللون سرعة الخلية مع الخلايا الأبطأ الموضحة بالمسارات الزرقاء والخلايا الأسرع ذات المسارات الحمراء. تم تصنيف الكريات البيض بأجسام مضادة CD45-PE محقونة (حمراء) ، وتم تصنيف الصفائح الدموية بواسطة الأجسام المضادة CD41-FITC المحقونة (أخضر) ، والكولاجين من النوع 1 مع SGH (أزرق). نتائج من ثلاث تجارب فردية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. انظر الفيديو 3 والفيديو 4. الاختصارات: Occ = انسداد / ربط الشريان الفخذي. PE = فيكوريثرين. FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ SGH = الجيل التوافقي الثاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: تصوير متعدد الفوتونات داخل الجسم للشريان الجانبي دون تصحيح الانجراف. تم تسجيل الصور رباعية الأبعاد بحجم بكسل 554 × 554 ميكرومتر ، وتردد 600 هرتز ، وفاصل زمني 1100 مللي ثانية / إطار ، وحجم خطوة 2 ميكرومتر ، ونطاق 40 ميكرومتر. يظهر الفيديو انجراف الصورة دون تطبيق برنامج تصحيح الانجراف VivoFollow. يظهر الشريان الجانبي في الجزء السفلي من الفيديو ، ويظهر الوريد الجانبي بعد 3 دقائق في الجزء العلوي من الفيلم. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: تصوير متعدد الفوتونات داخل الجسم للشريان الجانبي مع تصحيح الانجراف التطبيقي. تم التقاط صور رباعية الأبعاد بحجم بكسل 554 × 554 ميكرومتر ، وتردد 600 هرتز ، وفاصل زمني قدره 1100 مللي ثانية / إطار ، وحجم خطوة 2 ميكرومتر ، ومدى 40 ميكرومتر. تم تسجيل الفيديو باستخدام برنامج تصحيح الانجراف المباشر ، VivoFollow ، ويظهر استقرار التصوير الذي تم تعزيزه من خلال تطبيق برنامج تصحيح الانجراف. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 3: تصوير تتبع الخلايا في الشريان الجانبي بعد العملية الوهمية. تم تصوير كريات الدم البيضاء الموسومة بأجسام مضادة ل CD45-PE محقونة في شريان جانبي أثناء الراحة في الساق التي يتم تشغيلها بشكل وهمي وتتبعها باستخدام برنامج Imaris مع المكون الإضافي لتتبع الخلايا. تم اختيار الخلايا المتعقبة وتمثيلها بالنقاط الأرجواني. تم ترميز المسارات بالألوان وفقا لسرعة الخلية. يتم تمثيل الخلايا الأبطأ بمسارات زرقاء وخلايا أسرع بمسارات حمراء. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار = PE = phycoerythrin. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 4: تصوير تتبع الخلايا في الشريان الجانبي بعد FAL. تم تصوير كريات الدم البيضاء الموسومة بأجسام مضادة ل CD45-PE في شريان جانبي متزايد بعد 24 ساعة من تحريض تكوين الشرايين بواسطة FAL وتم تتبعها باستخدام برنامج Imaris مع المكون الإضافي لتتبع الخلايا. تم اختيار الخلايا المتعقبة وتمثيلها بالنقاط الأرجواني. تم ترميز المسارات بالألوان وفقا لسرعة الخلية. يتم تمثيل الخلايا الأبطأ بمسارات زرقاء وخلايا أسرع بمسارات حمراء. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: FAL = ربط الشريان الفخذي. PE = فيكوريثرين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
| مشاكل تقنية | الحلول المقترحة | |
| في حالة عدم ظهور الأوعية الخلفية لإدخال القسطرة | • استخدم ضغطا دافئا يحيط بذيل الفأر لمدة 3-5 دقائق لتعزيز توسع الأوعية الموضعي. وسوف يساعد على جعل الوريد مرئيا. | |
| في حالة تعذر تثبيت قسطرة الذيل لحقن الأجسام المضادة | • استخدم حقنة سعة 1 مل مع إبرة 30 جم لإدخالها في الوريد وحقن الأجسام المضادة والأصباغ مباشرة قبل التصوير. | |
| • في بعض الحالات (اعتمادا على الأجسام المضادة) يمكن تطبيق الحقن i.p. 1 ساعة قبل التصوير. | ||
| عندما تعيق حركة الأنسجة استقرار التصوير | • حاول إعادة وضع وإعادة تثبيت ساق تلميح الماوس العلوي لتجنب حركات البطن الفسيولوجية. | |
| • تحقق مما إذا كانت طاولة المجهر تحتوي على هواء كاف لإلغاء الاهتزاز. | ||
| • تأكد من أن الفأر في حالة تخدير عميق ولا يستيقظ. | ||
| • مراقبة تنفس الماوس. عندما يتنفس الماوس بسرعة كبيرة ، يمكن أن يكون له تأثير على حركة التصوير. | ||
| عندما تبدأ جودة الصورة في الانخفاض | • تأكد من أن الجل بالموجات فوق الصوتية لا يجف. | |
| • إعادة ملء هلام بالموجات فوق الصوتية. | ||
| • تأكد من أن الهدف نظيف (قم بتنظيف الجل المجفف بالموجات فوق الصوتية على الهدف كلما تمت إعادة تعبئة جديدة). | ||
| عندما تتلف الشرايين أثناء التحضير للتصوير | • في هذه الحالة ، لن يكون من الممكن الحصول على الصور. لا يمكن تشغيل التجربة. | |
الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمثل الطريقة الموصوفة للتحليل متعدد الفوتونات في الجسم الحي لتجنيد الكريات البيض إضافة إلى الأدوات شائعة الاستخدام لدراسات تجنيد كريات الدم البيضاء مثل التحليلات النسيجية (المناعية) أو تحليلات FACS. باستخدام طريقة التصوير هذه ، من الممكن تصور العمليات الديناميكية بمزيد من التفصيل في الالتزام بالكريات البيض والإسراف أثناء تكوين الشرايين10. على الرغم من القيمة المضافة لهذه الطريقة ، يتضمن البروتوكول المقدم بعض الخطوات والقيود الحاسمة. راجع الجدول 1 لمزيد من تلميحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. أثناء إزالة طبقة العضلات السطحية على الشرايين الجانبية ، يمكن أن تتلف هذه الشرايين ولن تكون مفيدة للتصوير داخل الجسم. يجب أن تكون القسطرة ثابتة بشكل جيد لحقن الأجسام المضادة. خلاف ذلك ، يمكن أن يتسبب انزلاق قسطرة الوريد الذيل في تسرب الأجسام المضادة إلى الفضاء حول الأوعية الدموية للذيل ، مما يجعل الاستبدال والتصحيح الإضافي لحقن الأجسام المضادة مهمة صعبة. يمثل التحديد الصحيح للشريان الجانبي والوريد الجانبي أثناء الفحص المجهري داخل الجسم خطوة حاسمة أخرى في هذا البروتوكول.
بالنظر إلى أن الفأر لا يتم تهويته ميكانيكيا أثناء الفحص المجهري داخل الجسم ، فإن وقت التصوير الديناميكي محدود لتجنب الإصابة الجسدية للفأر نتيجة التخدير الطويل للغاية. أحد أوجه القصور في الفحص المجهري داخل الجسم هو الحركة الفسيولوجية للفأر ، الناتجة عن التنفس ، وضربات القلب ، والحركات التمعجية ، والتي يمكن أن تؤثر على الحصول على الصور وبالتالي جودة تحليلات البيانات. يعد تحسين حاملات الأنسجة والتركيب والتثبيت من الخطوات التي تقلل من آثار الحركة. بالإضافة إلى الحركة الفسيولوجية ، قد يساهم التصوير طويل المدى في انجراف الأنسجة أثناء التصوير. كما هو موضح في هذا البروتوكول ، تم استخدام برنامج تصحيح انحراف الأنسجة في الوقت الفعلي ، VivoFollow ، للحصول على بيانات التصوير المناسبة لتتبع الخلايا اللاحقة وتحليل سرعة الخلية. يقوم برنامج VivoFollow هذا بتصحيح إزاحة العينة في x و y و z مباشرة أثناء التقاط الصورة. يعتمد على البنية التشريحية غير المتحركة ، على سبيل المثال ، عندما يتم تصور الأوعية مع مقتفيات الأوعية الدموية التي تعمل كمعالم مرجعية لإجراء التصحيح.
على الرغم من وجود أدوات أخرى لتصحيح الانجراف بعد الاستحواذ ، مثل تلك الموجودة داخل Bitplane Imaris أو المكونات الإضافية ل ImageJ ، إلا أنها محدودة للغاية في قدرتها على التصحيح لأنها لا تسمح باستعادة المنطقة محل الاهتمام. من حيث المبدأ ، لا يمكنهم تصحيح الإزاحات الشديدة عندما تتحرك منطقة الاهتمام خارج مجال الرؤية. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول حتى عندما يكون تصحيح الانجراف الحي غير متاح ، ويصبح التصحيح بعد الاستحواذ ضروريا. ومع ذلك ، فإن هذا يتطلب تدريبا متكررا للموظفين في تركيب الأنسجة وتثبيتها. في الختام ، يعد الفحص المجهري متعدد الفوتونات داخل الجسم طريقة ديناميكية مفيدة يمكن تطبيقها بالتوازي مع الطرق الثابتة مثل التحليلات النسيجية (المناعية) للحصول على صورة أكثر تفصيلا للمكونات الديناميكية لتجنيد الكريات البيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل الدراسة من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A / SM ، مشروع Z01). نشكر الدكتورة سوزان ستوت على قراءة المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
