Her presenterer vi en modifisert metode for isolasjon og kultur av menneskelige gingival epitelceller ved å legge rockhemmeren, Y-27632, til den tradisjonelle metoden. Denne metoden er enklere, mindre tidkrevende, forbedrer stamcelleegenskapene, og produserer et større antall høypotensiale epitelceller både for laboratoriet og for kliniske anvendelser.
Gingivalvevet er den første strukturen som beskytter periodontalt vev og spiller meningsfulle roller i mange orale funksjoner. Gingival epitel er en viktig struktur av gingivalvev, spesielt i reparasjon og regenerering av periodontalt vev. Å studere funksjonene til gingival epitelceller har avgjørende vitenskapelig verdi, for eksempel å reparere orale feil og oppdage kompatibiliteten til biomaterialer. Siden humane gingival epitelceller er svært differensierte keratiniserte celler, er levetiden kort, og de er vanskelige å passere. Så langt er det bare to måter å isolere og kultur gingival epitelceller, en direkte explant metode og en enzymatisk metode. Imidlertid er tiden som kreves for å oppnå epitelceller ved hjelp av den direkte explant-metoden lengre, og celleoverlevelsesgraden til den enzymatiske metoden er lavere. Klinisk er oppkjøpet av gingivalvev begrenset, så det er nødvendig med et stabilt, effektivt og enkelt in vitro-isolasjons- og kultursystem. Vi forbedret den tradisjonelle enzymatiske metoden ved å legge til Y-27632, en Rho-assosiert kinase (ROCK) hemmer, som selektivt kan fremme veksten av epitelceller. Vår modifiserte enzymatiske metode forenkler trinnene i den tradisjonelle enzymatiske metoden og øker effektiviteten til å dyrke epitelceller, som har betydelige fordeler i forhold til den direkte explant-metoden og den enzymatiske metoden.
Den menneskelige gingiva, den første linjeforsvarsstrukturen som beskytter periodontalt vev, er ikke bare en fysisk og kjemisk barriere1, men skiller også ut forskjellige klasser av inflammatoriske mediatorer som deltar i immunresponser og utgjør en immunbarriere2,3. Gingival epitel spiller en viktig rolle i reparasjon og regenerering av periodontalt vev. Derfor er det å studere gingival epitelets forsvar og immunitet av stor betydning for å forstå forekomsten, diagnosen og behandlingen av periodontitt. Isolasjonen og kulturen av gingival epitelceller fra humant gingivalvev er det første trinnet som kreves for å studere gingival epitelet. En slik prosedyre krever grunnleggende operasjoner som å produsere frøceller for vevsteknikk, in vitro-modeller av periodontale tilknyttede sykdommer og materialer for reparasjon av periodontale feil.
Primære gingival epitelceller er preget av en lav divisjonsrate in vitro4, forskere har lett etter en optimal isolasjons- og dyrkingsmetode i flere tiår. Til dags dato brukes to forskjellige teknikker, en direkte explant-metode og en enzymatisk metode, ofte i laboratorier for å oppnå primære gingival epitelceller in vitro4,5. Den direkte explant-metoden har fordeler som kravet om en lavere mengde vevsprøver og enkel isolasjonsprosedyre, men den har ulempene med lengre kulturtid og følsomhet for forurensning5. Selv om den enzymatiske metoden forkorter kulturtiden som kreves, er effektiviteten relativt lav og varierer avhengig av enzymer og medium som brukes. Kedjarune et al.6 viste at den direkte explant-metoden, som krever mer tid før subkultur (2 uker), så ut til å være mer vellykket for å dyrke gingival epitelceller sammenlignet med den enzymatiske metoden. Men sammenlignet med disse to metodene fant Klingbeil et al.7 at den enzymatiske metoden hadde de beste resultatene for primærkulturer av orale epitelceller, og det var mulig å oppnå det optimale celleutbyttet innen kortest tidsperiode (11,9 dager versus 14,2 dager).
Derfor var det viktig å utvikle en mer praktisk og effektiv metode for isolasjon og kultur av orale epitelceller4. Vi har tidligere rapportert at tilsetning av Y-27632, en hemmer av Rho-assosiert proteinkinase (ROCK), forenkler isolasjonsprosedyren til humane primære epidermale celler og keratinocytter fra voksent hudvev8,9,10. Vi utviklet G-medium, et nytt betinget inokulasjonsmedium som spontant skiller epidermal fra dermale celler og støtter vekst og utbytte av primære epidermale celler8,9,10. I den nåværende studien utviklet vi en ny serumfri isolasjons- og kulturteknikk for gingival epitelceller ved å kombinere G-medium med Y-27632. I hovedsak er vår metode basert på en forenkling av den tradisjonelle to-trinns enzymatiske metoden, så vi sammenlignet vår nye metode med den direkte explant-metoden. Denne modifiserte enzymatiske metoden forkorter betydelig tiden som kreves for å skille gingival epitelceller fra gingivalvev og øker effektiviteten av å dyrke gingival epitelceller.
Gingivalvevet er en nøkkelstruktur som opprettholder periodontal integritet og helse. Gingival epitelceller har betydelige roller i reparasjon og regenerering av periodontalt vev og kan brukes i vitenskapelig forskning og kliniske anvendelser og relaterte felt, inkludert oral biologi, farmakologi, toksikologi og orale slimhinnemangler18. Derfor er det nødvendig å utvikle en stabil og effektiv metode for å høste orale epitelceller19. Primære epitelceller er en slags fu…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) til X.W.; Det viktigste forsknings- og utviklingsprogrammet i Shandong-provinsen (2018GSF118240) til J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2018WS163) til Z.X., og Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2019WS045) til J.S.
Names | Abbreviations & Comments | ||
Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |