このプロトコルは、嗅覚回路アセンブリの研究のためのアンテナ - 脳外植システムの解剖手順、培養状態、およびライブイメージングを記述する。
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この記事について
サマリー
要約
〜ニューロンは正確に相互接続され、脳の適切な機能に不可欠な回路を形成します。 ショウジョウバエ の嗅覚系は、触角および上顎触診からの50種類の嗅覚受容体ニューロン(ORN)が軸索を触角葉の50個の識別可能な糸球体に投影し、50種類の二次突起ニューロン(PN)からの樹状突起とのシナプス接続を形成するため、このプロセスを調査するための優れたモデルを提供する。これまでの研究では、主に、固定組織を用いて嗅覚回路における正確な標的化を調節する重要な分子を同定することに焦点を当てていた。ここでは、培養における嗅覚回路アセンブリの重要な発達マイルストーンを反復するアンテナ脳外植システムについて説明する。外側のキューティクルを解剖し、発達中の蛹の脳を覆っている不透明な脂肪体を洗浄することで、生きた脳からの単一のニューロンの高品質の画像を2光子顕微鏡で収集することができます。これにより、生組織からの単一のORN軸索ターゲティングのタイムラプス画像化が可能になる。このアプローチは、以前に同定された重要な遺伝子の重要な細胞生物学的背景と機能を明らかにし、回路アセンブリの動的プロセスを支えるメカニズムを特定するのに役立ちます。
概要
ニューロンは正確に相互接続され、脳の適切な機能に不可欠な回路を形成します。100年以上にわたり、神経科学者は、神経突起が中間および最終標的に向かって非常に正確にどのように拡張するかを理解しようとしてきました。その結果、彼らはニューロンプロセスを発達させるためのガイダンス手がかりをコードする重要な遺伝子を同定した1。 ショウジョウバエ の嗅覚系は、嗅覚受容体ニューロン(ORN、一次感覚ニューロン)がステレオタイプなサイズ、形状、相対位置を持つ50個の識別可能な糸球体に投影し、50種類の2次突起ニューロン(PN)の樹状突起とシナプス結合を形成し、それぞれが樹状突起を50個の糸球体2 の1つに送信するため、このプロセスを調査するための優れたモデルを提供します(図1A).したがって、フライ嗅覚系におけるシナプス(糸球体)分解能で変異表現型を同定することは比較的容易である。これにより、嗅覚回路アセンブリ3を調節する重要な遺伝子の発見につながった。
フライ嗅覚回路の組み立ては、時間的および空間的に調整された発生プロセスに依存する3。ORNとPNは、配線の特異性のためにプログラムを設定する別個のセル運命を獲得します。次に、P....
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プロトコル
1. 試薬の調製
メモ: このプロトコルのすべての手順は、特に説明がない限り、室温 (20 ~ 25 °C) で実行されます。
- タイムラプスイメージング中に外植体を固定化するための培養皿を準備するために、厚さ0.5cmのシルガード(使用前に2つの液体成分を10:1の比率で十分に混合する)を60mm×15mmのシャーレの底面に敷き詰め、室温で48時間硬化させる(図2A、以下のテキストではシルガードプレートと呼ぶ)。
- このプレートに外植体を固定するためのマイクロピンを準備するには、一対の鉗子を使用して、鋭利な端を片側に揃えたテープに複数のマイクロピンを貼り付けます(図2B)。一対のはさみを使用して、マイクロピンの鋭い端から約2mmを切り取ります(図2B ́)。鉗子を使用して切断したマイクロピンを保持し、既製のシルガードプレートのシルガード層に挿入します(図2C)。2つのマイクロピンを使用して、1つの外植体を固定化します。
- ブラシを使用して、hsFLP、小石-GAL4 / +の1時間以内に蛹を形成する白い蛹を収集....
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結果
ORN軸索は、18時間から36時間APFの間の触角葉に到着する。その後、触角葉をナビゲートし、正中線を横切り、糸球体を神経支配します。ビデオ1は、20分毎の頻度で24時間撮影された、個々に識別可能ないくつかの軸索の全プロセスを示す代表的な ビデオ である。TurboRegを使用して登録する前に、軸索は脳が発達するにつれていくらかの横方向の漂流を示す(ビデオの前半)。登録後、ドリフトが補正されます(動画の後半)。
同じ外植体からいくつかのORN軸索を分離するために、1つの例が図5に示されている。ステップ4.3の手順に従って、図5Aに示す外植体からVA1dおよびVA1v軸索を抽出し、これら2つの軸索のみを含む新しいzスタック画像を生成した(図5B)。同様に、VM2およびVM3軸索(図5B ́)およびDL2軸索(
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ディスカッション
ショウジョウバエのアンテナ脳外植体は、嗅覚回路の正常な標的を保持している。我々は、開発がin vivoと比較して2倍遅いex vivoであることに気付きました。外植系は、6種類のORNを宿主とする上顎触診を保持しないことに留意されたい。正常な発達がエクスビボで反復されることを確実にするために、外植体解剖中に触角神経の伸張を避ける必要がある。エクスビボ培養細菌増殖の間、通常、嗅覚回路の発達停止を引き起こす。そのため、イメージング前に培養皿やピンを徹底的に滅菌し、イメージング室を清潔で隔離しておくことが大切です。
このエクスプラントは、タイムラプスイメージングに基づく長期的な2光子顕微鏡法をサポートします。単一ORNのまばらな標識のために新しく開発されたレポーターと組み合わせることで、外植システムは単一の軸索末端からの高解像度イメージングを可能にします。このシステムは、嗅覚回路アセンブリ8の動的プロセスを支える細胞生物学的メカニズムを研究するのに強力.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
私たちは、外植文化に関するアドバイスをしてくれたN. ÖzelとR. Hiesingerに感謝します。M. ワーグナー 二光子顕微鏡の技術的支援;トランスジェニックハエを生成するためのD.J.ルギンブール;D.フリードマンフィジーソフトウェア分析の提案;Y. Ge 飛行作業の援助のため;C. McLaughlin と K.K.L. Wong が原稿に関するコメントを募集しています。L.L.はハワード・ヒューズ医学研究所の研究者です。この研究は、国立衛生研究所の助成金1K99DC01883001(T.L.へ)とR01-DC005982(L.L.へ)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 20-ヒドロキシエクジソン | Sigma | H5142 | |
| カメレオン Ti:サファイアレーザー | コヒーレント | コヒーレント MRU X1 | |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10082147 | |
| ヒトインスリン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12585014 | |
| イメージングソフトウェア | プレーリー | ||
| マイクロハサミ | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 酸素ボンベ | Praxair | OX M-E | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 15140122 | |
| シュナイダー's ショウジョウバエ Medium | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 21720024 | |
| SYLGARD 184 シリコーンエラストマー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | NC0162601 | |
| 2光子顕微鏡 | ブルカー | ||
| 水浸対物レンズ (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
参考文献
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neu....
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再版と許可
