Summary
이 프로토콜은 후각 회로 어셈블리의 연구를 위한 안테나-뇌 explant 시스템의 해부 절차, 배양 조건 및 라이브 이미징을 기술한다.
Abstract
~ 뉴런은 뇌의 적절한 기능에 필수적인 회로를 형성하기 위해 정확하게 상호 연결되어 있습니다. Drosophila 후각 시스템은 안테나와 상악 마비의 50 가지 유형의 후각 수용체 뉴런 (ORNs)이 안테나 엽의 50 식별 가능한 사구체에 축색돌기를 투사하고 50 가지 유형의 이차 프로젝션 뉴런 (PN)의 수상 돌기와 시냅스 연결을 형성하기 때문에이 과정을 조사하는 훌륭한 모델을 제공합니다. 이전의 연구는 주로 고정 된 조직을 사용하여 후각 회로에서 정확한 표적화를 조절하는 중요한 분자를 확인하는 데 중점을 두었습니다. 여기에서는 문화에서 후각 회로 조립의 주요 발달 이정표를 되풀이하는 안테나 - 뇌 explant 시스템이 설명됩니다. 외부 큐티클을 해부하고 번데기 뇌를 덮고있는 불투명 한 지방체를 청소함으로써 살아있는 뇌에서 단일 뉴런의 고품질 이미지를 이광자 현미경을 사용하여 수집 할 수 있습니다. 이를 통해 살아있는 조직으로부터 단일 ORN 축삭 표적화의 타임랩스 이미징이 가능합니다. 이 접근법은 이전에 확인 된 중요한 유전자의 중요한 세포 생물학적 맥락과 기능을 밝히고 회로 조립의 동적 과정을 뒷받침하는 메커니즘을 식별하는 데 도움이됩니다.
Introduction
뉴런은 뇌의 적절한 기능에 필수적인 회로를 형성하기 위해 정확하게 상호 연결되어 있습니다. 100 년 이상 동안 신경 과학자들은 신경돌기가 극도의 정밀도로 중간 및 최종 목표를 향해 어떻게 확장되는지 이해하려고 노력해 왔습니다. 결과적으로, 그들은 신경 세포 과정을 개발하기위한 안내 단서를 인코딩하는 중요한 유전자를 확인했습니다1. Drosophila 후각 시스템은 후각 수용체 뉴런 (ORNs, 일차 감각 뉴런)이 고정 관념의 크기, 모양 및 상대적 위치를 가진 50 개의 식별 가능한 사구체에 투사하여 50 가지 유형의 2 차 투영 뉴런 (PN)에서 수상 돌기와 시냅스 연결을 형성하기 때문에이 과정을 조사하는 데 탁월한 모델을제공합니다 (그림 1A ). 따라서, 파리 후각 시스템에서 시냅스(사구체) 분해능에서 돌연변이 표현형을 확인하는 것은 비교적 쉽다. 이로 인해 후각 회로 어셈블리를 조절하는 중요한 유전자가 발견되었습니다3.
플라이 후각 회로의 조립은 시간적, 공간적으로 조정 된 발달 과정3에 의존합니다. ORN과 PN은 뚜렷한 세포 운명을 획득하여 배선 특이성에 대한 프로그램을 설정합니다. 다음으로, PN 수상 돌기는 안테나 로브를 미리 패턴화합니다(그림 1B). ORN의 축삭은 동측성 안테나 엽을 우회하고 뇌의 중간 선을 교차하여 대측 안테나 엽에 도달합니다. 그 후, ORN 축삭은 ipsi- 및 대측성 안테나 엽 모두를 침범하고 특정 사구체에서 파트너 PN의 수상 돌기와 함께 시냅스를 형성합니다. 후각 회로 조립을 위한 이 거친 모델은 개발 중 중간 시점으로부터 고정된 샘플의 특성화를 기반으로 제안되었다. 열악한 시간적 분해능과 고정 조직으로부터 발달 전반에 걸쳐 동일한 뉴런 과정을 따를 수 없다는 것은 회로 조립 공정에 대한 기계론적 이해를 제한한다.
안테나 로브가 번데기 케이스 내부의 불투명 한 지방체로 둘러싸여있을 때 번데기 단계의 전반부에서 배선 과정이 발생하기 때문에 생체 내에서 ORN 및 PN 프로세스를 라이브하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 따라서 손상되지 않은 번데기에서 발달하는 후각 회로를 직접 이미지화하는 것은 불가능합니다. 생체외에서 배양된 해부된 조직은 조직 불투명도를 회피할 수 있고, 신경 발달4,5,6을 연구하는데 성공적으로 이용되었다. 번데기 뇌에서 뉴런 배선을 연구하기 위해 유사한 생체외 외래 배양 전략을 사용하는 과제는 배양 조건에서 정확한 뉴런 표적화를 되풀이하는지 여부입니다. 플라이 안구-뇌 복합체(7)에 대한 이전에 보고된 생체외 배양 조건에 기초하여, 번데기 전체 뇌, 안테나, 및 연결 안테나 신경을 온전하게 포함하는 외래 식물이 최근에 개발되어 후각 회로의 정확한 표적화를 유지하고 매 20분마다8의 주파수에서 최대 24시간 동안 이광자 현미경 기반 라이브 이미징을 실시할 수 있다. . 여기에서, explant 배양 및 이미징의 상세한 프로토콜이 설명된다. explant 시스템은 후각 회로 및 중앙 뇌의 잠재적으로 다른 회로의 어셈블리를 연구하는 강력한 방법을 제공합니다.
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Protocol
1. 시약의 제조
참고: 이 프로토콜의 모든 단계는 달리 설명되지 않는 한 실온(20-25°C)에서 수행됩니다.
- 시간 경과 영상화 동안 외식편을 고정화하기 위한 배양 접시를 준비하기 위해, 0.5 cm 두께의 실가드(사용 전에 10:1 비율로 두 액체 성분을 완전히 혼합)를 60 mm x 15 mm 페트리 접시의 바닥 표면에 놓고 실온에서 48시간 동안 경화시킨다(도 2A, 다음 텍스트에서 실가드 플레이트라고 함).
- 이 플레이트에 explant를 고정시키기 위한 마이크로 핀을 준비하려면 한 쌍의 포셉을 사용하여 한쪽에 날카로운 끝이 정렬된 테이프에 여러 개의 마이크로 핀을 붙입니다(그림 2B). 한 쌍의 가위를 사용하여 마이크로 핀의 날카로운 끝에서 ~2mm를 자릅니다(그림 2B'). 포셉을 사용하여 절단된 마이크로 핀을 잡고 미리 만들어진 Sylgard 플레이트의 Sylgard 레이어에 삽입합니다(그림 2C). 두 개의 마이크로 핀이 하나의 explant를 고정시키는 데 사용됩니다.
- 브러시를 사용하여 1 시간 이내에 번데기를 형성하는 흰 번데기를 수집하여 hsFLP, 자갈-GAL4 / +; UAS-FRT 100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 유전자형을 새로운 바이알로 옮긴다. 37°C 수조에서 40분 동안 열 충격을 가하여 무작위 유형으로부터 희소 ORN 클론을 유도하였다. 열 충격 후, 바이알을 25°C에서 30시간 동안 넣고, 번데기 형성 후 30 h에서 숙성된 번데기를 초래하였다(APF).
- 식재용 배지를 준비하려면 페니실린-스트렙토마이신 5mL(10,000 U/mL)를 슈나이더 초파리 배지 500mL에 첨가한다. 배지를 여과하고 50 mL 코니컬 튜브에 45 mL 분취량을 만드십시오. 배지는 4°C에서 1-2개월 동안 저장될 수 있다.
- 이미징 당일, 슈나이더 초파리 배지 45mL의 튜브 하나를 취하여 소 태아 혈청 5mL(10% v/v), 4mg/mL 인간 인슐린 원액 125μL(최종 농도 10μg), 에탄올에 녹인 1mg/mL 20-하이드록시에키손 원액 50μL(최종 농도 1μg/mL)를 첨가합니다. 잘 섞어서 전체 배지 15mL를 새로운 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 전체 배지의 나머지 부분은 일주일 동안 4°C에서 저장할 수 있다. 소 태아 혈청, 인간 인슐린 원액 및 20-하이드록시에키디손 원액을 분취하여 -20°C에서 보관한다.
- 액체 표면 아래의 산소 실린더에서 멸균된 5mL 피펫 팁을 통해 20-30분 동안 하나의 기포/s의 속도로 산소 기포를 펌핑하여 15mL 전체 배지에 산소를 공급합니다. 이 과정에서 튜브의 개구부를 덮기 위해 파라핀 필름을 사용하십시오.
- 해부 우물 표면 및 실가드 플레이트(단계 A1 및 A2에서 제조된 실가드 층에 마이크로핀이 삽입됨)를 70% 에탄올로 멸균한다. 사용하기 전에 말리십시오.
2. 추방 해부
- 브러시를 사용하여 번데기 30 시간 APF (번데기 형성 후 30 시간) 번데기를 종이 조직으로 옮기고 번데기의 외부 표면을 5 분 동안 건조시킵니다.
- 유리 슬라이드에 양면 테이프 조각을 놓습니다. 말린 번데기를 테이프의 끈적 끈적한 표면에 조심스럽게 붙이고 등쪽이 위쪽을 향하게하십시오. 번데기의 복부 쪽이 테이프에 잘 부착되도록 브러시로 번데기를 부드럽게 누릅니다(그림 3A). 번데기를 손상시키지 마십시오.
- 한 쌍의 포셉을 사용하여 머리의 등쪽을 덮고 있는 갈색 번데기 케이스를 제거합니다(그림 3A,B). 갈색 번데기 케이스와 번데기 사이에 포셉의 날카로운 팁 하나를 옆쪽에서 삽입하고 번데기의 후부 끝까지 선을 통해 갈색 번데기 케이스를 조심스럽게 분리하십시오 (그림 3B, C). 갈색 번데기 케이스를 엽니 다. 한 쌍의 포셉을 사용하여 번데기를 부드럽게 잡고 1 mL의 산소가 함유 된 전체 배지로 해부 웰로 옮깁니다. 중간 표면에 떠 있는 번데기를 잠수시켜 우물 바닥으로 가라앉히도록 합니다(그림 3D).
참고 : 포셉으로 번데기를 다치게하지 않도록 갈색 번데기 케이스 안에 포셉 팁을 너무 깊게 삽입하지 마십시오. - 번데기에서 안테나-뇌 explant를 해부하려면 포셉을 사용하여 한 손으로 번데기를 부드럽게 잡고 한 쌍의 미세 가위를 사용하여 번데기의 뒤쪽에서 작은 구멍을 다른 손으로 자릅니다 (그림 3E). 이 작은 구멍은 번데기 내부의 높은 압력을 방출합니다.
- 구멍에서 번데기의 복부 중앙선을 통해 목 (머리와 흉부를 연결하는 좁은 구조)까지 미세 가위로 자릅니다 (그림 3F). 그런 다음 목의 둘레를 잘라 번데기의 몸에서 머리를 분리합니다 (그림 3G). 시체를 제거하고 다른 우물에 놓습니다.
참고 : 뇌를 압박 할 수있는 번데기의 등쪽 / 복부 쪽에서 목을 직접 자르지 마십시오. - 뇌의 등쪽을 덮고 있는 투명한 큐티클을 자릅니다(그림 3H). 이것은 뚱뚱한 몸을 뇌 위에 노출시킵니다. 망막과 안테나가 부착 된 큐티클을 유지하십시오. 뇌의 복부 쪽에 동일한 절차를 반복하십시오.
참고: 가위의 칼날을 큐티클 아래에 너무 깊이 삽입하면 안테나와 뇌를 연결하는 안테나 신경이 절단되므로 삽입하지 마십시오(그림 3H'). - P10 피펫을 사용하여 매질을 머리의 등쪽 및 복부 측면의 열린 영역 쪽으로 피펫팅하여 뇌와 안테나를 덮고 있는 지방체를 부드럽게 씻어냅니다(그림 3I).
참고 : 뇌가 큐티클에서 쉽게 분리 될 수 있으므로 매체를 피펫팅 할 때 매우 부드럽게하십시오. 이 단계에서 모든 뚱뚱한 몸이 제거되었는지 확인하십시오. ORN 축삭의 체포 된 발달은 지방 체가 잘 청소되지 않았을 때, 아마도 매체로부터의 산소 접근이 좋지 않기 때문에 관찰되었습니다. - PN 수상 돌기 표적화에 대한 양측 ORN 축삭 또는 ORN 축색돌기의 상호작용을 연구하기 위해, 이 단계8 동안 하나 또는 두 개의 안테나 신경을 미세가위로 절단한다(도 3J). 조심스럽게 큐티클과 뇌 사이에 가위의 칼날을 놓고 관심있는 안테나 신경을 절단하십시오.
- 해부된 외출물을 실가드 플레이트로 옮기려면 실가드 표면에 산소화된 전체 배지(~200μL)의 물방울을 놓는다. 200 μL 폭의 팁 피펫 팁의 내부 표면을 해부된 트렁크로부터의 지방체와 코팅하여(단계 1.6) 지방체를 여러 번 피펫팅함으로써, 이식 중에 외식편이 피펫 팁에 달라붙는 것을 방지한다. 그런 다음, 이 넓은 팁 피펫 팁을 사용하여 해부 우물에서 배양 플레이트의 배지 액적으로 외출물을 옮깁니다(그림 3K).
- 포셉을 사용하여 두 개의 광학 로브의 Sylgard 레이어에 explant를 고정합니다(그림 3L). Sylgard 플레이트를 이미징 스테이션에 조심스럽게 놓고 플레이트를 테이프로 고정시킵니다. P1000 피펫을 사용하여 산소화된 전체 배지 10mL를 Sylgard 플레이트에 천천히 첨가한다.
참고 : Sylgard 플레이트에 배지를 추가 할 때 explant를 방해하지 마십시오.
3. 이광자 현미경 기반 라이브 이미징
- 타임랩스 이미징을 수행하려면 이광자 현미경, Ti:Sapphire 레이저, 20x 침수 목표(1.0NA) 및 이미징 소프트웨어를 사용합니다. GFP 단백질을 이미징하기 위해 920nm에서 여기 파장을 사용하십시오. 픽셀 유지 시간을 10μs로 조정합니다.
- 이미징 스테이션 위치를 조정하여 외식편이 대략 목표 아래에 있도록 합니다. 이미징하기 전에 70 % 에탄올을 사용하여 렌즈를 멸균하십시오. 외식식물에 가까운 배지 아래에서 목표를 천천히 낮춥니다. 목표렌즈에 거품이 있는지 확인하십시오.
- 그렇다면 목표를 매체 위로 들어 올리고 거품이 사라질 때까지 반복하십시오. 접안 렌즈를 사용하여 외식편을 찾고 현장에서 하나의 explant를 중심으로하십시오.
- 타임랩스 이미징을 위해 드물게 라벨이 붙은 몇 개의 ORN을 가진 외래식을 보장하려면, 매번 ~10개의 외식편을 해부하고 배양 플레이트의 y축에 정렬한다. 목표물을 y축을 따라 움직여 모든 외식물을 스크린하고 이미징을 위해 몇 개의 단일 ORN 축삭이 안테나 로브에 방금 도달한 외래 식물을 선택합니다(그림 4A).
- 타원형 모양과 그것을 둘러싸기 시작하는 ORN 축삭으로 안테나 엽을 인식하십시오. xy 평면에서 ~150μm x 150μm 영역을 이미지화합니다(20x 목표치로 3x 줌). 두 안테나 로브의 경계를 추정하고 이미징 영역에 중심을 맞춥니다.
- 스캔의 하단 섹션과 상단 섹션을 정의하여 z축을 따라 초기 이미징 영역을 선택합니다. z축을 따라 이미징 영역을 설정합니다. ORN 축삭 신호가 있는 가장 깊은 구간을 첫 번째 이미징 세션으로 설정하고 100μm 위(더 피상적인 측면)를 마지막 이미징 세션으로 설정합니다(그림 4B).
참고 : 이것은 ORN 축삭의 상단 (피상적 인 측면)에 일부 섹션을 남기고 배양 중 뇌의 성장으로 인해 ORN 축삭이 이미징 영역 밖에서 위쪽으로 이동하는 것을 방지합니다.- 2μm 간격으로 이미지. 이미징 소프트웨어를 사용하여 20분마다 자동 이미징 스캔을 설정합니다.
- 이미징 영역을 처음 4시간 이미징 후 z축을 따라 20μm 위쪽으로 이동하고, 16시간 이미징 후 z축을 따라 또 다른 20μm를 위쪽으로 이동시킨다. 이는 이미징 소프트웨어에서 스크립트와 다른 z 스택을 설정하여 달성할 수 있습니다.
- 외래를 영상화 후 추가 기간 동안 배양하고(최대 24시간 ex 생체내) 고정시키고 뉴로필 마커인 N-cadherin으로 염색하여, 사구체에 의한 각각의 단일 ORN의 유전적 동일성을 밝히기 위해 표적으로 한다.
4. 이미지 처리
- 피지 소프트웨어를 사용하여 각 시점에서 촬영 한 섹션 시리즈의 z 스택 이미지를 처리하려면 이미지 섹션 시리즈를 열고 이미지를 클릭하십시오 | 스택 | Z 프로젝트 [/].
- 문화권 동안 샘플의 측면 드리프트를 수정하려면 피지에 TurboReg 플러그인 을 설치하십시오.
- 시리즈에서 z 스택 이미지 시리즈와 단일 z 스택 이미지를 엽니다. 플러그인 열기 | 등록 | 터보레그.
- 소스에서 z 스택 이미지 시리즈를 선택하고 대상 |에서 단일 z 스택 이미지를 선택합니다. 번역. Batch 버튼을 클릭하여 열린 z 스택 이미지 시리즈의 모든 이미지를 등록하십시오.
- 이미지화된 샘플의 유용성을 최대화하려면 3D 이미지 섹션 다음에 나오는 z 스택 이미지에서 서로 부근의 희소하게 레이블이 지정된 단일 축삭을 서로 분리합니다.
- 동일한 이미지의 몇 축삭에서 단일 ORN 축삭을 추출하려면 이미지 섹션 시리즈를 열고 플러그인을 클릭하| 세분화 | 세그멘테이션 편집기 [/]. 브러시 도구를 선택하고 각 이미지 섹션에서 "+" 또는 "-" 단추 선택을 사용하여 세그멘테이션 편집기 작업 창에서 관심 있는 ORN 축삭을 마스크합니다.
- 프로세스 |을 클릭하십시오. 이미지 계산기 [/]. 이미지 1에서 " 이미지 X", 작업에서 "곱하기", 이미지 2에서 "이미지 X. 레이블" , [/]를 선택합니다. 이렇게 하면 관심 축삭만 있는 새 이미지 시리즈 파일이 생성됩니다. 4.1단계를 수행하여 z 스택 이미지를 처리합니다. 모든 시점에 대해 이 단계를 반복하여 시계열 이미지 파일을 생성합니다.
- 동일한 이미지에서 서로 다른 축삭을 의사 컬러링하려면 먼저 4.3단계를 수행하여 각 축삭의 시계열 이미지 파일을 별도로 생성합니다. 동일한 원시 데이터 이미지에서 서로 다른 단일 축삭에 대한 시계열 이미지 파일을 엽니다. 이미지 |를 클릭하십시오. 색상 | 채널 병합. 다른 색상 채널에서 다른 시계열 이미지 파일을 선택하고 확인을 클릭합니다.
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Representative Results
ORN 축삭은 18 h와 36 h APF 사이의 안테나 엽에 도착합니다. 그런 다음 안테나 엽을 탐색하고 미드 라인을 건너 사구체를 신경질합니다. 비디오 1은 24시간 동안 매 20분마다 촬영된 여러 개의 개별적으로 식별 가능한 축삭에 대한 전체 과정을 보여주는 대표적인 비디오 입니다. TurboReg를 사용하여 등록하기 전에, 축삭은 뇌가 발달함에 따라 측면 표류를 나타냅니다 (비디오의 전반부). 등록 후 표류가 수정됩니다 (비디오의 후반부).
동일한 외식편으로부터 몇 개의 ORN 축삭을 분리하기 위해, 한 가지 예가 그림 5에 도시되어 있다. 단계 4.3의 절차에 따라, 도 5A에 도시된 외래식으로부터 VA1d 및 VA1v 축삭을 추출하여 이들 두 축삭만을 갖는 새로운 z 스택 이미지를 생성하였다(도 5B). 유사하게, VM2 및 VM3 축삭(도 5B') 및 DL2 축삭(도 5B'')이 추출되었다. 도 5C는 도 5B-B''의 이미지들을 의사 색상과 병합하는 것을 도시한다. 각 ORN 축색돌기의 유전적 동일성은 고정된 외식식물의 뉴로필 마커 N-카데린의 면역염색에 의해 밝혀졌다(도 5D, E).
그림 1: 플라이 후각 회로의 구조. (A) 성인 파리 머리는 오른쪽 안테나 (녹색)에서 하나의 ORN이 뇌의 양쪽 안테나 엽 (AL)으로 축삭을 보내고 동측성 및 대측성 AL의 PN (적색)의 수상 돌기와 함께 특정 사구체에서 시냅스 연결을 형성합니다. 파선 세로선은 이 다이어그램과 후속 다이어그램 및 이미지에서 중간선을 나타냅니다. (B) 후각 회로 발달을 보여주는 도면. (1) PN 수상 돌기는 먼저 안테나엽(적색)의 영역을 신경질화한다. ORN 축삭은 뇌의 안테나 엽에 도달합니다. (2) ORN 축삭은 안테나엽을 우회하기 위해 등쪽 (녹색) 또는 벤트로 메디아 (파란색) 궤적을 취합니다. (3) ORN 축삭은 미드라인을 교차한다. (4) ORN 축삭돌기는 안테나엽에 사구체를 신경을 씁니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 외식용 이미징 챔버의 제조. (A) 실리콘 엘라스토머(∼0.5 cm)의 층을 60 mm 페트리 접시의 바닥에 놓는다. (B-B') 테이프에 핀을 정렬하고 한 쌍의 가위를 사용하여 ~ 2mm 길이로 자릅니다. (c) 마이크로핀을 배양 플레이트의 실리콘 엘라스토머 층 상에 핀핑한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 안테나-뇌 이식을 위한 해부 절차. (A) 종이 조직 건조 번데기의 복부 쪽을 유리 슬라이드의 양면 테이프에 부착한다. (B-C) 포셉을 사용하여 외부 갈색 큐티클을 잘라 번데기를 안쪽에 노출시킵니다. (D) 번데기를 산소가 공급된 전체 배지로 해부 우물로 옮긴다. (E-G) 미세 가위를 사용하여 번데기 트렁크를 머리에서 조심스럽게 분리하십시오. (H) 뇌의 등쪽과 복부 측면을 덮고있는 반투명 큐티클 조각을 자른다. 망막, 안테나 및 뇌 사이의 연결을 유지하기 위해 뇌의 전방 및 측면 측면에 약간의 큐티클을 유지하십시오. (H') 이 단계에서 안테나 신경을 절단하지 마십시오. (I) 부드럽게 피펫팅하여 뇌를 덮고 있는 뚱뚱한 몸을 청소한다. (J) 특정 실험에서 미세가위를 사용하여 하나 또는 두 개의 안테나 신경을 절단합니다. (K) 배양 플레이트의 표면에 산소화된 전체 배지의 액적을 놓는다. 해부된 explant를 넓은 팁 피펫 팁을 사용하여 옮깁니다. (L) 포셉을 사용하여 실리콘 엘라스토머 층에 explant의 두 개의 광학 엽을 고정시킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 외식편에서 표적으로 삼는 단일 ORN 축색돌기의 타임랩스 이미징 . (A) 안테나엽에 막 도달하는 ORN 축삭이 몇 개 있는 외래 식물을 선택합니다. 축삭의 곡률에 의해 두 개의 안테나 로브의 모양을 추정하고 이미징 필드의 안테나 로브를 중심으로합니다. (B) z축을 따라 이미징 영역을 설정합니다. 안테나 엽은 뇌가 성장하고 발달함에 따라 위쪽으로 움직일 것이라고 생각하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 단일 ORN을 추출하고 사구체 ID를 나타냅니다. (A) 20x 대물렌즈와 3배 확대를 가진 2광자 현미경을 사용하여 5-10개의 단일 ORN 축삭을 가진 explant의 최대 프로젝션 이미지입니다. (B-B'') 1-2개의 단일 축삭은 원시 이미지 데이터에서 이미지 섹션에 마스크를 수동으로 생성하여 (A)에서 추출됩니다. (C) (B-B'')의 이미지를 각 축삭 의사 색상과 다르게 병합합니다. (D-D') 최대 프로젝션 공초점 이미지는 40x 대물렌즈와 1.5x 줌으로 촬영됩니다. (A)에 나타낸 엑식은 고정시킨 다음, 항-GFP 및 항-N-카데린(뉴로필 마커)으로 염색하였다. 안테나 로브의 전방 및 후부 반쪽은 (D) 및 (D')에서 별도로 스택된다. (e) 안테나 로브 맵은 (B,C)에서 추출된 ORN 축색돌기를 보여준다. 이 도면에 도시된 일부 이미지는 선행 연구8로부터 수정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 이광자 현미경 기반 타임랩스 이미지는 이미지 등록 전후에 두 개의 ORN 축삭의 타겟팅을 보여줍니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
초파리 안테나-뇌 explant는 후각 회로의 정상적인 표적을 유지합니다. 우리는 발달이 생체 내에서보다 2 배 느린 생체 외 발달을 알아 차렸다. explant 시스템은 여섯 가지 유형의 ORN을 호스팅하는 상악 마비를 유지하지 않습니다. 정상적인 발달이 생체 외에서 되풀이되도록하기 위해, 안테나 신경의 스트레칭은 explant 해부 중에 피할 필요가 있습니다. 생체외 배양 동안 박테리아 성장은 일반적으로 후각 회로의 체포 된 발달을 일으킨다. 따라서, 영상화 전에 배양접시와 핀을 철저하게 살균하고 영상실을 청결하고 단리하여 유지하는 것이 중요하다.
이 explant는 장기 이광자 현미경 검사 기반 타임랩스 이미징을 지원합니다. 단일 ORN의 희소 라벨링을 위해 새로 개발된 리포터와 결합된 explant 시스템은 단일 축삭 종점에서 고해상도 이미징을 가능하게 합니다. 이 시스템은 후각 회로 어셈블리(8)의 동적 과정을 뒷받침하는 세포 생물학적 메카니즘을 연구하는데 강력하다. 후각 회로 개발이 여기에 예로 제시되었지만,이 시스템은 잠재적으로 발달하는 중추 뇌의 다른 회로 또는 다른 발달 과정에 대한 연구로 확장 될 수 있습니다.
explant는 ORN 타겟팅의 전체 과정을 포착 할 수있는 적어도 24 시간 동안 배양물에서 정상적인 발달을 유지합니다. 그것은 연구자들이 뉴로필 마커 포스트 고정과의 카운터 염색을 통해 단일 ORN 축삭돌기의 유전 적 정체성을 밝힐 수있게 해줍니다.안테나 엽은 이미 배양이 끝날 때까지 명백한 사구체 구조를 개발합니다. 이 전략은 팬 ORN 드라이버를 사용하여 특정 유형의 ORN을 이미징하기 위해 초기 발달 단계에서 많은 ORN 유형에 대한 특정 유전 적 동인이 부족한 문제를 회피합니다.
더 높은 시공간 분해능을 달성하기 위해, 이 explant 시스템은 적응형 광학 격자 광 시트 현미경(AO-LLSM)인 고급 현미경을 사용하여 이미징할 수 있습니다. AO-LLSM은 볼륨 당 30 초마다축삭 단자의 미세 구조와 스캔 주파수를 시각화 할 수 있음이 입증되었습니다 8,9,10,11. explant의 한 가지 장점은 영상화 전에 배지 내의 염료와 함께 특정 뉴런에서 Halo-tag를 발현하는 외식편을 인큐베이션함으로써 Janelia Fluorophore 염료12,13,14 표지와의 상용성이다. 외래를 염료 함유 배지로 배양하면 유충에게 염료를 먹이는 것보다 훨씬 강력한 라벨링이 발생한다는 것이 밝혀졌습니다. 이 독특한 장점으로 인해 GFP 라벨링8에서는 거의 시각화되지 않은 초기 발달 단계에서 축삭을 이미지 할 수있었습니다.
타임랩스 이미징 외에도, explant 시스템은 다른 장점을 가지고 있습니다. 예를 들어, 특정 발달 시점에서 일방적으로 또는 양측으로 해부된 외래기로부터의 안테나 신경을 절단할 수 있다(단계 2.8). 이를 통해 연구자들은 뚜렷한 발달 단계에서 후각 회로의 모든 뉴런 유형을 타겟팅 할 때 ORN 축삭의 요구 사항을 조사 할 수 있습니다. 특히 전통적인 유전자 조작으로는 달성 할 수없는 일방적 인 안테나 신경 절단 분석은 ORN 축삭8의 정확한 대측성 표적화를 위해 양측 ORN 축삭 돌기 간의 상호 작용이 필요하다는 흥미로운 발견을 이끌어 냈습니다. 또한, 엑플랜트는 아가로스에 매립되는 대신 배지에서 직접 배양되므로 빠른 전달이 가능하고 일부 작은 분자 또는 약물을 씻어 낼 수 있습니다. 유전자 조작과 비교할 때, 약물 치료는 조작의 빠른 효과와 가역성의 장점을 가지고 있습니다. 이를 통해 연구원은 유전자 조작을 통한 구성 적 붕괴로 인한 세포 치사율 또는 건강에 해로운 문제를 우회하여 후기 발달 단계에서 세포에 대한 몇 가지 필수 과정을 평가할 수 있습니다. 또한 약물 치료 전후, 약물 세척 후를 비교하여 미묘한 변화를 시각화하는 데 도움이됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 N. Özel과 R. Hiesinger에게 explant 문화에 대한 조언에 감사드립니다. M. 이광자 현미경의 기술적 도움을 위한 바그너; D.J. 형질전환 파리를 생성하기 위한 루긴불; D. 피지 소프트웨어 분석의 제안에 대한 프리드만; Y. 비행 작업에 대한 지원을위한 Ge; C. McLaughlin과 K.K.L. Wong 은 원고에 대한 의견을 제시합니다. L.L.은 하워드 휴즈 의학 연구소 연구원입니다. 이 연구는 국립 보건원 보조금 1K99DC01883001 (T.L.) 및 R01-DC005982 (L.L.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
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