Summary
Questo protocollo descrive la procedura di dissezione, le condizioni di coltura e l'imaging dal vivo di un sistema di espianto antenna-cervello per lo studio dell'assemblaggio del circuito olfattivo.
Abstract
I neuroni sono precisamente interconnessi per formare circuiti essenziali per il corretto funzionamento del cervello. Il sistema olfattivo Drosophila fornisce un modello eccellente per studiare questo processo poiché 50 tipi di neuroni recettori olfattivi (ORN) dalle antenne e palpi mascellari proiettano i loro assoni a 50 glomeruli identificabili nel lobo antennale e formano connessioni sinaptiche con dendriti da 50 tipi di neuroni di proiezione del secondo ordine (PN). Studi precedenti si sono concentrati principalmente sull'identificazione di molecole importanti che regolano il targeting preciso nel circuito olfattivo utilizzando tessuti fissi. Qui, viene descritto un sistema di espianto antenna-cervello che ricapitola le principali pietre miliari dello sviluppo dell'assemblaggio del circuito olfattivo in coltura. Attraverso la dissezione della cuticola esterna e la pulizia di corpi adiposi opachi che coprono il cervello pupale in via di sviluppo, immagini di alta qualità di singoli neuroni da cervelli vivi possono essere raccolte utilizzando la microscopia a due fotoni. Ciò consente l'imaging time-lapse di un singolo assone ORN mirato da tessuto vivo. Questo approccio aiuterà a rivelare importanti contesti e funzioni biologiche cellulari di geni importanti precedentemente identificati e identificare i meccanismi alla base del processo dinamico di assemblaggio del circuito.
Introduction
I neuroni sono precisamente interconnessi per formare circuiti essenziali per il corretto funzionamento del cervello. Per oltre 100 anni, i neuroscienziati hanno cercato di capire come i neuriti si estendono verso i loro obiettivi intermedi e finali con estrema precisione. Di conseguenza, hanno identificato geni importanti che codificano segnali di guida per lo sviluppo di processi neuronali1. Il sistema olfattivo Drosophila fornisce un modello eccellente per indagare questo processo poiché i neuroni recettori olfattivi (ORN, i neuroni sensoriali primari) proiettano a 50 glomeruli identificabili con dimensioni, forma e posizione relativa stereotipate, dove formano connessioni sinaptiche con dendriti da 50 tipi di neuroni di proiezione (PN) di secondo ordine), ognuno dei quali invia dendriti a uno dei 50 glomeruli2 (Figura 1A ). Pertanto, è relativamente facile identificare fenotipi mutanti a risoluzione sinaptica (glomerulare) nel sistema olfattivo della mosca. Ciò ha portato alla scoperta di importanti geni che regolano l'assemblaggio del circuito olfattivo3.
L'assemblaggio del circuito olfattivo della mosca si basa su processi di sviluppo temporalmente e spazialmente coordinati3. ORN e PN acquisiscono destini cellulari distinti, che impostano il programma per le loro specificità di cablaggio. Successivamente, i dendriti PN prepatterano il lobo antennale (Figura 1B). Gli assoni degli ORN circumnavigano quindi il lobo antennale ipsilaterale e attraversano la linea mediana del cervello per raggiungere il lobo antennale controlaterale. Successivamente, gli assoni ORN invadono sia i lobi antennali ipsi- che controlaterali e formano sinapsi con dendriti dei loro PT partner in glomeruli specifici. Questo modello grossolano per l'assemblaggio di circuiti olfattivi è stato proposto sulla base della caratterizzazione di campioni fissi da punti temporali intermedi durante lo sviluppo. La scarsa risoluzione temporale e l'incapacità di seguire gli stessi processi neuronali attraverso lo sviluppo da tessuto fisso limitano la comprensione meccanicistica del processo di assemblaggio del circuito.
È tecnicamente difficile vivere i processi ORN e PN in vivo poiché il processo di cablaggio avviene nella prima metà dello stadio pupale quando il lobo antennale è circondato da un corpo grasso opaco all'interno della custodia pupale. È quindi impossibile visualizzare direttamente il circuito olfattivo in via di sviluppo da pupe intatte. I tessuti sezionati coltivati ex vivo possono aggirare l'opacità tissutale e sono stati utilizzati con successo per studiare lo sviluppo neurale 4,5,6. La sfida di utilizzare una simile strategia di coltura di espianto ex vivo per studiare il cablaggio neuronale nel cervello pupale è se ricapitola il targeting preciso del neurone in una condizione di coltura. Sulla base di una condizione di coltura ex vivo precedentemente riportata per il complesso occhio-cervello della mosca7, è stato recentemente sviluppato un espianto che contiene intatto l'intero cervello pupale, le antenne e i nervi antennali di collegamento, che mantiene un targeting preciso del circuito olfattivo e può essere sottoposto a imaging dal vivo basato su microscopia a due fotoni per un massimo di 24 ore alla frequenza di ogni 20 min8 . Qui viene descritto un protocollo dettagliato della coltura e dell'imaging di espianto. Il sistema di espianto fornisce un metodo potente per studiare l'assemblaggio del circuito olfattivo e potenzialmente altri circuiti nel cervello centrale.
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Protocol
1. Preparazione dei reagenti
NOTA: Tutte le fasi di questo protocollo vengono eseguite a temperatura ambiente (20-25 °C) se non diversamente specificato.
- Per preparare il piatto di coltura per immobilizzare l'espianto durante l'imaging time lapse, posare Sylgard di 0,5 cm di spessore (mescolare accuratamente due componenti liquidi con un rapporto 10: 1 prima dell'uso) sulla superficie inferiore di una capsula di Petri da 60 mm x 15 mm e lasciarla polimerizzare per 48 ore a temperatura ambiente (Figura 2A, denominata piastra Sylgard nel testo seguente).
- Per preparare micro pin per immobilizzare l'espianto su questa piastra, utilizzare un paio di pin per incollare più micro pin su un nastro con le estremità affilate allineate su un lato (Figura 2B). Utilizzare un paio di forbici per tagliare ~ 2 mm dalle estremità affilate dei micro perni (Figura 2B '). Utilizzare una pinza per tenere i micro perni tagliati e inserirli nello strato Sylgard di una piastra Sylgard prefabbricata (Figura 2C). Due micro pin vengono utilizzati per immobilizzare un espianto.
- Utilizzare un pennello per raccogliere pupe bianche, che formano puparium entro 1 ora, di hsFLP, ciottolato-GAL4/+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 genotipo e trasferirli in nuove fiale. Shock termico a bagnomaria a 37 °C per 40 minuti per indurre cloni ORN sparsi da tipi casuali. Dopo lo shock termico, mettere i flaconcini a 25 °C per 30 ore, con conseguente invecchiamento delle pupe a 30 ore dopo la formazione del pupario (APF).
- Per preparare il terreno di coltura per l'espianto, aggiungere 5 ml di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL) a 500 ml di Drosophila Medium di Schneider. Filtrare il mezzo e fare aliquote da 45 mL in tubi conici da 50 mL. Il mezzo può essere conservato a 4 °C per 1-2 mesi.
- Il giorno dell'imaging, prelevare un tubo da 45 mL di Drosophila medium di Schneider e aggiungere 5 mL di siero bovino fetale (10% v/v), 125 μL di soluzione madre di insulina umana da 4 mg/mL (concentrazione finale di 10 μg/mL), 50 μL di 1 mg/mL di soluzione madre di 20-idrossiecdisone disciolta in etanolo (concentrazione finale di 1 μg/mL). Mescolare bene e trasferire 15 mL di mezzo pieno in un nuovo tubo conico da 50 mL. Il resto del mezzo completo può essere conservato a 4 °C per una settimana. Il siero bovino fetale, la soluzione madre di insulina umana e la soluzione madre di 20-idrossiecdisone vengono aliquotati e conservati a -20 °C.
- Ossigenare il mezzo pieno da 15 mL pompando bolle di ossigeno da una bombola di ossigeno sotto la superficie del liquido attraverso una punta di pipetta sterile da 5 mL alla velocità di una bolla / e per 20-30 minuti. Utilizzare un film di paraffina per coprire l'apertura del tubo durante questo processo.
- Sterilizzare la superficie del pozzo di dissezione e la piastra Sylgard (con micro perni inseriti sullo strato Sylgard, preparati nei passaggi A1 e A2) con il 70% di etanolo. Lasciarli asciugare prima dell'uso.
2. Dissezione dell'impianto
- Utilizzare un pennello per trasferire 30 ore di APF (30 ore dopo la formazione della puparium) pupe su un fazzoletto di carta e asciugare la superficie esterna delle pupe per 5 minuti.
- Metti un pezzo di nastro biadesivo su una diapositiva di vetro. Attaccare con cura le pupe essiccate sulla superficie appiccicosa del nastro con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Premere delicatamente le pupe con un pennello per aiutare il lato ventrale delle pupe ad attaccarsi bene al nastro (Figura 3A). Non danneggiare la pupa.
- Utilizzare un paio di pinze per rimuovere la custodia pupale marrone che copre il lato dorsale della testa (Figura 3A, B). Inserire una punta affilata della pinza tra la cassa pupale marrone e la pupa dal lato laterale e rompere con cura la cassa pupale marrone attraverso una linea fino all'estremità posteriore della pupa (Figura 3B, C). Apri la custodia pupale marrone. Utilizzare un paio di pinze per tenere delicatamente la pupa e trasferirla al pozzo di dissezione con 1 mL di mezzo pieno ossigenato. Immergere la pupa galleggiante sulla superficie media per aiutarla ad affondare sul fondo del pozzo (Figura 3D).
NOTA: Non inserire la punta della pinza troppo in profondità all'interno della custodia pupale marrone per evitare di ferire la pupa con la pinza. - Per sezionare l'espianto antenna-cervello dalla pupa, utilizzare una pinza per tenere delicatamente la pupa con una mano e utilizzare un paio di microscissori per tagliare un piccolo foro dal lato posteriore della pupa con l'altra mano (Figura 3E). Questo piccolo foro rilascia l'alta pressione all'interno della pupa.
- Tagliare la linea mediana ventrale della pupa dal foro fino al collo (la struttura stretta che collega la testa e il torace) con i microscissori (Figura 3F). Quindi, tagliare la circonferenza del collo per staccare la testa dal corpo della pupa (Figura 3G). Rimuovere il corpo e metterlo in un pozzo diverso.
NOTA: Non tagliare il collo direttamente dal lato dorsale/ventrale della pupa, che potrebbe spremere il cervello. - Tagliare la cuticola trasparente che copre il lato dorsale del cervello (Figura 3H). Questo esporrà il corpo grasso sulla parte superiore del cervello. Tenere una cuticola a cui si attaccano la retina e le antenne. Ripeti la stessa procedura sul lato ventrale del cervello.
NOTA: Non inserire la lama delle forbici troppo in profondità sotto la cuticola in quanto ciò causerà il taglio dei nervi antennali che collegano le antenne e il cervello (Figura 3H'). - Utilizzare una pipetta P10 per lavare delicatamente il corpo grasso che copre il cervello e le antenne pipettando il mezzo verso le regioni aperte sui lati dorsale e ventrale della testa (Figura 3I).
NOTA: Sii molto delicato quando tubi il mezzo poiché il cervello può essere facilmente staccato dalla cuticola. Assicurati che tutto il corpo grasso venga rimosso durante questo passaggio. Lo sviluppo arrestato di assoni ORN è stato osservato quando il corpo grasso non è stato pulito bene, probabilmente a causa dello scarso accesso all'ossigeno dal mezzo. - Per studiare l'interazione degli assoni ORN bilaterali o degli assoni ORN con il targeting della dendrite PN, recidere uno o due nervi antennali con i microscissori durante questa fase8 (Figura 3J). Posizionare con attenzione le lame delle forbici tra la cuticola e il cervello e tagliare i nervi antennali interessati.
- Per trasferire l'espianto sezionato sulla piastra Sylgard, posizionare una goccia di mezzo pieno ossigenato (~ 200 μL) sulla superficie di Sylgard. Rivestire la superficie interna di una punta di pipetta a punta larga 200 μL con il corpo grasso dal tronco sezionato (passaggio 1.6) pipettando più volte il corpo grasso, il che impedisce agli espianti di attaccare la punta della pipetta durante il trasferimento. Quindi, utilizzare questa punta della pipetta a punta larga per trasferire l'espianto dal pozzo di dissezione alla goccia media sulla piastra di coltura (Figura 3K).
- Utilizzare una pinza per fissare l'espianto sullo strato sylgard nei due lobi ottici (Figura 3L). Posizionare con attenzione la piastra Sylgard sulla stazione di imaging e immobilizzare la piastra con dei nastri. Aggiungere lentamente 10 mL di mezzo pieno ossigenato alla piastra Sylgard utilizzando la pipetta P1000.
NOTA: Evitare di interrompere l'espianto quando si aggiunge il mezzo alla piastra Sylgard.
3. Imaging dal vivo basato sulla microscopia a due fotoni
- Per eseguire l'imaging time-lapse, utilizzare un microscopio a due fotoni, un laser Ti:Sapphire, un obiettivo ad immersione in acqua 20x (1,0 NA) e un software di imaging. Utilizzare la lunghezza d'onda di eccitazione a 920 nm per l'imaging delle proteine GFP. Regolare il tempo di permanenza dei pixel a 10 μs.
- Regolare la posizione della stazione di imaging in modo che gli espianti siano approssimativamente al di sotto dell'obiettivo. Utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare la lente prima dell'imaging. Abbassare lentamente l'obiettivo sotto il mezzo vicino agli espianti. Controlla se c'è qualche bolla sulla lente dell'obiettivo.
- In tal caso, sollevare l'obiettivo sopra il mezzo e ripetere fino a quando la bolla non è sparita. Trova gli espianti usando l'oculare e centra un espianto sul campo.
- Per garantire un espianto con pochi ORN scarsamente etichettati per l'imaging time lapse, sezionare ~ 10 espianti ogni volta e allineare sull'asse y sulla piastra di coltura. Esaminare tutti gli espianti spostando l'obiettivo lungo l'asse y e scegliere un espianto in cui alcuni singoli assoni ORN hanno appena raggiunto il lobo antennale per l'imaging (Figura 4A).
- Riconosci il lobo antennale dalla sua forma ovale e dagli assoni ORN che stanno iniziando a circumnavigarlo. Immagine di un'area ~ 150 μm x 150 μm nel piano xy (zoom 3x con l'obiettivo 20x). Stimare il confine dei due lobi antennali e centrarli nell'area di imaging.
- Selezionare un'area di imaging iniziale lungo l'asse z definendo la sezione inferiore e la sezione superiore della scansione. Impostare l'area di imaging lungo l'asse z. Impostare la sezione più profonda con segnali assonali ORN come prima sessione di imaging e la sessione 100 μm sopra (lato più superficiale) come ultima sessione di imaging (Figura 4B).
NOTA: Questo lascia alcune sezioni sulla parte superiore (lato superficiale) degli assoni ORN ed evita lo spostamento degli assoni ORN verso l'alto al di fuori dell'area di imaging a causa della crescita del cervello durante la coltura.- Immagine a intervalli di 2 μm. Imposta la scansione automatica delle immagini alla frequenza di ogni 20 minuti utilizzando il software di imaging.
- Spostare la regione di imaging di 20 μm verso l'alto lungo l'asse z dopo la prima imaging di 4 ore e altri 20 μm verso l'alto lungo l'asse z dopo l'imaging di 16 ore. Ciò può essere ottenuto impostando uno script e diversi stack z nel software di imaging.
- Coltivare l'espianto per un ulteriore periodo dopo l'imaging (fino a 24 ore ex vivo) prima della fissazione e della colorazione con N-caderina, un marcatore neuropil, per rivelare l'identità genetica di ogni singolo ORN dal glomerulo a cui si rivolge.
4. Elaborazione delle immagini
- Per elaborare le immagini z stack da serie di sezioni scattate in ogni punto temporale utilizzando il software Fiji, aprire la serie di sezioni di immagini, fare clic su Immagine | Stack | Progetto Z [/].
- Per correggere la deriva laterale del campione durante la coltura, installare TurboReg Plugin nelle Figi.
- Aprire una serie di immagini dello stack z e una singola immagine dello stack z della serie. Apri plugin | | di registrazione TurboReg.
- Selezionare la serie di immagini dello stack z in Source e l'immagine dello stack z singolo in Target | Traduzione. Fare clic sul pulsante Batch per registrare tutte le immagini della serie di immagini z stack aperta.
- Per massimizzare l'utilità dei campioni ripresi, separare i singoli assoni scarsamente etichettati nelle vicinanze l'uno all'altro dalle immagini dello stack z seguendo le sezioni di immagini 3D.
- Per estrarre singoli assoni ORN da alcuni assoni nella stessa immagine, apri la serie di sezioni immagine, fai clic su Plugin | segmentazione | Editor di segmentazione [/]. Selezionare lo strumento pennello e mascherare l'assone ORN interessato nella finestra di lavoro dell'Editor di segmentazione utilizzando i pulsanti Seleziona "+" o "-" in ogni sezione dell'immagine.
- Fare clic su | processo Calcolatore di immagini [/]. Selezionare "Immagine X" nell'Immagine 1, "Moltiplica" in Operazione, "Immagine X. etichette" nell'Immagine 2, [/]. Questo genera un nuovo file di serie di immagini con solo l'assone interessato. Eseguire il passaggio 4.1 per elaborare l'immagine dello stack z. Ripetere questo passaggio per tutti i punti temporali per generare un file di immagine serie temporali.
- Per pseudocolorare assoni diversi dalla stessa immagine, eseguire innanzitutto il passaggio 4.3 per generare separatamente il file di immagine della serie temporale di ciascun assone. Aprire i file di immagine della serie temporale per diversi assoni singoli dalla stessa immagine di dati non elaborati. Clicca su Immagine | | colore Unisci canali. Selezionare diversi file di immagine di serie temporali in diversi canali di colore e fare clic su OK.
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Representative Results
Gli assoni ORN arrivano al lobo antennale tra 18 h e 36 h APF. Quindi navigano nel lobo dell'antenna, attraversano la linea mediana e innervano i glomeruli. Il video 1 è un video rappresentativo che mostra l'intero processo per diversi assoni identificabili individualmente, preso alla frequenza di ogni 20 minuti per 24 ore. Prima della registrazione con TurboReg, gli assoni mostrano una deriva laterale mentre il cervello si sviluppa (prima metà del video). Dopo la registrazione, la deriva viene corretta (seconda metà del video).
Per separare alcuni assoni ORN dallo stesso espianto, un esempio è mostrato nella Figura 5. Seguendo la procedura di cui al passaggio 4.3, gli assoni VA1d e VA1v dall'espianto mostrato nella Figura 5A sono stati estratti per generare una nuova immagine dello stack z con solo questi due assoni (Figura 5B). Allo stesso modo, sono stati estratti gli assoni VM2 e VM3 (Figura 5B') e l'assone DL2 (Figura 5B''). La Figura 5C mostra una fusione di immagini nella Figura 5B-B'' con pseudocolori. Le identità genetiche di ciascun assone ORN sono state rivelate dall'immunocolorazione di un marcatore neuropil N-caderina dell'espianto fisso (Figura 5D,E).
Figura 1: Struttura del circuito olfattivo della mosca. (A) Una testa di mosca adulta è mostrata con un ORN dalle antenne di destra (verde) che invia il suo assone a entrambi i lobi antennali (AL) nel cervello e forma una connessione sinaptica in uno specifico glomerulo con dendriti di PN (rosso) negli OL omolaterali e controlaterali. La linea verticale tratteggiata indica la linea mediana in questo e nei diagrammi e nelle immagini successivi. (B) Schema che mostra lo sviluppo del circuito olfattivo. (1) I dendriti PN innervano prima una regione nel lobo antennale (rosso). Gli assoni ORN raggiungono i lobi antennali nel cervello. (2) Gli assoni ORN prendono una traiettoria dorsolaterale (verde) o ventromediale (blu) per circumnavigare il lobo antennale. (3) Gli assoni ORN attraversano la linea mediana. (4) Gli assoni ORN innervano glomeruli nel lobo antennale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione della camera di imaging per l'espianto. (A) Posare uno strato di elastomero siliconico (~0,5 cm) sul fondo di una capsula di Petri da 60 mm. (B-B') Allineare i perni su un nastro e tagliare a ~ 2 mm di lunghezza usando un paio di forbici. (C) Fissare i micro perni sullo strato di elastomero siliconico della piastra di coltura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La procedura di dissezione per l'espianto antennae-cervello. (A) Attaccare il lato ventrale di una pupa essiccata con carta velina su un nastro biadesivo su un vetrino. (B-C) Usa una pinza per tagliare la cuticola marrone esterna per esporre la pupa all'interno. (D) Trasferire la pupa in un pozzo di dissezione con mezzo pieno ossigenato. (E-G) Separare con cura il tronco pupale dalla testa usando microscissori. (H) Tagliare i pezzi di cuticola semitrasparente che copre i lati dorsale e ventrale del cervello. Mantenere una cuticola sui lati anteriore e laterale del cervello per mantenere le connessioni tra la retina, le antenne e il cervello. (H.) Evitare di tagliare il nervo antennale durante questo passaggio. (I) Pulire il corpo grasso che copre il cervello tubando delicatamente. (J) Tagliare uno o due nervi antennali usando microscissori in alcuni esperimenti. K) Posizionare una goccia di terreno pieno ossigenato sulla superficie della piastra di coltura. Trasferire l'impianto sezionato utilizzando una punta pipetta a punta larga. (L) Utilizzare una pinza per fissare i due lobi ottici dell'espianto sullo strato di elastomero siliconico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging time-lapse di un singolo assone ORN mirato da un espianto. (A) Selezionare un espianto con alcuni assoni ORN che raggiungono appena il lobo antennale. Stimare la forma di due lobi antennali dalla curvatura degli assoni e centrare i lobi antennali nel campo di imaging. (B) Impostare la regione di imaging lungo l'asse z. Considera che il lobo antennale si sposterà verso l'alto man mano che il cervello cresce e si sviluppa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Estrarre singoli RN e rivelare le loro identità glomerulari. (A) Un'immagine di proiezione massima di un espianto con 5-10 assoni ORN singoli utilizzando la microscopia a due fotoni con obiettivo 20x e zoom 3x. (B-B'') 1-2 assoni singoli vengono estratti da (A) creando manualmente maschere in sezioni di immagine dai dati dell'immagine grezza. (C) Unire le immagini di (B-B'') con ogni assone pseudo-colorato in modo diverso. (D-D') Massima proiezione di immagini confocali scattate con obiettivo 40x e zoom 1,5x. L'espianto mostrato in (A) è stato fissato seguito da colorazione con anti-GFP e anti-N-caderina (marcatore neuropil). Le metà anteriore e posteriore dei lobi antennali sono pile separatamente in (D) e (D'). (E) La mappa del lobo antennale mostra gli assoni ORN estratti in (B,C). Alcune immagini mostrate in questa figura sono modificate da uno studio precedente8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Le immagini time-lapse basate sulla microscopia a due fotoni mostrano il targeting di due assoni ORN, prima e dopo la registrazione dell'immagine. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
L'espianto cervello delle antenne della Drosophila mantiene il normale targeting del circuito olfattivo. Abbiamo notato che lo sviluppo è 2 volte più lento ex vivo rispetto a in vivo. Si noti che il sistema di espianto non mantiene il palpo mascellare, che ospita sei tipi di ORN. Per garantire che lo sviluppo normale sia ricapitolato ex vivo, è necessario evitare lo stiramento dei nervi antennali durante la dissezione dell'impianto. Durante la coltura ex vivo la crescita batterica di solito provoca lo sviluppo arrestato del circuito olfattivo. Pertanto, è importante una sterilizzazione accurata del piatto di coltura e dei perni prima dell'imaging e mantenere la sala di imaging pulita e isolata.
Questo espianto supporta l'imaging time-lapse a lungo termine basato sulla microscopia a due fotoni. In combinazione con un reporter di nuova concezione per l'etichettatura sparsa di singoli ORN, il sistema di espianto consente l'imaging ad alta risoluzione dal terminale del singolo assone. Questo sistema è potente per studiare i meccanismi biologici cellulari alla base del processo dinamico di assemblaggio del circuito olfattivo8. Sebbene lo sviluppo del circuito olfattivo sia stato mostrato qui come esempio, questo sistema può potenzialmente essere esteso a studi di altri circuiti o altri processi di sviluppo nel cervello centrale in via di sviluppo.
L'espianto mantiene il normale sviluppo in coltura per almeno 24 ore, che può catturare l'intero processo di targeting ORN. Consente ai ricercatori di rivelare l'identità genetica dei singoli assoni ORN attraverso la contro-colorazione con un marcatore neuropil post fissazione, poiché il lobo antennale sviluppa già un'evidente struttura glomerulare entro la fine della coltura. Questa strategia aggira il problema della mancanza di driver genetici specifici per molti tipi di ORN in una fase iniziale di sviluppo per ottenere l'imaging di specifici tipi di ORN utilizzando un driver pan-ORN.
Per ottenere una risoluzione spaziotemporale più elevata, questo sistema di espianto può essere ripreso utilizzando la microscopia più avanzata, la microscopia adattiva ottica-reticolo a foglio luminoso (AO-LLSM). È stato dimostrato che l'AO-LLSM consente la visualizzazione di strutture fini di terminali assonali e la frequenza di scansione ogni 30 secondi per volume 8,9,10,11. Un vantaggio dell'espianto è la sua compatibilità con l'etichettatura janelia fluorophore dye 12,13,14 incubando l'espianto che esprime Halo-tag in specifici neuroni con coloranti nel mezzo prima dell'imaging. Si è notato che l'incubazione dell'espianto con un mezzo contenente colorante si traduce in un'etichettatura molto più forte rispetto all'alimentazione delle larve con il colorante. Questo vantaggio unico ci ha permesso di visualizzare gli assoni in una fase iniziale di sviluppo che è stata difficilmente visualizzata dall'etichettatura GFP8.
Oltre all'imaging time-lapse, il sistema di espianto presenta altri vantaggi. Ad esempio, è possibile separare i nervi antennali dall'espianto sezionato unilateralmente o bilateralmente in specifici punti temporali dello sviluppo (passo 2.8). Ciò consente ai ricercatori di sondare il requisito degli assoni ORN nel targeting di qualsiasi tipo di neurone nel circuito olfattivo in fasi di sviluppo distinte. In particolare, i saggi unilaterali di taglio del nervo antennale, che non possono essere ottenuti con la manipolazione genetica tradizionale, hanno portato a un'interessante scoperta che l'interazione tra assoni ORN bilaterali è necessaria per il corretto targeting controlaterale degli assoni ORN8. Inoltre, l'espianto viene coltivato direttamente in mezzo invece di essere incorporato nell'agarosio, consentendo quindi una consegna rapida e il lavaggio di alcune piccole molecole o farmaci. Rispetto alla manipolazione genetica, il trattamento farmacologico ha i vantaggi di un effetto rapido e della reversibilità della manipolazione. Consente ai ricercatori di valutare alcuni processi essenziali per le cellule nelle fasi successive dello sviluppo bypassando la letalità cellulare o problemi malsani dovuti all'interruzione costitutiva attraverso manipolazioni genetiche. Aiuta anche la visualizzazione di sottili cambiamenti confrontando prima e dopo il trattamento farmacologico e dopo il lavaggio della droga.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo N. Özel e R. Hiesinger per i loro consigli sulla cultura dell'espianto; M. Wagner per l'aiuto tecnico della microscopia a due fotoni; D.J. Luginbuhl per la generazione di mosche transgeniche; D. Friedmann per suggerimenti di analisi del software Fiji; Y. Ge per l'assistenza sul lavoro di volo; C. McLaughlin e K.K.L. Wong per i commenti sul manoscritto. L.L. è un ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health 1K99DC01883001 (a T.L.) e R01-DC005982 (a L.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
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