Questo protocollo descrive la procedura di dissezione, le condizioni di coltura e l'imaging dal vivo di un sistema di espianto antenna-cervello per lo studio dell'assemblaggio del circuito olfattivo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un sistema di espianto per studi di imaging time-lapse dell'assemblaggio di circuiti olfattivi in Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
I neuroni sono precisamente interconnessi per formare circuiti essenziali per il corretto funzionamento del cervello. Il sistema olfattivo Drosophila fornisce un modello eccellente per studiare questo processo poiché 50 tipi di neuroni recettori olfattivi (ORN) dalle antenne e palpi mascellari proiettano i loro assoni a 50 glomeruli identificabili nel lobo antennale e formano connessioni sinaptiche con dendriti da 50 tipi di neuroni di proiezione del secondo ordine (PN). Studi precedenti si sono concentrati principalmente sull'identificazione di molecole importanti che regolano il targeting preciso nel circuito olfattivo utilizzando tessuti fissi. Qui, viene descritto un sistema di espianto antenna-cervello che ricapitola le principali pietre miliari dello sviluppo dell'assemblaggio del circuito olfattivo in coltura. Attraverso la dissezione della cuticola esterna e la pulizia di corpi adiposi opachi che coprono il cervello pupale in via di sviluppo, immagini di alta qualità di singoli neuroni da cervelli vivi possono essere raccolte utilizzando la microscopia a due fotoni. Ciò consente l'imaging time-lapse di un singolo assone ORN mirato da tessuto vivo. Questo approccio aiuterà a rivelare importanti contesti e funzioni biologiche cellulari di geni importanti precedentemente identificati e identificare i meccanismi alla base del processo dinamico di assemblaggio del circuito.
Introduzione
I neuroni sono precisamente interconnessi per formare circuiti essenziali per il corretto funzionamento del cervello. Per oltre 100 anni, i neuroscienziati hanno cercato di capire come i neuriti si estendono verso i loro obiettivi intermedi e finali con estrema precisione. Di conseguenza, hanno identificato geni importanti che codificano segnali di guida per lo sviluppo di processi neuronali1. Il sistema olfattivo Drosophila fornisce un modello eccellente per indagare questo processo poiché i neuroni recettori olfattivi (ORN, i neuroni sensoriali primari) proiettano a 50 glomeruli identificabili con dimensioni, forma e posizione relati....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
NOTA: Tutte le fasi di questo protocollo vengono eseguite a temperatura ambiente (20-25 °C) se non diversamente specificato.
- Per preparare il piatto di coltura per immobilizzare l'espianto durante l'imaging time lapse, posare Sylgard di 0,5 cm di spessore (mescolare accuratamente due componenti liquidi con un rapporto 10: 1 prima dell'uso) sulla superficie inferiore di una capsula di Petri da 60 mm x 15 mm e lasciarla polimerizzare per 48 ore a temperatura ambiente (Figura 2A, denominata piastra Sylgard nel testo seguente).
- Per preparare micro pi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Gli assoni ORN arrivano al lobo antennale tra 18 h e 36 h APF. Quindi navigano nel lobo dell'antenna, attraversano la linea mediana e innervano i glomeruli. Il video 1 è un video rappresentativo che mostra l'intero processo per diversi assoni identificabili individualmente, preso alla frequenza di ogni 20 minuti per 24 ore. Prima della registrazione con TurboReg, gli assoni mostrano una deriva laterale mentre il cervello si sviluppa (prima metà del video). Dopo la registrazione, la deriva viene corretta .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'espianto cervello delle antenne della Drosophila mantiene il normale targeting del circuito olfattivo. Abbiamo notato che lo sviluppo è 2 volte più lento ex vivo rispetto a in vivo. Si noti che il sistema di espianto non mantiene il palpo mascellare, che ospita sei tipi di ORN. Per garantire che lo sviluppo normale sia ricapitolato ex vivo, è necessario evitare lo stiramento dei nervi antennali durante la dissezione dell'impianto. Durante la coltura ex vivo la crescita batte.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo N. Özel e R. Hiesinger per i loro consigli sulla cultura dell'espianto; M. Wagner per l'aiuto tecnico della microscopia a due fotoni; D.J. Luginbuhl per la generazione di mosche transgeniche; D. Friedmann per suggerimenti di analisi del software Fiji; Y. Ge per l'assistenza sul lavoro di volo; C. McLaughlin e K.K.L. Wong per i commenti sul manoscritto. L.L. è un ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health 1K99DC01883001 (a T.L.) e R01-DC005982 (a L.L.).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 20-idrossiecdisone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | MRU coerente | X1 | |
| Siero bovino fetale | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Insulina umana | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Software di imaging | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Bombola di ossigeno | Praxair | OX M-E | |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider' s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Elastomero siliconico | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Microscopia a due fotoni | Obiettivo Bruker | ||
| per immersione in acqua (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
Riferimenti
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neu....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
