Summary
Este protocolo descreve o procedimento de dissecção, condição cultural e imagem ao vivo de um sistema de explant antena-cérebro para o estudo do conjunto do circuito olfativo.
Abstract
~Os neurônios são precisamente interconectados para formar circuitos essenciais para a função adequada do cérebro. O sistema olfativo Drosophila fornece um excelente modelo para investigar esse processo, uma vez que 50 tipos de neurônios receptores olfativos (ORNs) das antenas e palpas maxilares projetam seus axônios a 50 glomeruli identificáveis no lobo antena e formam conexões sinápticas com dendritos de 50 tipos de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs). Estudos anteriores se concentraram principalmente na identificação de moléculas importantes que regulam o direcionamento preciso no circuito olfativo usando tecidos fixos. Aqui, um sistema de explant antennae-cérebro que recapitula os principais marcos de desenvolvimento da montagem do circuito olfativo na cultura é descrito. Através da dissecação da cutícula externa e limpeza de corpos de gordura opacos que cobrem o cérebro pupal em desenvolvimento, imagens de alta qualidade de neurônios únicos de cérebros vivos podem ser coletadas usando microscopia de dois fótons. Isso permite imagens de lapso de tempo de um único axônio ORN direcionado a partir de tecido vivo. Essa abordagem ajudará a revelar importantes contextos biológicos celulares e funções de genes importantes previamente identificados e identificar mecanismos que sustentam o processo dinâmico de montagem do circuito.
Introduction
Os neurônios são precisamente interligados para formar circuitos essenciais para a função adequada do cérebro. Por mais de 100 anos, os neurocientistas têm tentado entender como os neuritos se estendem em direção aos seus alvos intermediários e finais com extrema precisão. Como resultado, eles identificaram genes importantes que codificam pistas de orientação para o desenvolvimento de processos neuronais1. O sistema olfativo Drosophila fornece um excelente modelo para investigar esse processo desde os neurônios receptores olfativos (ORNs, os neurônios sensoriais primários) projetam-se para 50 glomeruli identificáveis com tamanho estereotipado, forma e posição relativa, onde formam conexões sinápticas com dendritos de 50 tipos de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs), cada um dos quais envia dendritos para um dos 50 glomeruli2 (Figura 1A ). Portanto, é relativamente fácil identificar fenótipos mutantes na resolução sináptica (glomerular) no sistema olfativo de mosca. Isso levou a descobertas de genes importantes que regulam o conjunto do circuito olfativo3.
A montagem do circuito olfativo da mosca conta com processos de desenvolvimento temporal eespacialmente coordenados 3. ORNs e PNs adquirem destinos celulares distintos, que configuram o programa para suas especificidades de fiação. Em seguida, dendritos PN pré-padrão do lóbulo antena (Figura 1B). Os axônios de ORNs então circunavegam o lobo antena ipsilateral e cruzam a linha média do cérebro para alcançar o lobo antena contralateral. Posteriormente, os axônios ORN invadem os lobos ipsi e contralateral das antenas e formam sinapses com dendritos de seus PNs parceiros em glomeruli específico. Este modelo grosseiro para montagem de circuito olfativo foi proposto com base na caracterização de amostras fixas a partir de pontos de tempo intermediários durante o desenvolvimento. A baixa resolução temporal e a incapacidade de seguir os mesmos processos neuronais através do desenvolvimento do tecido fixo limitam a compreensão mecanicista do processo de montagem do circuito.
É tecnicamente desafiador viver os processos orn e PN in vivo, uma vez que o processo de fiação ocorre na primeira metade da fase pupal quando o lobo antena é cercado por corpo de gordura opaco dentro da caixa pupal. É, portanto, impossível imaginar diretamente o circuito olfativo em desenvolvimento a partir de pupas intactas. Tecidos dissecados cultivados ex vivo podem contornar a opacidade tecidual e têm sido usados com sucesso para estudar o desenvolvimento neural 4,5,6. O desafio de usar uma estratégia de cultura ex vivo ex vivo semelhante para estudar a fiação neuronal no cérebro pupal é se ele recapitula o neurônio preciso direcionado em uma condição cultural. Com base em uma condição de cultura ex vivo relatada anteriormente para o complexo olho-cérebro7, uma explanta que contém todo o cérebro pupal, antenas e os nervos antenas de conexão intactos foi recentemente desenvolvido, que retém alvo preciso do circuito olfativo e pode ser submetido a imagens ao vivo baseadas em microscopia de dois fótons por até 24 h na frequência de cada 20 min8 . Aqui, um protocolo detalhado da cultura explant e imagem é descrito. O sistema de explant fornece um método poderoso para estudar a montagem de circuito olfativo e, potencialmente, outros circuitos no cérebro central.
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Protocol
1. Preparação de reagentes
NOTA: Todas as etapas deste protocolo são realizadas à temperatura ambiente (20-25 °C) a menos que explique o contrário.
- Para preparar a placa de cultura para imobilizar a explantização durante a imagem do lapso de tempo, coloque Sylgard de 0,5 cm de espessura (misture completamente dois componentes líquidos na proporção 10:1 antes do uso) na superfície inferior de uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm e deixe curar por 48 h à temperatura ambiente (Figura 2A, referida como placa de Sylgard no texto a seguir).
- Para preparar micro pinos para imobilizar a explanta nesta placa, use um par de fórceps para colocar vários micro pinos em uma fita com as extremidades afiadas alinhadas de um lado (Figura 2B). Use um par de tesouras para cortar ~2 mm das extremidades afiadas dos micro pinos (Figura 2B'). Use fórceps para segurar os micro pinos cortados e insira na camada Sylgard de uma placa Sylgard pré-fabricada (Figura 2C). Dois micro pinos são usados para imobilizar uma explanta.
- Use um pincel para coletar pupas brancas, que formam puparium dentro de 1 h, de hsFLP, pebbled-GAL4/+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 genótipo e transfira-os para novos frascos. Choque térmico no banho de água de 37 °C por 40 minutos para induzir clones orn esparsos de tipos aleatórios. Após o choque térmico, coloque os frascos a 25 °C por 30 h, resultando em pupas envelhecidas a 30 h após a formação de puparium (APF).
- Para preparar o meio de cultura para explant, adicione 5 mL de Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) a 500 mL De Drosophila Medium schneider. Filtre o meio e faça alíquotas de 45 mL em tubos cônicos de 50 mL. O meio pode ser armazenado a 4 °C por 1-2 meses.
- No dia da imagem, pegue um tubo de 45 mL do meio Drosophila de Schneider e adicione 5 mL de Soro Bovino Fetal (10% v/v), 125 μL de 4 mg/mL solução de estoque de insulina humana (10 μg/mL de concentração final), 50 μL de 1 mg/mL 20-hidroxiecdysone solução de estoque dissolvida em etanol (1 μg/mL concentração final). Misture bem e transfira 15 mL de meio completo em um novo tubo cônico de 50 mL. O resto do meio completo pode ser armazenado a 4 °C durante uma semana. O Soro Bovino Fetal, a solução de estoque de insulina humana e a solução de estoque de 20 hidroxyecdysona são aliquos e armazenados a -20 °C.
- Oxigene o meio completo de 15 mL bombeando bolhas de oxigênio de um cilindro de oxigênio sob a superfície líquida através de uma ponta de pipeta estéril de 5 mL à taxa de uma bolha/s por 20-30 min. Use um filme de parafina para cobrir a abertura do tubo durante este processo.
- Esterilize a superfície do poço de dissecção e a placa Sylgard (com micro pinos inseridos na camada Sylgard, preparados nas etapas A1 e A2) com 70% de etanol. Deixe-os secar antes de usar.
2. Dissecção de explanta
- Use uma escova para transferir pupae de 30 h APF (30 h após a formação do puparium) para um tecido de papel e seque a superfície externa da pupae por 5 min.
- Coloque um pedaço de fita dupla face em um slide de vidro. Conecte cuidadosamente a pupa seca na superfície pegajosa da fita com o lado dorsal voltado para cima. Pressione suavemente a pupa com um pincel para ajudar o lado ventral da pupae a prender bem a fita (Figura 3A). Não danifique a pupa.
- Use um par de fórceps para remover a caixa pupal marrom que cobre o lado dorsal da cabeça (Figura 3A,B). Insira uma ponta afiada das fórceps entre a caixa de pupal marrom e a pupa do lado lateral e quebre cuidadosamente a caixa de pupal marrom através de uma linha até a extremidade posterior da pupa (Figura 3B,C). Abra a caixa de pupal marrom. Use um par de fórceps para segurar suavemente a pupa e transferir para o poço de dissecção com 1 mL de meio completo oxigenado. Submergir pupa flutuante na superfície média para ajudá-la a afundar até o fundo do poço (Figura 3D).
NOTA: Não insira a ponta das fórceps muito profundamente dentro da caixa de pupal marrom para evitar ferir a pupa com as fórceps. - Para dissecar a explanta antena-cérebro da pupa, use fórceps para segurar suavemente a pupa com uma mão e use um par de microscisores para cortar um pequeno orifício do lado posterior da pupa com a outra mão (Figura 3E). Este pequeno buraco libera a alta pressão dentro da pupa.
- Corte através da linha média ventral da pupa do orifício até o pescoço (a estrutura estreita que conecta a cabeça e o tórax) com os microscisores (Figura 3F). Em seguida, corte a circunferência do pescoço para desprender a cabeça do corpo da pupa (Figura 3G). Remova o corpo e coloque-o em um poço diferente.
NOTA: Não corte o pescoço diretamente do lado dorsal/ventral da pupa, que pode espremer o cérebro. - Corte a cutícula transparente que cobre o lado dorsal do cérebro (Figura 3H). Isso vai expor o corpo gordo em cima do cérebro. Mantenha alguma cutícula à qual a retina e as antenas se prendem. Repita o mesmo procedimento no lado ventral do cérebro.
NOTA: Não insira a lâmina da tesoura muito profundamente sob a cutícula, pois isso causará o corte dos nervos antenas que ligam as antenas e o cérebro (Figura 3H'). - Use uma pipeta P10 para lavar suavemente o corpo de gordura que cobre o cérebro e as antenas, tubos do meio em direção às regiões abertas nas laterais dorsal e ventral da cabeça (Figura 3I).
NOTA: Seja muito gentil ao escoar o meio, pois o cérebro pode ser facilmente separado da cutícula. Certifique-se de que todo o corpo gordo seja removido durante esta etapa. O desenvolvimento preso de axônios ORN foi observado quando o corpo gordo não foi bem limpo, provavelmente devido ao baixo acesso ao oxigênio do meio. - Para estudar a interação de axônios orn bilaterais ou axônios ORN com alvos de dendrite PN, corte um ou dois nervos antenas com os microscisores durante esta fase8 (Figura 3J). Coloque cuidadosamente as lâminas da tesoura entre a cutícula e o cérebro e corte os nervos antenas interessados.
- Para transferir a explanta dissecada para a placa Sylgard, coloque uma gotícula de meio completo oxigenado (~200 μL) na superfície de Sylgard. Cubra a superfície interna de uma ponta de pipeta de ponta larga de 200 μL com o corpo de gordura do tronco dissecado (passo 1.6) ao escoar o corpo de gordura várias vezes, o que impede que as explantas grudem a ponta da pipeta durante a transferência. Em seguida, use esta ponta de pipeta de ponta larga para transferir a explanta da dissecação bem para a gota média na placa de cultura (Figura 3K).
- Use fórceps para fixar a explanta na camada Sylgard nos dois lóbulos ópticos (Figura 3L). Posicione cuidadosamente a placa Sylgard na estação de imagem e imobilize a placa com fitas. Adicione lentamente 10 mL de meio total oxigenado à placa Sylgard usando pipeta P1000.
NOTA: Evite interromper a explanta ao adicionar o meio à placa Sylgard.
3. Imagem ao vivo baseada em microscopia de dois fótons
- Para realizar imagens de lapso de tempo, use um microscópio de dois fótons, um laser Ti:Sapphire, um objetivo de imersão em água de 20x (1.0 NA) e um software de imagem. Use o comprimento de onda de excitação a 920 nm para imagens de proteínas GFP. Ajuste o tempo de moradia do pixel para 10 μs.
- Ajuste a posição da estação de imagem para que as explanagens estejam aproximadamente sob o objetivo. Use 70% de etanol para esterilizar a lente antes da imagem. Abaixe lentamente o objetivo sob o meio perto das explantas. Verifique se há alguma bolha na lente do objetivo.
- Se assim for, levante o objetivo acima do meio e repita isso até que a bolha se vá. Encontre as explantas usando a ocular e central uma explant no campo.
- Para garantir uma explanta com alguns ORNs pouco rotulados para imagens de lapso de tempo, disseque ~10 explantas cada vez e alinhe no eixo y na placa de cultura. Tela todas as explantas movendo o objetivo ao longo do eixo e escolha uma explanta na qual alguns axônios ORN únicos acabaram de chegar ao lóbulo de antenas para imagem (Figura 4A).
- Reconheça o lobo antena pela sua forma oval e os axônios ORN que estão começando a circunavegá-lo. Imagem de uma área de ~150 μm x 150 μm no plano xy (zoom de 3x com o objetivo de 20x). Estimar o limite dos dois lóbulos antenas e centralizar-nos na área de imagem.
- Selecione uma região de imagem inicial ao longo do eixo z definindo a seção inferior e a seção superior da digitalização. Configure área de imagem ao longo do eixo z. Defina a seção mais profunda com sinais de axônio ORN como a primeira sessão de imagem e a sessão 100 μm acima (lado mais superficial) como a última sessão de imagem (Figura 4B).
NOTA: Isso deixa algumas seções no topo (lado superficial) dos axônios ORN e evita a mudança de axônios ORN para cima fora da área de imagem devido ao crescimento do cérebro durante a cultura.- Imagem em intervalos de 2 μm. Defina a varredura automática de imagens na frequência de cada 20 minutos usando software de imagem.
- Deslocar a região de imagem 20 μm para cima ao longo do eixo z após a primeira imagem de 4h e outros 20 μm para cima ao longo do eixo z após 16 h de imagem. Isso pode ser conseguido definindo um script e diferentes pilhas z no software de imagem.
- Cultura a explante por um período adicional de imagem pós-imagem (até 24 h ex vivo) antes da fixação e coloração com N-cadherin, um marcador neuropil, para revelar a identidade genética de cada ORN pelo glomerulus a que ele visa.
4. Processamento de imagens
- Para processar z stack imagens de séries de seção tiradas em cada ponto de tempo usando o software Fiji, abra a série de seção de imagens, clique em Imagem | Pilhas | Projeto Z [/].
- Para corrigir a deriva lateral da amostra durante a cultura, instale o Plugin TurboReg em Fiji.
- Abra uma série de imagens de pilha z e uma única imagem de pilha z da série. | de plugins abertos | de inscrição O TurboReg.
- Selecione a série de imagens z stack na Fonte e a imagem de pilha de z única em Target | Tradução. Clique no botão Batch para registrar todas as imagens da série de imagens abertas da pilha z.
- Para maximizar a utilidade das amostras de imagem, separem axônios únicos pouco rotulados nas proximidades das imagens da pilha z seguindo seções de imagem 3D.
- Para extrair axônios ORN únicos de alguns axônios na mesma imagem, abra a série de seção de imagem, clique em Plugins | | de segmentação Editor de Segmentação [/]. Selecione a ferramenta de pincel e mascarar o axônio ORN interessado na janela de trabalho do Editor de Segmentação usando botões Select "+" ou "-" em cada seção de imagem.
- Clique em Process | Calculadora de imagens [/]. Selecione "Imagem X" na Imagem 1, "Multiplique" em Operação, "Imagem X. labels" na Imagem 2, [/]. Isso gera um novo arquivo de série de imagens apenas com o axônio interessado. Execute a etapa 4.1 para processar a imagem da pilha z. Repita esta etapa para todos os pontos de tempo para gerar um arquivo de imagem de série temporal.
- Para pseudocolorir diferentes axônios da mesma imagem, primeiro execute o passo 4.3 para gerar o arquivo de imagem da série temporal de cada axônio separadamente. Abra os arquivos de imagem da série temporal para diferentes axônios únicos da mesma imagem de dados brutos. Clique em Imagem | | de cor Mesclar canais. Selecione diferentes arquivos de imagem de séries temporizais em diferentes canais de cores e clique em OK.
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Representative Results
Os axônios ORN chegam ao lóbulo das antenas entre 18h e 36 h APF. Eles então navegam pelo lóbulo da antena, cruzam a linha média e inervam o glomeruli. Vídeo 1 é um vídeo representativo mostrando todo o processo para vários axônios individualmente identificáveis, tirados na frequência de cada 20 min por 24 h. Antes do registro usando o TurboReg, os axônios exibem alguns desvios laterais à medida que o cérebro se desenvolve (primeira metade do vídeo). Após o registro, a deriva é corrigida (segunda metade do vídeo).
Para separar alguns axônios ORN da mesma explanta, um exemplo é mostrado na Figura 5. Após o procedimento na etapa 4.3, os axônios VA1d e VA1v da explant mostrado na Figura 5A foram extraídos para gerar uma nova imagem de pilha z com apenas estes dois axônios (Figura 5B). Da mesma forma, foram extraídos axônios VM2 e VM3 (Figura 5B') e DL2 (Figura 5B'') extraídos. A Figura 5C mostra uma fusão de imagens na Figura 5B-B'' com pseudocolorir. As identidades genéticas de cada axônio orn foram reveladas pela imunostenção de um marcador neuropilino N-cadherin da explanta fixa (Figura 5D,E).
Figura 1: Estrutura do circuito olfativo de moscas. (A) Uma cabeça de mosca adulta é mostrada com um ORN da antena direita (verde) enviando seu axônio para ambos os lóbulos antenas (ALs) no cérebro e formando conexão sináptica em um glomerulus específico com dendritos de PNs (vermelho) nas ALs ipsilaterais e contralaterais. A linha vertical tracejada indica a linha média neste e subsequentes diagramas e imagens. (B) Diagrama mostrando o desenvolvimento do circuito olfativo. (1) Dendritos PN primeiro inerva uma região no lobo antenal (vermelho). Axônios ORN atingem os lóbulos antenas no cérebro. (2) Os axônios ORN tomam uma trajetória dorsolateral (verde) ou ventromedial (azul) para circunavegar o lóbulo da antena. (3) Axônios ORN cruzam a linha média. (4) Axônios ORN inervam glomeruli no lobo antena. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação da câmara de imagem para a explant. (A) Coloque uma camada de elastômero de silicone (~0,5 cm) na parte inferior de uma placa de Petri de 60 mm. (B-B') Alinhe os pinos em uma fita e corte para ~2 mm de comprimento usando um par de tesouras. (C) Fixar os micro pinos na camada de elastômero de silicone da placa de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O procedimento de dissecção para a explantação antena-cérebro. (A) Conecte o lado ventral de uma pupa seca de tecido de papel em uma fita de dupla face em um slide de vidro. (B-C) Use fórceps para cortar a cutícula marrom externa para expor a pupa no interior. (D) Transfira a pupa para um poço de dissecção com meio completo oxigenado. (E-G) Separe cuidadosamente o tronco pupal da cabeça usando microscissores. (H) Corte os pedaços de cutícula semitransparente que cobre os lados dorsal e ventral do cérebro. Mantenha alguma cutícula nos lados anterior e lateral do cérebro para reter conexões entre a retina, antenas e cérebro. (H') Evite cortar o nervo antena durante esta etapa. (I) Limpe o corpo de gordura que cobre o cérebro por tubos suavemente. (J) Corte um ou dois nervos antenas usando microscisores em certos experimentos. (K) Coloque uma gota de meio completo oxigenado na superfície da placa de cultura. Transfira a explanta dissecada usando uma ponta larga de pipeta. (L) Use fórceps para fixar os dois lóbulos ópticos da explanta na camada de elastômero de silicone. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem de lapso de tempo de um único axônio ORN visando a partir de uma explant. (A) Selecione uma explanta com alguns axônios ORN apenas atingindo o lóbulo da antena. Estime a forma de dois lóbulos antenas pela curvatura dos axônios e centralizar os lóbulos antenas no campo de imagem. (B) Coloque a região de imagem ao longo do eixo z. Considere que o lobo antena mudará para cima à medida que o cérebro cresce e se desenvolve. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Extrair ORNs individuais e revelar suas identidades glomerulares. (A) Uma imagem máxima de projeção de uma explanta com 5-10 axônios ORN únicos usando microscopia de dois fótons com objetivo de 20x e zoom de 3x. (B-B'') 1-2 axônios únicos são extraídos de (A) criando manualmente máscaras em seções de imagem a partir dos dados de imagem bruta. (C) Mescla as imagens de (B-B'') com cada axônio pseudocolorido de forma diferente. (D-D') Imagens confocal de projeção máxima tiradas com 40x objetivo e zoom de 1,5x. A explanta mostrada em (A) foi fixada seguida de coloração com anti-GFP e anti-N-cadherin (marcador neuropil). Metades anteriores e posteriores dos lóbulos antenas são pilhas separadamente em (D) e (D'). (E) Mapa do lóbulo de antena mostra axônios ORN extraídos em (B,C). Algumas imagens mostradas nesta figura são modificadas a partir de um estudo anterior8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Imagens baseadas em microscopia de dois fótons mostram o alvo de dois axônios ORN, antes e depois do registro da imagem. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
A explanta drosophila antennae-cérebro mantém o alvo normal do circuito olfativo. Notamos que o desenvolvimento é 2 vezes mais lento em relação ao in vivo. Nota-se que o sistema de explant não retém palp maxilar, que hospeda seis tipos de ORNs. Para garantir que o desenvolvimento normal seja recapitulado ex vivo, o alongamento dos nervos antenas precisa ser evitado durante a dissecação da explant. Durante a cultura ex vivo , o crescimento das bactérias geralmente causa o desenvolvimento preso do circuito olfativo. Por isso, é importante a esterilização minuciosa do prato de cultura e dos pinos antes da imagem e manter a sala de imagem limpa e isolada.
Esta explanta suporta imagens de lapso de tempo baseadas em microscopia de dois fótons a longo prazo. Combinado com um repórter recém-desenvolvido para rotulagem esparsa de ORNs únicos, o sistema de explant permite imagens de alta resolução a partir de um único termo de axônio. Este sistema é poderoso para estudar os mecanismos biológicos celulares que sustentam o processo dinâmico do conjunto do circuito olfativo8. Embora o desenvolvimento de circuitos olfativos tenha sido mostrado aqui como exemplo, este sistema pode potencialmente ser expandido para estudos de outros circuitos ou outros processos de desenvolvimento no cérebro central em desenvolvimento.
A explanta mantém o desenvolvimento normal da cultura por pelo menos 24 horas, o que pode capturar todo o processo de segmentação orn. Permite que os pesquisadores revelem a identidade genética de axônios orn únicos através da contra-coloração com um marcador neuropil marcador pós fixação, já que o lobo antena já desenvolve estrutura glomerular óbvia até o final da cultura. Essa estratégia contorna o problema da falta de drivers genéticos específicos para muitos tipos de ORN em um estágio de desenvolvimento inicial para alcançar imagens de tipos específicos de ORNs usando um driver pan-ORN.
Para obter maior resolução espástica, este sistema de explant pode ser imageado usando microscopia mais avançada, a microscopia de folha de luz adaptativa (AO-LLSM). Foi demonstrado que o AO-LLSM permite a visualização de estruturas finas de terminais de axônio e frequência de varredura a cada 30 segundos por volume 8,9,10,11. Uma vantagem da explanta é sua compatibilidade com janelia fluorophore corante 12,13,14 rotulagem incubando a explant expressando halo-tag em neurônios específicos com corantes no meio antes da imagem. Notou-se que a incubação da explanta com meio contendo corante resulta em rotulagem muito mais forte do que alimentar as larvas com o corante. Essa vantagem única nos permitiu visualizar axônios em um estágio de desenvolvimento inicial que dificilmente foi visualizado pela rotulagem GFP8.
Além da imagem de lapso de tempo, o sistema de explant tem outras vantagens. Por exemplo, é possível cortar os nervos das antenas da explanta dissecada unilateral ou bilateralmente em pontos de tempo específicos de desenvolvimento (etapa 2.8). Isso permite que os pesquisadores testem a exigência de axônios ORN na segmentação de quaisquer tipos de neurônios no circuito olfativo em passos distintos de desenvolvimento. Em particular, ensaios de corte de nervo antenas unilaterais, que não podem ser alcançados pela manipulação genética tradicional, levaram a uma interessante descoberta de que a interação entre axônios orn bilaterais é necessária para a correta segmentação contralateral dos axônios ORN8. Além disso, a explanta é cultivada diretamente em meio em vez de ser incorporada em agarose, permitindo assim a entrega rápida e lavagem de algumas pequenas moléculas ou drogas. Comparado com a manipulação genética, o tratamento medicamentoso tem as vantagens do efeito rápido e da reversibilidade da manipulação. Permite que os pesquisadores avaliem alguns processos essenciais para células em estágios posteriores de desenvolvimento, contornando a letalidade celular ou questões insalubres devido à interrupção constitutiva por meio de manipulações genéticas. Também ajuda a visualização de mudanças sutis, comparando antes e depois do tratamento medicamentoso, e após a lavagem de drogas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a N. Özel e R. Hiesinger por seus conselhos sobre a cultura explant; M. Wagner para ajuda técnica da microscopia de dois fótons; D.J. Luginbuhl para geração de moscas transgênicas; D. Friedmann para sugestões de análise de software fiji; Y. Ge para assistência no trabalho de mosca; C. McLaughlin e K.K.L. Wong para comentários sobre o manuscrito. L.L. é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde 1K99DC01883001 (para T.L.) e R01-DC005982 (para L.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
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