Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء التشريح وحالة الزرع والتصوير الحي لنظام إكسبلانت الهوائيات والدماغ لدراسة تجميع الدائرة الحامية الشمية.
Abstract
~ الخلايا العصبية مترابطة بدقة لتشكيل دوائر ضرورية للوظيفة المناسبة للدماغ. يوفر نظام ذبابة الفاكهة الشمية نموذجا ممتازا للتحقيق في هذه العملية نظرا لأن 50 نوعا من الخلايا العصبية للمستقبلات الشمية (ORNs) من الهوائيات والجس الفكي العلوي تعرض محاورها إلى 50 كبيبات محددة في فص الهوائي وتشكل اتصالات متشابكة مع التشعبات من 50 نوعا من الخلايا العصبية الإسقاط من الدرجة الثانية (PNs). ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على تحديد الجزيئات المهمة التي تنظم الاستهداف الدقيق في الدائرة الشمية باستخدام الأنسجة الثابتة. هنا ، يتم وصف نظام explant الهوائيات الدماغية الذي يلخص المعالم التنموية الرئيسية لتجميع الدوائر الشمية في الثقافة. من خلال تشريح البشرة الخارجية وتنظيف الأجسام الدهنية غير الشفافة التي تغطي دماغ العذراء النامي ، يمكن جمع صور عالية الجودة للخلايا العصبية المفردة من الأدمغة الحية باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. وهذا يسمح بالتصوير بفاصل زمني لاستهداف محور عصبي ORN واحد من الأنسجة الحية. سيساعد هذا النهج في الكشف عن السياقات والوظائف البيولوجية المهمة للخلايا للجينات المهمة التي تم تحديدها مسبقا وتحديد الآليات التي تدعم العملية الديناميكية لتجميع الدائرة.
Introduction
الخلايا العصبية مترابطة بدقة لتشكيل دوائر ضرورية للوظيفة المناسبة للدماغ. لأكثر من 100 عام، يحاول علماء الأعصاب فهم كيفية امتداد الخلايا العصبية نحو أهدافها المتوسطة والنهائية بدقة متناهية. ونتيجة لذلك ، حددوا جينات مهمة تشفر إشارات التوجيه لتطوير العمليات العصبية1. يوفر نظام ذبابة الفاكهة الشمية نموذجا ممتازا للتحقيق في هذه العملية منذ أن قامت الخلايا العصبية ذات المستقبلات الشمية (ORNs ، الخلايا العصبية الحسية الأولية) بمشروع إلى 50 كبيبات يمكن تحديدها ذات حجم وشكل وموضع نسبي نمطي ، حيث تشكل روابط متشابكة مع التشعبات من 50 نوعا من الخلايا العصبية الإسقاط من الدرجة الثانية (PNs) ، كل منها يرسل التشعبات إلى واحدة من 50 كبيبات2 (الشكل 1A ). لذلك ، من السهل نسبيا تحديد الأنماط الظاهرية المتحولة بدقة متشابكة (كبيبي) في نظام الشم الذبابة. أدى ذلك إلى اكتشاف جينات مهمة تنظم تجميع الدوائر الشمية3.
يعتمد تجميع الدائرة الشمية الذبابة على عمليات تنموية منسقة زمنيا ومكانيا3. تكتسب ORNs و PNs مصائر خلوية متميزة ، والتي تعد البرنامج لخصائص الأسلاك الخاصة بها. بعد ذلك ، تقوم التشعبات PN بنمط فص الهوائي مسبقا (الشكل 1B). ثم تدور محاور ORNs حول فص الهوائي الجانبي وتعبر خط الوسط للدماغ للوصول إلى فص الهوائي المقابل للجانبي. في وقت لاحق ، تغزو محاور ORN كلا من فصوص الهوائيات ipsi و contralateral وتشكل نقاط اشتباك عصبي مع تشعبات شريكها PNs في كبيبات محددة. تم اقتراح هذا النموذج الخشن لتجميع الدوائر الشمية بناء على توصيف العينات الثابتة من نقاط زمنية وسيطة أثناء التطوير. إن ضعف الدقة الزمنية وعدم القدرة على متابعة نفس العمليات العصبية عبر التطور من الأنسجة الثابتة يحد من الفهم الميكانيكي لعملية تجميع الدائرة.
من الصعب تقنيا أن تعيش عمليات ORN و PN للصور في الجسم الحي لأن عملية الأسلاك تحدث في النصف الأول من مرحلة العذراء عندما يكون الفص الهوائي محاطا بجسم دهني غير شفاف داخل علبة العذراء. لذلك ، من المستحيل تصوير الدائرة الشمية النامية مباشرة من الشرانق السليمة. يمكن للأنسجة المشوهة المستزرعة خارج الجسم الحي التحايل على عتامة الأنسجة وقد تم استخدامها بنجاح لدراسة التطور العصبي4،5،6. التحدي المتمثل في استخدام استراتيجية مماثلة لزراعة الخلايا خارج الجسم الحي لدراسة الأسلاك العصبية في دماغ العذراء هو ما إذا كانت تلخص استهداف الخلايا العصبية الدقيقة في حالة الثقافة. استنادا إلى حالة زراعة خارج الجسم الحي تم الإبلاغ عنها سابقا لمجمع العين والدماغ الذبابة7 ، تم مؤخرا تطوير إكسبلانت يحتوي على الدماغ العذراوي بأكمله والهوائيات والأعصاب الهوائية المتصلة سليمة ، والتي تحتفظ بالاستهداف الدقيق للدائرة الشمية ويمكن أن تخضع للتصوير الحي القائم على المجهر ثنائي الفوتون لمدة تصل إلى 24 ساعة على تردد كل 20 دقيقة8 . هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لثقافة explant والتصوير. يوفر نظام explant طريقة قوية لدراسة تجميع الدائرة الشمية والدوائر الأخرى المحتملة في الدماغ المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) ما لم يتم توضيح خلاف ذلك.
- لإعداد طبق الاستزراع لشل حركة الإكسبلانت أثناء التصوير بفاصل زمني ، ضع سيلغارد بسماكة 0.5 سم (امزج جيدا مكونين سائلين بنسبة 10: 1 قبل الاستخدام) على السطح السفلي لطبق بتري 60 مم × 15 مم واتركه يعالج لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2A ، المشار إليه باسم طبق Sylgard في النص التالي).
- لإعداد دبابيس صغيرة لتثبيت الإكسباس على هذه اللوحة، استخدم زوجا من الملقط للصق دبابيس صغيرة متعددة على شريط مع محاذاة النهايات الحادة على جانب واحد (الشكل 2B). استخدم زوجا من المقصات لقطع ~ 2 مم من الأطراف الحادة للدبابيس الدقيقة (الشكل 2B). استخدم الملقط لتثبيت الدبابيس الدقيقة المقطوعة وإدخالها في طبقة سيلغارد من لوحة سيلغارد مسبقة الصنع (الشكل 2C). يتم استخدام اثنين من المسامير الدقيقة لشل حركة explant واحد.
- استخدم فرشاة لجمع الشرانق البيضاء ، التي تشكل البوباريوم في غضون 1 ساعة ، من hsFLP ، مرصوفة بالحصى GAL4 / + ؛ UAS-FRT 100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 النمط الوراثي ونقلها إلى قوارير جديدة. صدمة حرارية في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لتحفيز استنساخ ORN المتناثر من الأنواع العشوائية. بعد الصدمة الحرارية ، ضع القوارير عند 25 درجة مئوية لمدة 30 ساعة ، مما أدى إلى ظهور شرانق تبلغ من العمر 30 ساعة بعد تكوين البوباريوم (APF).
- لتحضير وسط الاستزراع للإزباس، أضف 5 مل من البنسلين-ستربتومايسين (10000 يو/مل) إلى 500 مل من وسيط ذبابة الفاكهة من شنايدر. تصفية الوسط وجعل 45 مل aliquots في أنابيب مخروطية 50 مل. يمكن تخزين الوسط في 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أشهر.
- في يوم التصوير ، خذ أنبوبا واحدا من 45 مل من وسيط ذبابة الفاكهة من شنايدر وأضف 5 مل من مصل الأبقار الجنيني (10٪ v / v) ، 125 ميكرولتر من محلول مخزون الأنسولين البشري 4 mg / mL (التركيز النهائي 10 ميكروغرام / مل) ، 50 ميكرولتر من 1 ملغ / مل 20-هيدروكسي إيكديسون محلول الأسهم المذاب في الإيثانول (1 ميكروغرام / مل التركيز النهائي). اخلطي جيدا وانقلي 15 مل من الوسط الكامل إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. يمكن تخزين بقية الوسط الكامل عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع. يتم اقتباس مصل الجنين البقري ومحلول مخزون الأنسولين البشري ومحلول مخزون 20-hydroxyecdysone وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
- أكسجين الوسط الكامل 15 مل عن طريق ضخ فقاعات الأكسجين من أسطوانة الأكسجين تحت سطح السائل من خلال طرف ماصة معقمة 5 مل بمعدل فقاعة / فقاعة واحدة لمدة 20-30 دقيقة. استخدم فيلم بارافين لتغطية فتح الأنبوب أثناء هذه العملية.
- قم بتعقيم سطح بئر التشريح ولوحة سيلغارد (مع إدخال دبابيس صغيرة على طبقة سيلغارد ، محضرة في الخطوتين A1 و A2) مع 70٪ من الإيثانول. اتركها تجف قبل الاستخدام.
2. تشريح الزرع
- استخدم فرشاة لنقل الشرانق 30 ساعة APF (30 ساعة بعد تكوين البوباريوم) إلى منديل ورقي وتجفيف السطح الخارجي للشرانق لمدة 5 دقائق.
- ضع قطعة من الشريط على الوجهين على شريحة زجاجية. نعلق بعناية الشرانق المجففة على السطح اللزج للشريط مع الجانب الظهري المواجه لأعلى. اضغط بلطف على الشرانق بفرشاة لمساعدة الجانب البطني من الشرانق جيدا على الشريط (الشكل 3A). لا تتلف الخادرة.
- استخدم زوجا من الملقط لإزالة علبة العذراء البنية التي تغطي الجانب الظهري من الرأس (الشكل 3A ، B). أدخل طرفا حادا واحدا من الملقط بين علبة العذراء البنية والخادرة من الجانب الجانبي وكسر حالة العذراء البنية بعناية من خلال خط إلى الطرف الخلفي من الخادرة (الشكل 3B ، C). افتح علبة العذراء البنية. استخدم زوجا من الملقط لحمل الخادرة بلطف ونقلها إلى التشريح جيدا باستخدام 1 مل من الوسط الكامل المؤكسج. غمر الخادرة العائمة على السطح المتوسط لمساعدتها على الغرق في قاع البئر (الشكل 3D).
ملاحظة: لا تقم بإدخال طرف الملقط بعمق كبير داخل علبة العذراء البنية لمنع إصابة الخادرة بالملقط. - لتشريح الهوائيات الدماغية من الخادرة ، استخدم الملقط لحمل الخادرة بلطف بيد واحدة واستخدم زوجا من المقصات الدقيقة لقطع ثقب صغير من الجانب الخلفي من الخادرة باليد الأخرى (الشكل 3E). هذا الثقب الصغير يطلق الضغط العالي داخل الخادرة.
- قطع من خلال خط الوسط البطني للخادرة من الحفرة حتى الرقبة (الهيكل الضيق الذي يربط الرأس والصدر) مع المقص الدقيق (الشكل 3F). ثم ، قطع من خلال محيط الرقبة لفصل الرأس عن جسم الخادرة (الشكل 3G). إزالة الجسم ووضعه في بئر مختلف.
ملاحظة: لا تقطع الرقبة مباشرة من الجانب الظهري / البطني من الخادرة ، مما قد يضغط على الدماغ. - قطع البشرة الشفافة التي تغطي الجانب الظهري من الدماغ (الشكل 3H). هذا سوف يعرض الجسم الدهني فوق الدماغ. احتفظ ببعض البشرة التي ترتبط بها شبكية العين والهوائيات. كرر نفس الإجراء إلى الجانب البطني من الدماغ.
ملاحظة: لا تقم بإدخال شفرة المقص بعمق شديد تحت البشرة لأن هذا سيؤدي إلى قطع أعصاب الهوائي التي تربط الهوائيات والدماغ (الشكل 3H'). - استخدم ماصة P10 لغسل الجسم الدهني الذي يغطي الدماغ والهوائيات بلطف عن طريق سحب الوسط نحو المناطق المفتوحة على الجانبين الظهري والبطني للرأس (الشكل 3I).
ملاحظة: كن لطيفا جدا عند سحب الوسط حيث يمكن بسهولة فصل الدماغ عن البشرة. تأكد من إزالة جميع الدهون في الجسم خلال هذه الخطوة. لوحظ التطور الموقوف لمحاور ORN عندما لم يتم تنظيف الجسم الدهني جيدا ، ربما بسبب ضعف الوصول إلى الأكسجين من الوسط. - لدراسة تفاعل محاور ORN الثنائية أو محاور ORN مع استهداف تغصن PN ، قم بقطع واحد أو اثنين من أعصاب الهوائي مع المقص الدقيق خلال هذه المرحلة8 (الشكل 3J). ضع شفرات المقص بعناية بين البشرة والدماغ وقطع أعصاب الهوائي المهتمة.
- لنقل الإكسبلانت التشريحي إلى صفيحة سيلغارد ، ضع قطرة من الوسط الكامل المؤكسج (~ 200 ميكرولتر) على سطح سيلغارد. قم بتغطية السطح الداخلي لطرف ماصة بطرف عريض 200 ميكرولتر بالجسم الدهني من الجذع المشوه (الخطوة 1.6) عن طريق سحب الجسم الدهني عدة مرات ، مما يمنع explants من الالتصاق بطرف الماصة أثناء النقل. بعد ذلك ، استخدم طرف الماصة العريض هذا لنقل الإكسبلانت من التشريح جيدا إلى القطرة المتوسطة على لوحة الاستزراع (الشكل 3K).
- استخدم الملقط لتثبيت الإكسبلانت على طبقة سيلغارد في الفصين البصريين (الشكل 3L). ضع لوحة سيلغارد بعناية على محطة التصوير وشل حركة اللوحة بأشرطة. أضف ببطء 10 مل من الوسط الكامل المؤكسج إلى لوحة سيلغارد باستخدام ماصة P1000.
ملاحظة: تجنب تعطيل الإكسبلاست عند إضافة الوسط إلى صفيحة سيلغارد.
3. التصوير الحي القائم على المجهر ثنائي الفوتون
- لإجراء تصوير بفاصل زمني ، استخدم مجهرا ثنائي الفوتون ، وليزر Ti:Sapphire ، وهدف غمر الماء 20x (1.0 NA) وبرنامج تصوير. استخدم الطول الموجي للإثارة عند 920 نانومتر لتصوير بروتينات GFP. اضبط وقت سكن البكسل على 10 ميكروثانية.
- اضبط موضع محطة التصوير بحيث تكون المحطات الخارجية تحت الهدف تقريبا. استخدم 70٪ من الإيثانول لتعقيم العدسة قبل التصوير. خفض الهدف ببطء تحت الوسط بالقرب من explants. تحقق مما إذا كان هناك أي فقاعة على عدسة الهدف.
- إذا كان الأمر كذلك ، فارفع الهدف فوق الوسط وكرر ذلك حتى تختفي الفقاعة. ابحث عن البثور باستخدام العدسة وقم بمركز واحد في الحقل.
- لضمان وجود إكسبلانت مع عدد قليل من ORNs التي تحمل علامات متفرقة لتصوير الفاصل الزمني ، قم بتشريح ~ 10 explants في كل مرة ومحاذاة على محور y على لوحة الثقافة. قم بفحص جميع الإكسباسترات عن طريق تحريك الهدف على طول المحور y واختر مزبلة حيث وصل عدد قليل من محاور ORN المفردة للتو إلى فص الهوائي للتصوير (الشكل 4A).
- تعرف على فص الهوائي من خلال شكله البيضاوي ومحاور ORN التي بدأت في الالتفاف حوله. صورة مساحة ~ 150 ميكرومتر × 150 ميكرومتر في المستوى xy (تكبير 3x مع هدف 20x). تقدير حدود فصي الهوائي وتركيزهما في منطقة التصوير.
- حدد منطقة تصوير أولية على طول المحور z عن طريق تحديد القسم السفلي والقسم العلوي من المسح الضوئي. قم بإعداد منطقة التصوير على طول المحور z. اضبط أعمق قسم مع إشارات محورية ORN كأول جلسة تصوير والجلسة 100 ميكرومتر أعلاه (الجانب الأكثر سطحية) كآخر جلسة تصوير (الشكل 4B).
ملاحظة: هذا يترك بعض الأقسام في الأعلى (الجانب السطحي) من محاور ORN ويتجنب نقل محاور ORN إلى أعلى خارج منطقة التصوير بسبب نمو الدماغ أثناء الثقافة.- الصورة على فترات 2 ميكرومتر. اضبط المسح الضوئي التلقائي للتصوير على تردد كل 20 دقيقة باستخدام برنامج التصوير.
- قم بتحويل منطقة التصوير 20 ميكرومتر لأعلى على طول المحور z بعد التصوير الأول لمدة 4 ساعات و 20 ميكرومتر أخرى لأعلى على طول المحور z بعد التصوير لمدة 16 ساعة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق تعيين برنامج نصي ومكدسات z مختلفة في برنامج التصوير.
- استزرع الإكسباج لفترة إضافية بعد التصوير (حتى 24 ساعة خارج الجسم الحي) قبل التثبيت والتلطيخ باستخدام N-cadherin ، وهي علامة عصبية ، للكشف عن الهوية الجينية لكل ORN واحد بواسطة الكبيبات التي يستهدفها.
4. معالجة الصور
- لمعالجة صور z stack من سلسلة الأقسام التي تم التقاطها في كل نقطة زمنية باستخدام برنامج فيجي ، افتح سلسلة أقسام الصور ، انقر فوق Image | مكدسات | مشروع Z [/].
- لتصحيح الانجراف الجانبي للعينة أثناء الثقافة، قم بتثبيت TurboReg Plugin في فيجي.
- افتح سلسلة صور مكدس z وصورة مكدس z واحدة من السلسلة. فتح المكونات الإضافية | | التسجيل توربوريج.
- حدد سلسلة صور مكدس z في المصدر وصورة مكدس z مفردة في الهدف | الترجمة. انقر فوق الزر Batch لتسجيل جميع الصور من سلسلة صور z stack المفتوحة.
- لتحقيق أقصى قدر من الفائدة من العينات المصورة ، افصل المحاور الأحادية ذات التصنيف المتناثر في المنطقة المجاورة لبعضها البعض عن صور z stack التي تتبع أقسام صور 3D.
- لاستخراج محاور ORN واحدة من عدد قليل من المحاور في نفس الصورة ، افتح سلسلة قسم الصورة ، وانقر فوق المكونات الإضافية | | التجزئة محرر التقسيم [/]. حدد أداة الفرشاة وقناع محور ORN المهتم به في نافذة عمل محرر التجزئة باستخدام أزرار تحديد "+" أو "-" في كل قسم صورة.
- انقر على عملية | حاسبة الصور [/]. حدد "Image X" في الصورة 1 ، "ضرب" في العملية ، "Image X. labels" في الصورة 2 ، [/]. يؤدي ذلك إلى إنشاء ملف سلسلة صور جديد باستخدام المحور العصبي المعني فقط. تنفيذ الخطوة 4.1 لمعالجة صورة مكدس z. كرر هذه الخطوة لجميع النقاط الزمنية لإنشاء ملف صورة سلسلة زمنية.
- لتلوين محاور مختلفة زائفة من نفس الصورة، قم أولا بتنفيذ الخطوة 4.3 لإنشاء ملف صورة السلسلة الزمنية لكل محور عصبي على حدة. افتح ملفات صور السلاسل الزمنية لمحاور عصبية مفردة مختلفة من نفس صورة البيانات الأولية. انقر على صورة | | الألوان دمج القنوات. حدد ملفات صور السلاسل الزمنية المختلفة في قنوات ألوان مختلفة وانقر فوق موافق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصل محاور ORN إلى الفص الهوائي بين 18 ساعة و 36 ساعة APF. ثم يتنقلون في فص الهوائي ، ويعبرون خط الوسط ، ويعصب الكبيبات. الفيديو 1 هو فيديو تمثيلي يعرض العملية بأكملها لعدة محاور يمكن التعرف عليها بشكل فردي ، يتم التقاطها بتردد كل 20 دقيقة لمدة 24 ساعة. قبل التسجيل باستخدام TurboReg ، تظهر المحاور العصبية بعض الانجراف الجانبي مع تطور الدماغ (النصف الأول من الفيديو). بعد التسجيل ، يتم تصحيح الانجراف (النصف الثاني من الفيديو).
لفصل عدد قليل من محاور ORN عن نفس الإكسبلان، يظهر مثال واحد في الشكل 5. باتباع الإجراء الوارد في الخطوة 4.3 ، تم استخراج محاور VA1d و VA1v من explant الموضحة في الشكل 5A لإنشاء صورة مكدس z جديدة مع هذين المحورين فقط (الشكل 5B). وبالمثل ، تم استخراج محاور VM2 و VM3 (الشكل 5B) ومحور DL2 (الشكل 5B'). يوضح الشكل 5C دمج الصور في الشكل 5B-B '' مع الألوان الزائفة. تم الكشف عن الهويات الجينية لكل محاور ORN عن طريق التلطيخ المناعي لعلامة عصبية N-cadherin للإكسبلان الثابت (الشكل 5D ، E).
الشكل 1: هيكل الدائرة الشمية الذبابة. (أ) يظهر رأس ذبابة بالغ مع ORN واحد من الهوائيات اليمنى (الخضراء) يرسل محوره إلى كل من فصوص الهوائي (ALs) في الدماغ ويشكل اتصالا متشابكا في كبيبات محددة مع تشعبات PNs (حمراء) في ALs الجانبي والمقابل. يشير الخط الرأسي المتقطع إلى خط الوسط في هذا المخطط والرسوم البيانية والصور اللاحقة. (ب) رسم بياني يوضح تطور الدائرة الشمية. (1) تقوم التشعبات PN أولا بتعصيب منطقة في فص الهوائي (أحمر). تصل محاور ORN إلى فصوص الهوائي في الدماغ. (2) تأخذ محاور ORN إما مسارا ظهريا جانبيا (أخضر) أو بطنيا (أزرق) للالتفاف حول فص الهوائي. (3) محاور ORN تعبر خط الوسط. (4) محاور ORN تعصب الكبيبات في الفص الهوائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد غرفة التصوير للمزخرف. (أ) ضع طبقة من مطاط السيليكون الصناعي (~ 0.5 سم) في الجزء السفلي من طبق بتري 60 مم. (ب-ب') قم بمحاذاة المسامير على شريط وقطعها إلى ~ 2 مم باستخدام زوج من المقصات. (ج) تثبيت المسامير الدقيقة على طبقة المطاط الصناعي السيليكوني في لوحة الثقافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إجراء تشريح الهوائيات الدماغية explant. (أ) قم بتوصيل الجانب البطني من خادرة مجففة بالمناديل الورقية على شريط على الوجهين على شريحة زجاجية. (ب-ج) استخدم الملقط لقطع البشرة البنية الخارجية لفضح الخادرة في الداخل. (د) نقل الخادرة إلى بئر تشريح مع وسط كامل مؤكسج. (ه-ز) افصل بعناية جذع العذراء عن الرأس باستخدام مقص دقيق. (ح) قطع قطع البشرة شبه الشفافة التي تغطي الجانبين الظهري والبطني للدماغ. احتفظ ببعض البشرة على الجانبين الأمامي والجانبي للدماغ للاحتفاظ بالروابط بين شبكية العين والهوائيات والدماغ. (ح') تجنب قطع العصب الهوائي أثناء هذه الخطوة. (I) تنظيف الجسم الدهني الذي يغطي الدماغ عن طريق السحب بلطف. (ي) قطع واحد أو اثنين من أعصاب الهوائيات باستخدام مقص مجهري في تجارب معينة. (K) ضع قطرة من الوسط الكامل المؤكسج على سطح صفيحة الاستزراع. انقل الإكسبلانت التشريحي باستخدام طرف ماصة عريض. (L) استخدم الملقط لتثبيت الفصين البصريين للإكسبلاشن على طبقة المطاط الصناعي السيليكوني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصوير بفاصل زمني لمحور عصبي ORN واحد يستهدف من منفاخ خارجي . (أ) حدد مزبلة مع عدد قليل من محاور ORN التي تصل للتو إلى فص الهوائي. تقدير شكل اثنين من فصوص الهوائي عن طريق انحناء المحاور العصبية وتوسيط فصوص الهوائي في مجال التصوير. (ب) اضبط منطقة التصوير على طول المحور z. ضع في اعتبارك أن الفص الهوائي سوف يتحول إلى أعلى مع نمو الدماغ وتطوره. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: استخراج ORNs واحدة والكشف عن هوياتها الكبيبي. (أ) صورة إسقاط قصوى لمصنع خارجي مع 5-10 محاور ORN مفردة باستخدام مجهر ثنائي الفوتون مع هدف 20x وتكبير 3x. (B-B'') يتم استخراج 1-2 محاور أحادية من (A) عن طريق إنشاء أقنعة يدويا في أقسام الصورة من بيانات الصورة الخام. (ج) دمج صور (B-B'') مع كل محور عصبي زائف اللون بشكل مختلف. (D-D') الحد الأقصى للصور متحدة البؤرة للإسقاط التي تم التقاطها باستخدام هدف 40x وتكبير/تصغير بمعدل 1.5 مرة. تم إصلاح الإكسبلانت الموضح في (أ) متبوعا بالتلطيخ بمضاد GFP ومضاد N-cadherin (علامة neuropil). يتم تكديس النصفين الأمامي والخلفي لفصوص الهوائي بشكل منفصل في (D) و (D'). (ه) تظهر خريطة الفص الهوائي محاور ORN المستخرجة في (B,C). تم تعديل بعض الصور الموضحة في هذا الشكل من دراسة سابقة8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيديو 1: تظهر الصور ذات الفاصل الزمني القائمة على الفحص المجهري ثنائي الفوتون استهداف محورين عصبيين من ORN ، قبل وبعد تسجيل الصورة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحتفظ هوائيات ذبابة الفاكهة - الدماغ explant بالاستهداف الطبيعي للدائرة الشمية. لقد لاحظنا أن التطور أبطأ 2 مرات خارج الجسم الحي مقارنة بالجسم الحي. ويلاحظ أن نظام explant لا يحتفظ بالجس الفكي العلوي ، الذي يستضيف ستة أنواع من ORNs. لضمان تلخيص التطور الطبيعي خارج الجسم الحي ، يجب تجنب تمدد أعصاب الهوائي أثناء تشريح الزرع. خلال زراعة خارج الجسم الحي ، عادة ما يسبب نمو البكتيريا الموقوف للدائرة الشمية. لذلك ، من المهم التعقيم الشامل لطبق الثقافة والدبابيس قبل التصوير والحفاظ على غرفة التصوير نظيفة ومعزولة.
يدعم هذا الإكسبلانت التصوير المجهري طويل الأجل القائم على الفوتونين بفاصل زمني. جنبا إلى جنب مع مراسل تم تطويره حديثا لوضع علامات متفرقة على ORNs المفردة ، يسمح نظام explant بتصوير عالي الدقة من محطة محورية واحدة. هذا النظام قوي لدراسة الآليات البيولوجية للخلية التي تدعم العملية الديناميكية لتجميع الدوائر الشمية8. على الرغم من أن تطور الدائرة الشمية قد تم عرضه هنا كمثال ، إلا أنه يمكن توسيع هذا النظام ليشمل دراسات الدوائر الأخرى أو العمليات التنموية الأخرى في الدماغ المركزي النامي.
يحافظ الإكسبلانت على التطور الطبيعي في الثقافة لمدة 24 ساعة على الأقل ، والتي يمكنها التقاط العملية الكاملة لاستهداف ORN. وهي تمكن الباحثين من الكشف عن الهوية الجينية لمحاور ORN المفردة من خلال التلطيخ المضاد بعلامة عصبية بعد التثبيت ، حيث أن الفص الهوائي يطور بالفعل بنية كبيبية واضحة بحلول نهاية الثقافة. تتحايل هذه الاستراتيجية على مشكلة الافتقار إلى محركات جينية محددة للعديد من أنواع ORN في مرحلة مبكرة من التطور لتحقيق تصوير لأنواع محددة من ORNs باستخدام برنامج تشغيل عموم ORN.
ولتحقيق دقة مكانية زمانية أعلى، يمكن تصوير هذا النظام الخارجي باستخدام مجهر أكثر تقدما، وهو المجهر الضوئي الشبكي التكيفي (AO-LLSM). وقد تبين أن AO-LLSM يتيح تصور الهياكل الدقيقة للمحطات الطرفية للمحور العصبي وتردد المسح الضوئي في كل 30 ثانية لكل وحدة تخزين8،9،10،11. تتمثل إحدى مزايا الإكسبلانت في توافقه مع صبغة جانيليا فلوروفور 12،13،14 عن طريق احتضان الإكسبلانت الذي يعبر عن علامة هالو في خلايا عصبية محددة مع أصباغ في الوسط قبل التصوير. وقد لوحظ أن احتضان الإكسبلانت بوسط يحتوي على صبغة يؤدي إلى وضع علامات أقوى بكثير من تغذية اليرقات بالصبغة. سمحت لنا هذه الميزة الفريدة بتصوير المحاور العصبية في مرحلة مبكرة من التطور بالكاد تم تصورها بواسطة تصنيف GFP8.
بالإضافة إلى التصوير بالفاصل الزمني ، يتمتع نظام explant بمزايا أخرى. على سبيل المثال ، من الممكن فصل أعصاب الهوائي عن الزرع التشريحي من جانب واحد أو ثنائي في نقاط زمنية محددة للتطور (الخطوة 2.8). هذا يسمح للباحثين بالتحقيق في متطلبات محاور ORN في استهداف أي أنواع من الخلايا العصبية في الدائرة الشمية في خطوات تنموية متميزة. وعلى وجه الخصوص، أدت مقايسات قطع الأعصاب الهوائية من جانب واحد، والتي لا يمكن تحقيقها عن طريق التلاعب الجيني التقليدي، إلى اكتشاف مثير للاهتمام مفاده أن التفاعل بين محاور ORN الثنائية مطلوب للاستهداف المعاكس الصحيح لمحاور ORN8. علاوة على ذلك ، يتم استزراع الإكسب مباشرة في الوسط بدلا من تضمينه في الأغاروز ، مما يسمح بالتسليم السريع والغسل من بعض الجزيئات الصغيرة أو الأدوية. بالمقارنة مع التلاعب الجيني ، فإن العلاج بالعقاقير له مزايا التأثير السريع وعكس التلاعب. وهو يمكن الباحثين من تقييم بعض العمليات الأساسية للخلايا في مراحل النمو اللاحقة عن طريق تجاوز فتك الخلايا أو القضايا غير الصحية بسبب الاضطراب التأسيسي من خلال التلاعب الجيني. كما أنه يساعد على تصور التغييرات الطفيفة من خلال المقارنة قبل وبعد العلاج من تعاطي المخدرات ، وبعد غسل المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر ن. أوزيل و ر. هيسنجر على مشورتهما بشأن ثقافة الإكسبلان. M. فاغنر للمساعدة التقنية من المجهر ثنائي الفوتون. D.J. Luginbuhl لتوليد الذباب المعدلة وراثيا ؛ د. فريدمان للحصول على اقتراحات بشأن تحليل برمجيات فيجي؛ Y. Ge للمساعدة في العمل على الطاير ؛ C. McLaughlin و K.K.L. WONG للتعليق على المخطوطة. ل. ل. هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 1K99DC01883001 (إلى T.L.) و R01-DC005982 (إلى L.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
