Summary
该协议描述了用于研究嗅路组装的触角脑外植体系统的解剖程序，培养条件和现场成像。
Abstract
~神经元精确地相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的回路。 果蝇 嗅觉系统为研究这一过程提供了一个极好的模型，因为来自触角和上颌触缘的50种类型的嗅觉受体神经元（ORN）将其轴突投射到触角叶中的50个可识别的肾小球，并与来自50种类型的二阶投射神经元（PNs）的树突形成突触连接。以前的研究主要集中在识别使用固定组织调节嗅觉回路中精确靶向的重要分子。在这里，描述了一种触角 - 脑外植体系统，该系统概括了培养物中嗅觉回路组装的关键发育里程碑。通过解剖外部角质层并清洁覆盖发育中的蛹脑的不透明脂肪体，可以使用双光子显微镜收集来自活脑的单个神经元的高质量图像。这允许对来自活组织的单个ORN轴突靶向进行延时成像。这种方法将有助于揭示先前确定的重要基因的重要细胞生物学背景和功能，并确定支撑电路组装动态过程的机制。
Introduction
神经元精确地相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的回路。100多年来，神经科学家一直试图以极高的精度了解神经突起如何向中间和最终目标延伸。因此，他们已经确定了编码神经元过程1的引导线索的重要基因。 果蝇 嗅觉系统为研究这一过程提供了一个极好的模型，因为嗅觉受体神经元（ORN，初级感觉神经元）投射到50个具有典型大小，形状和相对位置的可识别肾小球，其中它们与来自50种类型的二阶投影神经元（PNs）的树突形成突触连接，每个树突将树突发送到50个肾小球2 中的一个（图1A).因此，在苍蝇嗅觉系统中以突触（肾小球）分辨率鉴定突变表型相对容易。这导致了调节嗅觉回路组装的重要基因的发现3。
苍蝇嗅觉回路的组装依赖于时间和空间协调的发展过程3.ORN和PN获得不同的细胞命运，这为其布线特异性设置了程序。接下来，PN树突预涂了触角叶（图1B）。然后，ORN的轴突环绕同侧触角叶并穿过大脑的中线到达对侧触角叶。随后，ORN轴突侵入ipsi和对侧触角叶，并在特定肾小球中与其伴侣PN的树突形成突触。该嗅觉电路组装的粗略模型是基于在开发过程中从中间时间点表征固定样品而提出的。时间分辨率差，无法从固定组织发育过程中遵循相同的神经元过程，这限制了对电路组装过程的机制理解。
在体内实时成像ORN和PN过程在技术上具有挑战性，因为布线过程发生在蛹阶段的前半部分，当触角叶被蛹壳内不透明的脂肪体包围时。因此，不可能从完整的蛹直接成像发育中的嗅觉回路。离体培养的解剖组织可以规避组织混浊度，并已成功用于研究神经发育4，5，6。使用类似的离体外植体培养策略来研究蛹脑中的神经元布线的挑战在于它是否概括了培养条件下精确的神经元靶向。根据先前报道的苍蝇眼脑复合物7的离体培养条件，最近开发了一种包含整个蛹脑，触角和连接触角神经完整的外植体，其保留了嗅觉回路的精确靶向，并且可以以每20分钟的频率进行基于双光子显微镜的实时成像长达24小时8.在这里，描述了外植体培养和成像的详细方案。外植体系统为研究嗅觉回路和中枢大脑中潜在其他回路的组装提供了一种强大的方法。
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Protocol
1. 试剂的制备
注意：除非另有说明，否则本协议中的所有步骤均在室温（20-25°C）下进行。
- 为了准备培养皿用于在延时成像期间固定外植体，在60mm x 15mm培养皿的底面上放置0.5cm厚的Sylgard（使用前以10：1的比例彻底混合两种液体组分），并使其在室温下固化48小时（图2A，在下面的文本中称为Sylgard板）。
- 要准备用于固定该板上外植体的微针，请使用一对镊子将多个微针钉粘在胶带上，尖端在一侧对齐（图2B）。使用一把剪刀从微型针的尖锐端切割约2毫米（图2B'）。使用镊子固定切割的微型引脚，并插入预制Sylgard板的Sylgard层（图2C）。两个微型针用于固定一个外植体。
- 使用刷子收集白色蛹，其在hsFLP，鹅卵石-GAL4 / +的1小时内形成蛹;UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 基因型并将其转移到新的小瓶中。在37°C水浴中热冲击40分钟，以诱导随机类型的稀疏ORN克隆。热休克后，将小瓶置于25°C下30小时，导致蛹形成（APF）后30小时老化。
- 为了制备用于外植体的培养基，向500 mL施耐德 果蝇 培养基中加入5 mL青霉素 - 链霉素（10，000 U / mL）。过滤培养基，在50 mL锥形管中制成45 mL等分试样。培养基可以在4°C下储存1-2个月。
- 在成像当天，取一管45mL施耐德 果蝇 培养基，加入5mL胎牛血清（10%v / v），125μL4mg / mL人胰岛素储备溶液（10μg / mL终浓度），50μL1mg / mL 20-羟基依清酮储备溶液溶解在乙醇中（1μg / mL最终浓度）。充分混合并将 15 mL 全培养基转移到新的 50 mL 锥形管中。其余完整的培养基可以在4°C下储存一周。将胎牛血清，人胰岛素储备溶液和20-羟基依微酮储备溶液等分并储存在-20°C。
- 通过无菌的5 mL移液器吸头以一个气泡/ s的速度从液体表面下的氧气瓶泵送氧气气泡，为15 mL全培养基充氧20-30分钟。在此过程中，使用石蜡膜覆盖管的开口。
- 用70%乙醇灭菌解剖孔表面和Sylgard板（在Sylgard层上插入微针，在步骤A1和A2中制备）。使用前让它们干燥。
2. 外植体解剖
- 使用刷子将30小时APF（蛹形成后30小时）蛹转移到纸巾上，并将蛹的外表面干燥5分钟。
- 将一块双面胶带放在载玻片上。小心地将干燥的蛹贴在胶带的粘性表面上，背侧朝上。用刷子轻轻按压蛹，以帮助蛹的腹侧很好地附着在胶带上（图3A）。不要损坏蛹。
- 使用一对镊子取下覆盖头部背侧的棕色蛹壳（图3A，B）。从侧面插入棕色蛹壳和蛹之间的一个尖锐的镊子尖端，并通过一条线小心地打破棕色蛹壳到蛹的后端（图3B，C）。打开棕色蛹壳。使用一对镊子轻轻握住蛹，并用1 mL含氧全培养基转移到解剖孔中。将漂浮在介质表面上的蛹淹没，以帮助其下沉到井的底部（图3D）。
注意：不要将镊子尖端太深地插入棕色蛹壳内，以防止用镊子伤害蛹。 - 要从蛹中解剖触角脑外植体，使用镊子用一只手轻轻握住蛹，并用另一只手从蛹的后侧切开一个小孔（图3E）。这个小孔释放了蛹内部的高压。
- 用微剪刀从孔中穿过蛹的腹侧中线，直到颈部（连接头部和胸部的狭窄结构）（图3F）。然后，切开颈部的圆周，将头部与蛹的身体分离（图3G）。取出身体并将其放入不同的孔中。
注意：不要直接从蛹的背侧/腹侧切开颈部，这可能会挤压大脑。 - 切开覆盖大脑背侧的透明角质层（图3H）。这将暴露大脑顶部的脂肪身体。保留一些视网膜和触角附着的角质层。对大脑的腹侧重复相同的过程。
注意：不要将剪刀的刀片插入角质层下方太深，因为这会导致连接触角和大脑的触角神经断裂（图3H'）。 - 使用P10移液器将培养基移液到头部背侧和腹侧的开放区域，轻轻地冲洗掉覆盖大脑和触角的脂肪体（图3I）。
注意：移液培养基时要非常温和，因为大脑很容易从角质层上脱落。确保在此步骤中去除所有脂肪。当脂肪身体没有得到很好的清洁时，观察到ORN轴突的发育停滞，可能是由于从培养基中获取氧气不良。 - 为了研究双侧ORN轴突或ORN轴突与PN树突靶向的相互作用，在此阶段8 期间切断一个或两个触角神经与微剪刀（图3J）。小心地将剪刀的刀片放在角质层和大脑之间，切断感兴趣的触角神经。
- 要将解剖的外植体转移到Sylgard板上，在Sylgard表面上放置一滴含氧全介质（〜200μL）。通过多次移液脂肪体，用解剖躯干中的脂肪体（步骤1.6）涂覆200μL宽的吸头吸头的内表面，这可以防止外植体在转移过程中粘附移液器吸头。然后，使用这种宽吸头移液器吸头将外植体从解剖孔转移到培养板上的培养基液滴（图3K）。
- 使用镊子将外植体固定在两个光学波瓣的Sylgard层上（图3L）。小心地将Sylgard板放置在成像站上，并用胶带固定板。使用P1000移液器将10 mL含氧全培养基缓慢加入Sylgard板中。
注意：在将培养基添加到Sylgard板时，避免破坏外植体。
3. 基于双光子显微镜的实时成像
- 要执行延时成像，请使用双光子显微镜，Ti：Sapphire激光器，20倍水浸物镜（1.0 NA）和成像软件。使用920nm处的激发波长对GFP蛋白进行成像。将像素停留时间调整为10 μs。
- 调整成像站位置，使外植体大致位于物镜下方。成像前使用70%乙醇对镜片进行灭菌。在靠近外植体的培养基下缓慢降低物镜。检查物镜上是否有气泡。
- 如果是这样，将物镜抬到培养基上方并重复此操作，直到气泡消失。使用目镜找到外植体，并在现场居中放置一个外植体。
- 为了确保具有稀疏标记用于延时成像的少量ORN的外植体，每次解剖约10个外植体，并在培养板上的y轴上对齐。通过沿y轴移动物镜来筛选所有外植体，并选择一个外植体，其中几个单个ORN轴突刚刚到达天线瓣进行成像（图4A）。
- 通过其椭圆形形状和开始环绕它的ORN轴突来识别触角瓣瓣。在 xy 平面上对 ~150 μm x 150 μm 的区域进行成像（使用 20 倍物镜进行 3 倍变焦）。估计两个触角波瓣的边界，并将它们居中于成像区域。
- 通过定义扫描的底部和顶部，沿 z 轴选择初始成像区域。沿 z 轴设置成像区域。将具有ORN轴突信号的最深部分设置为第一个成像会话，将100μm以上的会话（更浅的一侧）设置为最后一个成像会话（图4B）。
注意：这会在ORN轴突的顶部（浅表侧）留下一些部分，并避免由于培养过程中大脑的生长而使ORN轴突向上移动到成像区域之外。- 以2μm间隔成像。使用成像软件以每20分钟的频率设置自动成像扫描。
- 在第一次4小时成像后，沿z轴向上移动成像区域20μm，在16小时成像后沿z轴向上移动20μm。这可以通过在成像软件中设置脚本和不同的 z 堆栈来实现。
- 在固定和用N-钙粘蛋白（一种神经疖痕标记 物）染色之前，在成像后（高达24小时）培养外植体，以通过其靶向的肾小球揭示每个ORN的遗传身份。
4. 图像处理
- 要使用斐济软件处理在每个时间点拍摄的截面系列中的z堆栈图像，请打开图像截面系列，单击 图像|堆栈|Z 项目 [/]。
- 要纠正培养过程中样品的横向漂移，请在斐济安装 TurboReg插件 。
- 从该系列中打开 z 堆栈图像系列和单个 z 堆栈图像。打开插件|报名|涡轮注册
- 在 “源 ”中选择 z 堆栈图像系列，在 “目标”中选择单个 z 堆栈图像|翻译。单击 Batch 按钮以 注册打开的 z 堆栈图像系列中的所有图像。
- 为了最大限度地发挥成像样品的效用，将附近稀疏标记的单轴突与3D图像部分后面的z堆栈图像分开。
- 要从同一图像中的几个轴突中提取单个ORN轴突，请打开图像部分系列，单击插件|市场细分|分段编辑器 [/]。在每个图像部分上使用“选择”+“或”-“按钮，在分割编辑器工作窗口中选择画笔工具并遮罩感兴趣的ORN轴突。
- 单击“ 进程|图像计算器 [/]。在 图像 1 中选择“图像 X”，在 操作中选择“乘法”，在图像 2 中选择“图像 X.标签” ，[/]。这将生成一个仅包含感兴趣的轴突的新图像系列文件。执行步骤 4.1 处理 z 堆栈映像。对所有时间点重复此步骤以生成时间序列图像文件。
- 要对来自同一图像的不同轴突进行伪色，请首先执行步骤4.3以分别生成每个轴突的时间序列图像文件。从同一原始数据图像中打开不同单个轴突的时间序列图像文件。点击 图片|颜色|合并通道。选择不同颜色通道中的不同时间序列图像文件，然后单击 确定。
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Representative Results
ORN轴突在18小时至36小时APF之间到达触角叶。然后，它们在触角叶上导航，穿过中线，并支配肾小球。 视频1 是一个具有代表性的视频，显示了几个可单独识别的轴突的整个过程，以每20分钟的频率拍摄24小时。在使用TurboReg注册之前，随着大脑的发育，轴突表现出一些横向漂移（视频的前半部分）。配准后，漂移被校正（视频的后半部分）。
为了从同一外植体中分离几个ORN轴突， 图5显示了一个示例。按照步骤4.3中的过程，从 图5A 所示的外植体中提取VA1d和VA1v轴突，以生成仅具有这两个轴突的新z轴图像（图5B）。同样，提取了VM2和VM3轴突（图5B'）和DL2轴突（图5B''）。 图5C 显示了 图5B-B'' 中图像与伪彩色的合并。通过对固定外植体的神经疝标记物N-钙粘蛋白进行免疫染色，揭示了每个ORN轴突的遗传身份（图5D，E）。
图1：苍蝇嗅觉回路的结构。 （A）显示成年蝇头上有一个来自右触角（绿色）的ORN，将其轴突发送到大脑中的两个触角叶（ALs），并在同侧和对侧AL中与PN的树突（红色）形成特定肾小球中的突触连接。虚线垂直线表示此图和后续图表和图像中的中线。（二）显示嗅觉回路发育的示意图。（1）PN树突首先支配触角叶（红色）的一个区域。ORN轴突到达大脑中的触角叶。（2）ORN轴突采取背外侧（绿色）或腹内侧（蓝色）轨迹来环绕触角叶。（3） ORN轴突穿过中线。（4）ORN轴突支配触角叶中的肾小球。 请点击此处查看此图的大图。
图2：为外植体准备成像室（A）在60mm培养皿的底部铺上一层有机硅弹性体（〜0.5厘米）。（B-B'）将针脚对准胶带，并使用一把剪刀切割成约2毫米长。（C）将微针固定在培养板的硅胶弹性体层上。请点击此处查看此图的大图。
图3：触角脑外植体的解剖程序（A）将纸巾干燥的蛹的腹侧附在载玻片上的双面胶带上。（B-C）使用镊子切开外部棕色角质层，露出内部的蛹。（D）将蛹转移到具有含氧全介质的解剖井中。（E-G）使用微剪刀小心地将蛹干与头部分开。（H）切开覆盖大脑背侧和腹侧的半透明角质层。在大脑的前侧和侧保留一些角质层，以保持视网膜，触角和大脑之间的连接。（H'）避免在此步骤中切断触角神经。（I）轻轻移液清洁覆盖大脑的脂肪体。（J）在某些实验中使用微剪刀切断一个或两个触角神经。（K）将一滴含氧的全介质放在培养板的表面。使用宽吸头移液器吸头转移解剖的外植体。（L）使用镊子将外植体的两个光学瓣固定在有机硅弹性体层上。请点击此处查看此图的大图。
图4：从外植体靶向单个ORN轴突的延时成像 （A）选择具有几个ORN轴突刚好到达触角叶的外植体。通过轴突的曲率估计两个触角波瓣的形状，并将触角瓣在成像场中居中。（B） 沿 z 轴设置成像区域。考虑到触角叶会随着大脑的生长和发育而向上移动。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：提取单个 ORN 并揭示其肾小球身份。 （A）使用具有20倍物镜和3倍放大的双光子显微镜，具有5-10个单ORN轴突的外植体的最大投影图像。（C）将（B-B''）的图像与每个轴突的伪颜色合并不同。（D-D'）使用40倍物镜和1.5倍变焦拍摄的最大投影共聚焦图像。（A）中所示的外植体被固定，然后用抗GFP和抗N-钙粘蛋白（神经疙瘩标记物）染色。触角叶的前半部分和后半部分分别堆叠在（D）和（D'）中。（E）触角叶图显示了（B，C）中提取的ORN轴突。此图中显示的一些图像是从先前的研究8修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
视频1：基于双光子显微镜的延时图像显示图像配准之前和之后两个ORN轴突的瞄准。请点击此处下载此视频。
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Discussion
果蝇触角-脑外植体保持嗅觉回路的正常靶向。我们确实注意到，与体内相比，离体发育慢2倍。值得注意的是，外植体系统不保留上颌触诊，上颌触诊具有六种类型的ORN。为确保体外恢复正常发育，在外植体解剖期间需要避免触角神经的拉伸。在离体培养过程中，细菌生长通常会导致嗅路发育停滞。因此，在成像之前对培养皿和针进行彻底灭菌并保持成像室的清洁和隔离非常重要。
该外植体支持基于长期双光子显微镜的延时成像。结合新开发的用于单个ORN稀疏标记的报告器，外植体系统允许从单个轴突末端进行高分辨率成像。该系统对于研究支撑嗅觉回路组装8动态过程的细胞生物学机制是强大的。虽然嗅觉回路发育在这里显示为一个例子，但该系统可以潜在地扩展到研究发育中的中央大脑中的其他回路或其他发育过程。
外植体在培养物中保持正常发育至少24小时，这可以捕获ORN靶向的整个过程。它使研究人员能够通过固定后用神经疝标记物进行反染色来揭示单个ORN轴突的遗传身份，因为触角叶在培养结束时已经发展出明显的肾小球结构。该策略避免了在早期发育阶段许多ORN类型缺乏特定遗传驱动因素的问题，以使用pan-ORN驱动器实现特定类型ORN的成像。
为了实现更高的时空分辨率，该外植体系统可以使用更先进的显微镜，自适应光学晶格光片显微镜（AO-LLSM）进行成像。已经表明，AO-LLSM能够以每卷8，9，10，11每卷每30秒的速度可视化轴突端子和扫描频率的精细结构。外植体的一个优点是它与Janelia荧光团染料12，13，14标记的相容性，方法是在成像前将表达Halo标签的外植体在特定神经元中用染料孵育。值得注意的是，用含染料的培养基孵育外植体比用染料喂养幼虫产生更强的标记。这种独特的优势使我们能够在早期发育阶段对轴突进行成像，而GFP标记8几乎无法可视化。
除了延时成像外，外植体系统还具有其他优点。例如，可以在特定的发育时间点单侧或双侧切断解剖外植体的触角神经（步骤2.8）。这使得研究人员能够探索ORN轴突在不同发育步骤中靶向嗅路中任何神经元类型时的需求。特别是单侧触角神经切断测定，这是传统遗传操作无法实现的，这导致了一个有趣的发现，即双侧ORN轴突之间的相互作用是ORN轴突的正确对侧靶向8所必需的。此外，外植体直接在培养基中培养，而不是嵌入琼脂糖中，因此可以快速输送并洗掉一些小分子或药物。与基因操作相比，药物治疗具有操作效果快、可逆等优点。它使研究人员能够通过绕过细胞致死性或由于遗传操作的本构破坏而导致的不健康问题来评估细胞在后期发育阶段的一些基本过程。它还有助于通过比较药物治疗前后以及药物冲洗后来可视化细微变化。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢N. Özel和R. Hiesinger对外植体文化的建议;M. Wagner为双光子显微镜提供技术帮助;D.J. Luginbuhl用于产生转基因苍蝇;D. 弗里德曼对斐济软件分析提出建议;Y. Ge协助飞行工作;C. McLaughlin和K.K.L. Wong对手稿的评论。L.L.是霍华德休斯医学研究所的研究员。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款1K99DC01883001（到T.L.）和R01-DC005982（到L.L.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
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